JP4800032B2 - 実質的に球形の代謝粒子の個々の代謝速度の非−侵入的測定のためのデバイスおよび方法 - Google Patents
実質的に球形の代謝粒子の個々の代謝速度の非−侵入的測定のためのデバイスおよび方法 Download PDFInfo
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Description
−個々の胚/卵母細胞を測定するための感度および分解能。
−迅速な見積もり(約30分以下)
−生存率テストは乱さないものでなければならず、理想的には非−侵入的でなければならない。
−技術的に単純で使いやすいこと。
−余裕があること。
Hogan MC Phosphrescence quenching method for measurement of intracellular PO2 in isolated skeletal muscle fibers. J Appl Physiol.1999 Feb;86(2):720−4 Trettnak W,Kolle C,Reininger F,Dolezal C,O‘Leary P,Binot RA.Optical ogygen scensor instrumentation based on the detection of luminescence lifetime. Adv Space Res.1998;22(10):1465−74 Gewhr PM,DelpyDT.Optical oxyegen sensor based on phosphorescence lifetime quenching and instrumentation. Med Biol Eng Comput. 1993 Jan;31(1):2−10. Klimant,L,Meyer,V.,KHl,M.1995.Fiber−optic oxygen microsensors, an new tool in aquatic biology Limnology and Oceanography, 40(6)1159−1165 Glud,R.N.,Ramsing,N.B.,Gundersen,J.K.,and Klimant,I.(1996). Planar optrodes,microbial communities. Marine Ecology Progress. Series 140:217−226. RN Glud,JK Gundersen,NB Ramsing (2000) Electrochemical and optical oxygen microsensors for in situ measurements, In in situ monitoring of aquatic systems: Chemical analysis and speciation. John Wiley & Sons Ltd(eds J Buffle & G Horvai). Chapter 2:19−73
a)拡散バリアーによって規定され、かつ実質的に球形の代謝粒子を含む培地を含むことができ、該拡散バリアーは拡散によって実質的に球形の代謝粒子への、および/または該代謝粒子からの代謝産物移送を可能とし、それにより、代謝産物拡散勾配が、実質的に球形な代謝粒子から、および培地を通じて確立されることが可能な、少なくとも1つの区画と、
b)区画内部の代謝産物の濃度を測定するための少なくとも1つの検出器と、を備えたデバイスに関する。
a)前記定義の少なくとも1つのデバイスを設け、
b)区画の培地中に実質的に球形の代謝粒子を配置し、
c)区画内部の代謝産物濃度を測定して、代謝産物濃度の尺度を得、
d)該代謝産物濃度の尺度を、該実質的に球形の代謝粒子の代謝速度に相関させる、ことを特徴とする。
a)培地を含む区画を備えた少なくとも1つのデバイスを設け、
b)区画の培地中で実質的に球形の代謝粒子を培養し、所望により、
c)該区画の内部の代謝産物濃度を測定して、代謝産物尺度を得、所望により
d)該代謝産物濃度尺度を該実質的に球形の代謝粒子の代謝速度に相関させ、所望により、
e)代謝産物濃度尺度および/または該実質的に球形の代謝粒子の代謝速度に応じて代謝産物供給を調節する、ことを特徴とする。
a)培養の間に胚の代謝速度を少なくても一回測定し、
b)最適代謝速度を有する胚を選択する、ことを特徴とする。
a)前記定義の少なくても1つのデバイスを設け、
b)区画の培地中で代謝粒子を培養し、
c)培養期間の少なくても一部の間に、培地への代謝産物供給を低下させ、
d)代謝産物供給が低下された後、区画内部の代謝産物濃度を測定して、代謝産物濃度尺度を得、
e)該代謝産物濃度尺度を、該実質的に球形の代謝粒子の代謝速度に相関させる、ことを特徴とする。
