CN101802166B - 用于监测和/或培养显微对象的设备、系统和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于执行显微对象的监测和/或培养的设备、系统和方法。显微对象特别是诸如细菌这样的显微生物和细胞培养物，例如诸如组织样本和胚胎这样的培养对象，在胚胎发育期间提供最佳和安全的培养条件和通过方便自动数字成像和时滞显微镜检查的胚胎操作便于选择最佳胚胎用于体外受精(IVF)。

Description

用于监测和/或培养显微对象的设备、系统和方法
技术领域
本发明涉及一种用于执行显微对象的监测和/或培养的设备、系统和方法。显微对象特别是诸如细菌这样的显微生物和细胞培养物，例如诸如组织样本和胚胎这样的培养对象，在胚胎发育期间提供最佳和安全的培养条件和通过方便自动数字成像和时滞显微镜检查的胚胎操作便于选择最佳胚胎用于体外受精（IVF）。 
背景技术
为了显微镜检查手动定位小对象是耗时的。寻找对象、将它居中地放置在视野中并且聚焦于关心特征占用了与临床显微镜检查有关的工作负荷的很大部分。一种特别关心的情况是作为标准IVF处理的一部分的卵母细胞和胚胎的显微镜检查，其中胚胎在带有限定温度、大气压和PH的安全培育箱环境外部的操作是必须被最小化的重要因素。自动系统是已知的，其能够通过找出认为关心对象所处的预定X-Y-Z坐标有效地重定位对象。然而，获得指定对象的正确坐标的初始任务非常耗时。如果对象运动和图像采集是自动的，它通常意味着网格图案中采集连续图像并且在拼图中将这些拼合在一起以允许搜索算法或操作者找到关心对象。备选地它涉及帮助操作者手动地定位对象和记录坐标。 
尽管通常有可能将较大对象定位在它们保持不动的预定点，对于液体介质中显微尺寸的对象这变得愈加困难。一个特别关心的例子是早期人类胚胎，其直径仅仅大约为1/8mm（大约120μm），密度略高于它们的生长介质。将胚胎精确地定位在介质小滴中是困难的，并且操作容易扰乱它们的位置。 
显微对象的准确定位在许多应用中通常是所关心的。然而，当使用胚胎移植（ET）技术例如IVF（体外受精）和相关技术时，这涉及在再植入选定胚胎之前将发育胚胎在体外培养数天时间。即使在理想的生长条件下，也需要选择标准作为工具来选择活性最好的胚胎用于再植入。为了确定胚胎的移植适合性，胚胎的活性是重要参数。在实践方面，显微镜检查的精确定位是在操作之后评价胚胎的活性的先决条件。在实践中，胚胎评估或多或少地被局限为基于形态学标准的主 观分级。胚胎的呼吸率可以证明是客观活性指标的良好候选。所以，需要一种允许形态学评估和/或可能以个体胚胎呼吸率的测量作为胚胎活性的量度的快速、简单和无扰方法、系统和设备。 
WO0102539描述了一种孔中孔（WOW）方法以在显微镜载玻片中提供个体细胞培养物，其所声称的优点是提供在较大体积孔中的小体积孔以允许每个个体胚胎的更好培养环境。 
然而，包括所述WOW的显微镜载玻片的手动和/或自动操作已被证明是耗时和困难的，原因是实践证明难以将胚胎或其他细胞培养物插入较小体积孔中。此外如果想要在载玻片上提供一个以上的WOW，则可能有一个WOW污染另一个WOW的风险，这对于细胞生长是有害的。一个问题特别在于如果一个细胞培养物遭受溶解或其他发育问题，从一个孔到另一个孔的细胞溶解液的污染或扩散会传播这样的问题。 
例如包括用于培养目的的至少一个WOW的已知显微镜载玻片的另一个问题是如何保持用于发育所述活体细胞培养物的稳定环境，即保持相对稳定的预定温度、稳定的气体组成、足量的培养介质、所需的湿度，并且减小受到周围环境污染的风险并降低其他环境影响。 
此外，尽管由于可以在所述载玻片内实现沿x，y和z方向设置的相对确定坐标的事实可以使用WOW设备提供个体对象的更精确定位；考虑到上述操作问题，WOW设备的使用会减小操作时间，但不明显，并且它不会防止相互和外部污染。当应用于胚胎活性评价时，根据该系统的显微镜检查方法、设备和系统应提供如 
Figure GDA0000369119480000021
1996所述的以下关键要素（参见“In vitro assessment of embryo viability”，Theriogenology45:3-161996）：1）同时进行多个个体胚胎的客观测量的能力，2）测量个体胚胎/卵母细胞的灵敏度和分辨率，3）快速评估，即～30分钟或以下，4）活性测试必须是无扰的并且理想地是无创的，5）技术简单和用户友好，6）获得和操作时的成本小。 
基于以上背景本发明的一个目的是提供一种在开头所述类型的方法、设备和系统，其减少已知方法、设备和系统的上述缺点。 
发明内容
本发明的目的是培养显微生物以在培育期间提供合适的、稳定的生存条件并且附带地便于操作、观察和维护。本发明大大便于将显微对象放置在可以进行常规检查、操作和/或自动成像的预定点。 
根据如本文所述的本发明的各种方面的方法、设备和/或系统满足了上述目的。 
在第一方面中本发明涉及一种用于监测和/或培养至少两个显微对象和对象介质的设备，包括： 
-载玻片，包括在其顶表面中的至少两个凹陷； 
-其中每个凹陷包括横截面比所述凹陷更小的凹穴以用于容纳各个显微对象和对象介质， 
-所述载玻片带有储室以用于以这样的方式在所述凹陷之间提供公共覆盖层（7）使得所述介质不相互流体连通，和/或 
-其中每个凹陷包括横截面比所述凹陷更小的凹穴以用于容纳各个显微对象和对象介质， 
-其中至少所述凹陷和/或所述凹穴具有对应于其在所述载玻片上的轮廓的底表面型面；所述型面的形貌适于匹配载玻片座的相应形貌，和/或 
-其中每个凹陷包括横截面比所述凹陷更小的凹穴以用于容纳各个显微对象和对象介质， 
-其中所述设备的至少一部分带有操作突出部，和/或 
-其中所述载玻片包括