a)培地を含む区画を備えた少なくとも1つのデバイスを設け、
b)区画の培地中で実質的に球形の代謝粒子を培養し、次に、所望により、
c)該実質的に球形の代謝粒子への、および/または、代謝粒子からの代謝産物供給を調節する、ことを特徴とする。
図1は本発明による、底に酸素検出器を持つ拡散区画の第一の実施形態の断面である。理論定常状態酸素勾配を図面の隣のグラフに示す。浸透性拡散バリヤーは、この場合、培地の淀んだ本体である。図2は第一の実施形態の内部横方向寸法を調整するための、図1による実施形態におけるインサートを持つ区画の断面である。図3は調整可能な底を持つ拡散区画を含む本発明のもう1つの実施形態の断面である。図4は円筒拡散区画内部で測定された定常状態酸素勾配の例であり、ここに、胚は底で培養される。図4における勾配の直線部分は、図1における理論グラフ中の線の実線部分のセクションに対応する。x−軸の単位はhPaであって、y−軸の単位はμmである。勾配に対する区画(X.7)の開口の位置は垂直線でマークする。
電流酸素センサー: 内部参照に対して分極された金陰極を持つクラークタイプの電気化学的センサーであり、ここに、酸素は陰極表面で還元される。電流メーターは得られた還元電流を信号に変換する。
本発明によって測定された代謝産物は、実質的に球形の代謝粒子によって摂取された、あるいは該粒子から放出された関連するいずれの代謝産物でもあり得る。代謝産物の例は定義下前記した通りである。1つの実施形態において、代謝産物は後記するいくつかの方法によって検出することができる酸素のようなガスであり、あるいは代謝産物は、その測定方法をやはり後に述べる二酸化炭素である。
前記したように、本発明は、すなわち、実質的に球形の代謝粒子の周りの物理的条件が、少なくても、代謝速度を測定するのに関連する時間の間に、拡散勾配が確立されるのを可能にするという、測定すべき代謝産物についての拡散勾配の確立に基づく。
淀んだ培地の重要性は、胚の呼吸速度に関連して説明することができる:胚が区画内部の淀んだ培地中にあれば、胚に近い酸素分圧は、胚の酸素消費のため、区画外部の酸素分圧と比較して低下するであろう。定常状態の状況においては、酸素の供給は消費と等しく、胚に向けての酸素分圧勾配は安定であろう。拡散空間の、または胚からある距離の開口から、胚に向けての勾配の急峻性は、かくして、胚酸素消費(呼吸)の尺度である。胚の呼吸速度は、区画内部の位置における酸素分圧または濃度を測定することによって測定される。1つの測定は、前記した条件下で呼吸速度を決定するのに十分であろう。
区画はいくつかの方法で設計でき、その例を以下に議論する。
・空間を囲う壁からなる区画
・少なくても一つの代謝産物の制御された拡散を可能とする粘性材料によって作成され、かつそれを満たした区画。
式中、Pは材料/バリヤーの浸透率であり、Q=δmgas/δtは面積積分フラックス、すなわち、伝達率であり、Aは面積であり、Iは厚みであって、Δpはバリヤーを横切っての分圧の差である。Pは次元:
[P]=(浸透体*バリヤー厚みの量)/(面積*時間*圧力勾配)
を有する。
スチレン−アクリロニトリルコポリマーSAN(24℃においてP=15〜40cm3mm/m2日気圧)
アクリロニトリル−ブタジエン−スチレンコポリマーABS(25℃においてP=39.3cm3mm/m2日気圧)
ポリ塩化ビニル
ポリブチレンテレフタレートPBT(P=15.5cm3mm/m2日気圧)
ポリフェニレンスルフィドPPS(P=11.8cm3mm/m2日気圧)
ポリイミド(P=10cm3mm/m2日気圧)
ポリシクロヘキシレンジメチレンエチレンテレフタレートPETG(22.8℃においてP=9.97cm3mm/m2日気圧)
ポリフッ化ビニリデンPVDF(P=1.96cm3mm/m2日気圧)
ポリエチレンテレフタレートPET(P=2.4cm3mm/m2日気圧)
ポリエチレンナフタレートPEN(P=0.525cm3mm/m2日気圧)
ナイロン/ポリアミド(P=0.4−1.5cm3mm/m2日気圧)
液晶ポリマーLCP(23℃においてP=0.037cm3mm/m2日気圧)
エチレンビニルアルコールコポリマーEVOHバリヤー層(例えば、Capram Oxyshield OB、P=0.0021〜24cm3mm/m2日気圧)
アクリロニトリル−アクリル酸メチルコポリマーAMA(P=0.08〜0.64cm3mm/m2日気圧)
ポリスルフォン(P=90.5cm3mm/m2日気圧23℃)
ポリプロピレンPP(23℃においてP=59〜102cm3mm/m2日日気圧)
環状オレフィンコポリマーCOC(P=71cm3mm/m2日気圧)
ポリカーボネート(P=90〜120cm3mm/m2日気圧)
ポリスチレンPS(P=117〜157cm3mm/m2日気圧)
ポリエチレンPE(P(ULDPE)=280、P(LDPE)=102〜188、P(HDPE)=35〜110、P(LLDPE)=98〜274cm3mm/m2日気圧)
エチレン−アクリル酸コポリマーEAA(P=178−550cm3mm/m2日気圧)
ポリテトラフリオルオロエチレン、PTFEテフロン(25℃においてP=223cm3mm/m2日気圧)
エチレン−ビニルアセタトコポリマーEVA(P=177−210cm3mm/m2日気圧)
区画は、原理的には、問題の代謝産物のための拡散勾配を確立するための各適当な形状を呈することができる。しかしながら、区画の形状は、好ましくは、特に、実質的に球形の代謝粒子の挿入および除去に関して実質的に球形の代謝粒子の取扱いを容易とすべきである。本発明の関係では、該形状は区画の内部寸法をいう。区画の外側寸法は任意の現実的な形状を達成することができる。
区画は先に議論した拡散勾配の確立を可能とするような寸法とされる。この点において、実質的に球形の代謝粒子の摂取および/または放出に対する区画の寸法は重要である。与えられた実質的に球形の代謝粒子の代謝産物の摂取および/または放出は、しばしば、実質的に球形の代謝粒子のサイズに依存するので、実質的に球形の代謝粒子のサイズに対する区画の寸法は重要である。
1つの実施形態において、実質的に球形の代謝粒子は、代謝産物浸透性層の層上の区画中に配置される。それにより、実質的に球形の代謝粒子には、全ての側から代謝産物が供給され、より最適な条件に導く。代謝産物浸透性層のもう1つの利点は、それが、後に議論するように代謝産物濃度の測定を容易とすることができることである。代謝産物浸透性層は、好ましくは、底が前記定義の通りである少なくとも1つの区画の底に配置される。
区画内部の代謝産物濃度は、好ましくは、非−侵入性方法によって測定される。該方法は、適切には、問題の代謝産物に応じて選択される。
(式中、αはルミネセンスの非クエンチ可能分率であり、I0は酸素の存在下におけるルミネセンス増加であり、KSVは固定化されたルミノフォアのクエンチング効果を表す定数である(Stern and Volmer 1919, Klimant et al. 1995)。)濃度は単純な3−点較正に基づいて検索することができる。
τ0/τ=1 + kq・τ0・po2 (2)
[式中、τ0およびτは、各々、酸素の不存在下における、およびpo2の酸素分圧における燐光寿命でありkq(クエンチング定数)は、酸素および励起されたトリプレット状態のポルフィリンの間の衝突の頻度、および衝突が起こった場合のエネルギー移動の確率に関する二次速度定数である。酸素分圧po2を計算するためには、酸素の不存在下におけるクエンチング定数および寿命が測定されなければならない。]
本発明によるデバイスは前記した少なくとも1つの区画を含む。好ましい実施形態においては、該デバイスは、少なくとも96区画のような、少なくとも48区画のような、少なくとも24区画のような、少なくとも12区画のような、少なくとも8区画のような、少なくとも6区画のような、少なくとも4区画のような、少なくとも2区画のような複数の区画を含む。それにより、1を超える実質的に球形の代謝粒子の代謝速度を容易に測定することができ、各区画は1つの実質的に球形の代謝粒子を含む。
本発明は、さらに、前記した代謝粒子を培養するための最適化されたデバイスに関し、ここに、該デバイスは前記した少なくとも1つの区画を含む。したがって、本発明は代謝粒子の培養用のデバイスに関し、そのデバイスは少なくとも1つの区画を含み、該区画は拡散バリアーによって規定され、かつ代謝粒子を含む培地を含むことができ、該拡バリヤーは拡散によって代謝粒子への、および/または代謝粒子からの代謝産物移送を可能とし、それにより、代謝産物拡散勾配が、代謝粒子から、および培地を通じて確立される。
a)本明細書中に定義された少なくとも1つのデバイスを設け、
b)代謝粒子を区画の倍地中に配置し、
c)代謝粒子を培養する;
ことを含む。
もう1つの態様において、本発明は、実質的に球形の代謝粒子の代謝速度を測定するための非−侵入的方法に関する。該方法は、
a)前記定義の少なくとも1つのデバイスを設け、
b)実質的に球形の代謝粒子を区画の倍地中に配置し、
c)区画内部の代謝物濃度を測定して、代謝産物濃度尺度を得、
d)該代謝産物濃度尺度を該実質的に球形の代謝粒子に相関させ、それにより、実質的に球形の代謝粒子の代謝速度を決定する;
ことを含む。
本発明によるデバイスは、さらに、閉じた呼吸測定によって、実質的に球形の代謝粒子のような粒子の呼吸速度を測定するのに用いることができる。閉じた呼吸測定は、閉じた呼吸測定セル、すなわち、酸素の供給が少なくとも一次的に停止されたセルにおける呼吸速度の尺度である。本発明のデバイスは、デバイスの区画中のいずれかの開口にわたって、酸素のような代謝産物に不浸透性の材料のカバーを適用することによって閉じた呼吸測定セルに変換することができる。該カバーは前記した不浸透性材料のいずれかから製造することができる。
a)前記定義の少なくとも1つのデバイスを設け、
b)代謝粒子を区画の倍地中で培養し、
c)培養期間の少なくとも一部の間に、培地への代謝産物供給を低下させ、
d)代謝産物供給が低下された後に、区画内部の代謝産物濃度を測定して、代謝産物濃度尺度を得、
e)該代謝産物濃度尺度を該実質的に球形の代謝粒子に相関させる;
ことを特徴とする、代謝粒子の代謝速度を決定するための非−侵入的方法に関する。
代謝産物濃度尺度は低下した供給の間に得られているのが好ましい。
さらなる態様において、本発明は、区画中において、実質的に球形の代謝粒子のような粒子への代謝産物供給を調節する方法に関する。
a)培地を含む区画を含む少なくとも1つのデバイスを設け、
a)実質的に球形の代謝粒子を区画の培地中で培養し、
b)区画内部の代謝産物濃度を測定して、代謝産物濃度尺度を得、次いで、所望により、
c)該代謝産物濃度尺度を、該実質的に球形の代謝粒子の代謝速度に相関させ、
d)代謝産物濃度尺度および/または該実質的に球形の代謝粒子の代謝速度に応じて代謝産物供給を調節する;
ことを特徴とする、培養の間に実質的に球形の代謝粒子への代謝産物供給を調節する方法に関する。
本発明は、さらに、実質的に球形の代謝粒子のモニタリング、および代謝速度によって測定される生存率の点で高品質を有する実質的に球形の代謝粒子の選択に関する。
a)培養の間に胚の代謝速度を少なくとも1回測定し、
b)最適な代謝速度を有する胚を選択する;
ことを特徴とする、生きた胚を選択する方法のような、生きた胚の選択に関する。
以下において、本発明の多数の異なる実施形態を添付の図面を参照して説明するが、これらの実施形態は一般的な発明概念の例を構成するに過ぎず、他の実施形態が当業者によって考えることができるのは理解されるべきである。
(式中、Jは酸素のフラックスであり、これは、定常状態では、胚の消費に等しく、Dは培地の既知の拡散係数であって、dC/dXは酸素勾配である)を用いて、該拡散区画1.4の底1.3および開口1.7における酸素分圧間の差として測定される。勾配dC/dXは、区画の開口1.7および胚1.1のレベルにおける区画の底での規定された雰囲気または培地の間の酸素分圧の差である。区画1.4の底を被覆する光学酸素ルミノフォア1.3の本実施形態における使用は、合計底面積にわたって酸素信号を積分する。胚に関連する不均一に分布した酸素消費から生じる、胚のレベルにおける水平方向酸素勾配を、胚の正確な設置が呼吸見積もりと無関係になるように、消費が底面積にわたって均等に分布するかのごとく平均化する。
ウシ胚を、1mmの直径および4mmの深さを持つ円筒形区画の底に置き、55hPaの酸素分圧での雰囲気下で培養した。区画内部の定常状態酸素分圧勾配は、胚に向けての区画の開口から100μm間隔で測定した。定常状態が達成される前の時刻t(秒)は、以下の式:
によって近似することができる。式中、Iは拡散区画の深さ(cm)であって、Dは培地の拡散係数である。かくして、1mmの直径および4mmの深さを持つ区画における定常状態は、Dを3.5×10−5と仮定してほぼ35分後に達成されるであろう。ミクロマニピュレーターで位置決定された10μmの先端サイズを持つクラークタイプの酸素のミクロセンサーを用いた。図4に示されたデータは、区画を通っての直線勾配を示す。かくして、区画の頂部および底における酸素分圧を知るのは勾配を決定するのに十分である。図4から、開口から胚に向けての区画内部の直線勾配に沿ったいずれかの点において酸素分圧を測定することによって勾配を決定することができることはさらに明白である。
胚操作の後、各個々の胚をピペットによって区画に移す(試験管受精、クローニング、解凍または他の技術;例えば、胚操作技術の一般的記載についてはIn vitro fertilization. Kay Elder, Brian Dale, 2nd rep. Ed, Cambridge University Press (2001参照)。該区画は、1または数人または数匹のヒトまたは動物からの1個または数個のバッチの胚が複数区画、または区画の群を含む単一フレーム内に含有できるように、数個の区画を含むより大きなフレーム内に含める。次いで、該フレームを、ヒト胚では、典型的には、商業的に入手可能な培養基(例えば、IVF−50、Scandinavian IVF Science AB,エーテボリ、スウェーデン国)中で成長させた、37℃、N2中の5ないし21%O2および5%CO2,100%湿度であろう所望の条件下でインキュベートする。選択する培地は、いずれかの特異的タイプよりはむしろ品質制御の許容性および培地の入手性に依存する。胚の培養のための相対的に単純な平衡塩溶液を用いることができる。イーグル、タイロードおよびHepes培地は首尾よく導入されている。これら培地は単一の強化又は濃縮された溶液として市販されている。呼吸測定は、各個々の区画の底のルミノフォアからルミネセンス信号を生じる特別に設計されたルミノセンスリーダーにフレームを入れることによって行われる。フレームは測定後直ちにインキュベーターに戻される。現実の呼吸速度は、各個々の区画寸法についての情報で計算される。もし胚の位置における酸素分圧が与えられた最適な間隔、例えば、5ないし10%の間内になければ、区画寸法および、かくして、酸素分圧は、例えば、適当なインサートで調整される。
モデル化された半球拡散:図6Aは、大きな区画の平坦な底に存在するウシ胚に向けての酸素プロフィールを示す。図6BはC(r)対a/rにおける同一データを示し、ここに、aは該球の中心(胚の中心)から酸素プロフィールの選択された(胚に向けての)終点までの距離である。プロフィールが胚の表面から出発する場合、aは胚の半径である(aは胚から離れた地点においても選択できる)。球拡散についての仮定は、もしC(r)対a/rが非常に大きなb値(C2が真のバルク濃度である場合)につき直線的であるならば満たされる。
拡散理論
1.消費の一定源に向けての拡散
化合物を消費する代謝粒子または対象を含む拡散系においては、該化合物は拡散によって消費源に向けて移送される。この拡散の大きさ−フラックスはフィックの第一法則:
によって記載することができる。式中、Dは拡散係数であり、Cは濃度であり、xはそれに沿ってフラックスが考えられる軸である。
として表すことができ、これは方程式4.1.1を代入することによって、
が得られる。これらの方程式にはある範囲の幾何学(平行多面体、円筒、球)が適用され、これは本発明の異なる実施形態を表すと考えることができる。例えば、計算では、酸素呼吸粒子は3.45・10−5cm2s−1の拡散係数(38℃)を持つ水に懸濁させる。
もし拡散化合物の濃度および物理的境界が一次元で変化するだけであれば、拡散系は一次元と定義される。無限に広い面シートは一次元の系の例である。もしエッジ効果を無視することができるならば底における消費の源を持つ平行な辺のウェルは一次元の拡散系と考えるべきである。
として記載することができ、これを積分すると、
が得られ、これをさらに積分すると、
C=Ax+B (4.2.2)
(式中、A、Bは積分定数である)
が得られる。
C(h)=Ah+B=Cw (4.2.4)
が得られる。
円筒形拡散系においては、拡散は円筒の半径に沿って起こり、他方、円筒系の長手方向軸に沿って変化は無い。もしエッジ効果を無視することができれば、その中心における消費源を持つディスク−形状の本体よりなる拡散系は円筒系と考えるべきである。
C(r1)=A+Blnr1=Cw (4.3.4)
が得られる。
F=2π・r・l (4.3.5)
球拡散系においては、拡散は球の半径または球の断面に沿って起こる。もしエッジ効果を無視することができれば、その先端に消費源を持つ円錐−形状本体よりなる拡散系は球系と考えるべきである。
(式中、θは円錐の先端角度である)と記載することができる。方程式4.4.3と4.4.4および4.4.5を組み合わせてAおよびBを解くことによって、方程式(4.4.2)は、
と書き直すことができる。
本発明によって記載された新規なデバイスの設計例
この特許出願における図面は、本明細書中に記載された新規なデバイスについての15の異なる設計について示す。これらの変形の多くは、代謝粒子の取扱いおよび/または拡散バリアーの調整を容易として、代謝粒子についての最適なインキュベーション条件を確実とするための機能的に同等な設計である。それらは、区画内、および区画近くの培地で生じた代謝産物濃度勾配タイプに従ってカテゴリーに分けることができる。4つのカテゴリーは:
1.直線的代謝産物濃度勾配を持つ一次元の系
2.対数代謝産物濃度勾配を持つ二次元の系
3.双曲線濃度勾配を持つ三次元の系(円錐ないし半球)
4.前記の組合せであって、濃度勾配を記載するのにより複雑なモデリングが必要な不規則な系
である。
−消費速度、Q=1.0ナノリットル・時間−1(=1.24・10−5nmol・s−1まで)、
−酸素拡散係数、(38℃において)培地中D=3.45・10−5cm2s−1、
−培地中の酸素濃度、38℃においてCw=210μM
−所望のセンサー信号はバルクよりも30%低い(すなわち、38℃においてC0=147μM)である。
そのような系に関する拡散方程式は実施例4の第二セクションに記載されている。もし我々が3mmの円筒の高さhを仮定すれば、我々は方程式4.2.6を用いて円筒の直径dを計算することができる。
但し、F=π(d/2)から
を得る。
このカテゴリーの設計においては、代謝粒子は、浸透性材料(例えば、培地)がディスクを構成するように、2つの不浸透性平面表面の間に位置する。我々は、ディスク形状の円筒において必須として径方向拡散を有する。円筒拡散系においては、拡散は円筒の半径に沿って起こり、他方、円筒系の長手方向軸に沿っては変化は無い。もしエッジ効果を無視することができれば、ディスクよりなる拡散系が開発される。そのような系に関する拡散方程式は実施例4の第三セクションに記載されている。もし我々が代謝粒子下の検出器ディスクの半径がr0=0.5mmであり、代謝粒子上方にある平面表面の外側半径がr1=5mmであると仮定すれば、我々は方程式4.3.7を用いて、不浸透性平面表面の間の距離lを計算して、所望の検出器信号:
を得ることができる。
このカテゴリーの設計において、代謝粒子は平面不浸透性表面上に、またはそのような表面中の円錐窪みに位置する。双方の場合は球拡散系の例であり、そこでは、不浸透性材料は、それから代謝産物が代謝粒子に接近することができる角度を制限する。もし我々が円錐窪みの角度の関数として観察された流動を表現するならば、不浸透性表面の代謝粒子の半球拡散パターンは、角度θ=180°を持つ方程式の同一の組によって記載することができる。そのような系に関する拡散方程式は、実施例4の第4セクションに記載されている。もし我々が代謝粒子の位置における円錐の半径がr0=0.5mmであり、円錐窪みの外側半径がr1=3mmであると仮定すれば、我々は方程式4.4.7を用いて、円錐の頂部における円錐角度θを計算して、所望の検出器信号:
を得ることができる。
図8に示された設計L:調整可能な厚みの蓋を持つ区画。この設計は、蓋(8.4)を、培地よりも代謝産物に対してより浸透性ではないが、区画の不浸透性壁(8.5)よりも依然として浸透性である材料から構成された非−液体拡散バリヤーとして使用する。代謝粒子(8.1)は、不浸透性プレート中の狭いウェルに入れられる。検出器(8.3)はウェルの底に置かれる。該ウェルは厚み(8.4)を変化させた代謝産物浸透性蓋を有する。かくして、我々は、蓋を単に水平に置くことにより異なる厚みを持つ蓋の異なるセクションでウェルを被覆することによって拡散バリヤーを調整することができる。この図面では、ウェルおよび蓋は油カバー(8.13)下に沈められて蒸発を防ぐ培地(8.2)の液滴で被覆されるが、該培地もまた油なくして容器を満たすことができる。この設計の主な利点は単純性、比較的浅いウェル中での代謝粒子を取り扱う容易性、および蓋を持つ調整可能な「コンパクトな」拡散バリヤーである。主な不利は、蓋とベースプレート間の緊密な嵌合を保障することである。もし該嵌合が不適切であれば、区画への代謝産物の水平拡散は可能となる。
ネズミ胚を含む円筒区画における光学酸素測定
一般的な測定原理は、図11に従った特定の実施形態で評価した。胚盤胞段階のマウス胚の呼吸活性は、以下の記載に従って測定した。
図11に示された実施例5、バージョンBにおける詳細な記載を参照されたし。
それはガラスから作成された2つの不浸透性部品から構成される。ガラスプレートが底(11.5)に対して形成される。このプレートの上に、4mmの高さhを持つガラス(11.5)の小さな円筒が置かれる。このクラスの円筒の中心を通るのは、0.5mmの直径dを持つ円筒状穴(11.4)である。容器表面に面する該穴の端部において、該穴はドリル先端で穴あけされて(「中空とされて」)、その中に呼吸粒子(11.1)が入れられる小さな円錐キャビティーを形成する。円錐キャビティーの上方壁は酸素でクエンチ可能なポリフィリンフルオロフォア(11.3)(ポリスチレン中の白金(II)−オクタ−エチル−ポルフィリン)で被覆される。ガラス円筒が、歯科用ワックスでガラスプレートに付着され、シールされて、2つのガラス部分の間の界面における酸素の水平方向移送を回避する。
3ないし4週齢未成熟雌B6D2F1マウス(DBA/2J雄とC57BL//6J雌との間のF1交配種)を第0日に61.U.PMSG(FolligonR vet,Intervet社,デンマーク国)で腹腔内で処理した。2日後に(第3日)それらを6I.U.SuigonanR Vet.(Suigonan, Intervet社, デンマーク国 400I.E.血清ゴナドトロピン 200 I.E. じゅう毛性ゴナドトロピン)で処理した。同日に、雌を雄B6D2F1マウスと接合させた(受精テスト)。2−細胞胚を、培地M2(シグマケミカル社, セントルイス アメリカ合衆国)を用いて接合から2日後に(第5日)卵管2から流した。流した後に、胚をM16(シグマケミカル社, セントルイス アメリカ合衆国)培地に移し、空気雰囲気中の5%CO2下で37℃にて培養した。動物をタイプII マクロロンケージ(Techniplst社,イタリア国)中に維持し、飼料(Altromin#1314,Brogaarden, デンマーク国)および水を自由に節食させた。
を用いて酸素分圧に変換した。ここに、αは散乱迷光を含めた蛍光の非−クエンチ可能分率であり、I0は胚をデバイスに入れた後における不存在下での蛍光強度であり、酸素分圧は21%(雰囲気濃度)からほぼ17%まで降下し、デバイス(図11中11.4)の垂直円筒キャビティーの高さ(4mm)にわたって4%酸素(または19%大気飽和)の勾配を生じる。酸素の溶解度は38℃(インキュベーション温度)において210μMであり、これは100μMcm−1の勾配(dC/dX)をもたらす。38℃における成長培地中での拡散係数はほぼ3.45*10−5cm2s−1であり、これは3.45*10−12mol cm−2s−1のフラックスを生じる。試験管は0.00196cm2の断面積を有するので、これは0.677*10−14mol胚−1s−1、または0.546*10−9l胚−1h−1(0.546nl O2h−1)の胚特異的呼吸速度を与える。
円錐窪みにおけるマイクロセンサー測定
60度の尖ったスチールロッドをその表面にプレスすることによって、0.04cm深さの円錐窪みを、ポリスチレンプラスチックプレート中の2cm幅のウェルの底に生じさせた。歯科用ワックスの薄い層を該窪みの周りの4mm直径の丸として適用した。ほぼ20μlの培養培地をピペットで窪みおよびワックス丸内部の領域に入れ、4日齢のほぼ100μm直径のマウス胚を、5mlパラフィン油をウェルに注いで培地の液滴を被覆する前に、窪みの底に入れた。プレートを37℃の水浴に入れ、電動駆動マイクロマニピュレーターに固定された酸素マイクロセンサーの先端を窪み上方に位置させた。双方のマイクロマニピュレーターを制御し、マイクロセンサー増幅器からの信号を獲得するPCソフトウェアを、5マイクロメーターの工程で胚に向けての垂直線に沿って酸素測定を行うようにプログラミングした。測定された濃度−対−胚までのマイクロセンサー距離を図20に示す。窪みの先端/底からほぼ0.015cmに位置する胚表面において、濃度は206μMであり、これは式4.4.7を用いて0.11nl・時間−1の酸素消費速度に変換することができる。図面から理解できるように、完全な濃度プロフィールが胚に向けて測定され、モデルに対する式4.4.7を用い、このプロフィールは非常に良く適合し、これにより、モデルの有効性が確認される。
x.1 代謝粒子
x.2 周囲の培地
x.3 検出器
x.4 代謝産物浸透性拡散バリヤー
x.5 実質的に代謝産物不浸透性区画壁
x.6 代謝粒子を支持することができる代謝産物浸透性層
x.7 区画の外側の周囲に向けての区画の開口
x.8 理論代謝産物濃度勾配
x.9 図1による実施形態におけるインサート
x.10 区画の調整可能な底
x.11 濃度勾配等濃度線
x.12 CCDカメラ
x.13 蒸発および乱れを妨げるために培地を被覆する粘性層
x.14 挿入ポート(図7のみ)
x.15 スペーサー(図9および10のみ)
x.16 支持体構造
x.17 調整可能な頂部(図16のみ)
x.18 ネジ
Claims (34)
- 代謝粒子の個々の代謝速度の非−侵入的測定用のデバイスであって、
a)拡散バリアーによって規定され、かつ代謝粒子を含む培地を含むことができる区画であって、該拡散バリアーは、代謝粒子へのおよび該代謝粒子からの代謝体の拡散的フラックスを制限及び低下させるために、代謝粒子の周りに配置され、拡散によって代謝粒子へのおよび/または該代謝粒子から該拡散バリアーを通過して代謝体を移送することを可能とすることで、代謝体拡散勾配が、代謝粒子から、および培地を通じて確立され得る少なくとも1つの区画と、
b)該区画内部の代謝体の濃度を測定するための少なくとも1つの検出器と、を備え、
代謝粒子が、細胞、細胞の群、および、シー・エレガンスまたは他の小さな多細胞生物のいずれかであることを特徴とするデバイス。 - 前記拡散バリアーが、少なくとも1つの代謝体浸透性開口を有する区画壁と前記培地によって構成される請求項1記載のデバイス。
- 前記区画壁が代謝体不浸透性材料から製造された請求項2記載のデバイス。
- 前記拡散バリアーが高粘度培地によって構成される請求項1記載のデバイス。
- 前記区画の形状が円筒、多面体、円錐、半球またはこれらの組合せからなる群から選択される前記請求項1〜4のいずれか1項に記載のデバイス。
- 区画の横方向寸法の調整用のインサートを含む前記請求項1〜5のいずれか1項に記載のデバイス。
- 前記区画が、寸法を変化させ、区画の容量を増加または減少させるための調整可能な底を有する前記請求項1〜6のいずれか1項に記載のデバイス。
- 代謝体浸透性層が少なくとも1つの区画の底に配置された前記請求項1〜7のいずれか1項に記載のデバイス。
- 代謝体浸透性層が代謝粒子と代謝体検出器との間に置かれた請求項8に記載のデバイス。
- 前記代謝体が酸素または二酸化炭素である前記請求項1〜9のいずれか1項に記載のデバイス。
- 前記検出器が酸素検出器である前記請求項1〜10のいずれか1項に記載のデバイス。
- 代謝粒子の代謝速度を測定する非−侵入的方法であって、
a)請求項1〜11のいずれか1項に記載の少なくとも1つのデバイスを設け、
b)区画の培地中に代謝粒子を配置し、
c)該区画の内部で代謝体の濃度を測定して、代謝体濃度の尺度を求め、
d)該代謝体濃度の尺度を、代謝粒子の代謝速度に相関させる、工程を有することを特徴とする方法。 - 代謝体が、培地を経由する拡散によって代謝粒子に供される請求項12記載の方法。
- 代謝粒子を区画中で培養する請求項12〜13のいずれかに記載の方法。
- 前記代謝粒子の代謝速度が、測定された代謝体濃度に基づいて、区画中の代謝体拡散勾配を測定し、次いで、代謝体拡散勾配を、代謝粒子の代謝速度に相関させることによって決定される請求項12〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 代謝体濃度がガス分圧である請求項12〜15のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ガス分圧が酸素または二酸化炭素の分圧である請求項16記載の方法。
- 代謝粒子が、胚の群、および癌細胞、幹細胞、胚性幹細胞、シー・エレガンスまたは他の小さな多細胞生物のような細胞からなる群から選択される請求項12〜17のいずれか1項に記載の方法。
- 培養の間に代謝粒子への代謝体供給を調節する方法であって、
a)培地を有する区画を備えた請求項1〜11のいずれか1項に記載の少なくとも1つのデバイスを設け、
b)区画の培地中で代謝粒子を培養し、
c)区画内部の代謝体濃度を測定して、代謝体濃度の尺度を得ることを特徴とする方法。 - 該代謝体濃度尺度を、代謝粒子の代謝速度に相関させる請求項19記載の方法。
- 代謝体濃度尺度および/または代謝粒子の代謝速度に依存して代謝体供給を調節する、工程を有する請求項19または20記載の方法。
- 代謝体が酸素であって、代謝プロセスが呼吸である請求項19〜21のいずれか1項に記載の方法。
- 前記調節が、区画外部の代謝体濃度を変化させることによって行われる請求項19〜21のいずれか1項に記載の方法。
- 前記調節が、区画の寸法を変化させることによって行われる請求項19〜21のいずれか1項に記載の方法。
- 前記調節が、区画の拡散バリアーを変化させることによって行われる請求項24記載の方法。
- a)請求項12〜18のいずれか1項に記載の方法によって、培養の間に胚の代謝速度を少なくとも1回測定し、
b)最適代謝速度を有する胚を選択する、工程を有することを特徴とする生きた胚を選択する方法。 - 代謝速度の測定が、胚によって経験される成長条件のいずれの変化も引き起こすことなく行われる請求項26記載の方法。
- 代謝粒子の代謝速度を決定する非−侵入的方法であって、
a)請求項1〜11のいずれか1項に記載の少なくとも1つのデバイスを設け、
b)区画の培地中で代謝粒子を培養し、
c)培養期間の少なくとも一部の間に、培地への代謝体供給を低下させ、
d)代謝体供給が低下された後に、区画内部の代謝体濃度を測定して、代謝体濃度尺度を得、
e)該代謝体濃度尺度を、代謝粒子の代謝速度に相関させる、工程を有することを特徴とする方法。 - 代謝体が酸素であって、代謝速度が呼吸速度である請求項28記載の方法。
- 酸素供給がゼロまで低下される請求項29記載の方法。
- 区画中のガス分圧尺度が、低下した酸素供給の期間の間に得られている請求項29記載の方法。
- 代謝粒子を培養するための培養デバイスであって、少なくとも1つの区画を含み、前記区画は拡散バリアーによって規定され、かつ、代謝粒子を含む培地を備えることができ、前記拡散バリアーは、拡散によって代謝粒子への、および/または、代謝粒子からの代謝体の移送を可能とすることで、代謝粒子からおよび培地を通じて代謝体拡散勾配を確立することを可能とし、代謝粒子が、細胞、細胞の群、および、シー・エレガンスまたは他の小さな多細胞生物のいずれかである培養デバイス。
- 前記デバイスが請求項1〜11のいずれか1項に記載の特徴の1つ以上を有する請求項32記載のデバイス。
- 代謝粒子を培養する方法であって、
f)請求項32または33記載の少なくとも1つのデバイスを設け、
g)区画の培地中に代謝粒子を配置させ、
h)代謝粒子を培養する、工程を有することを特徴とする方法。
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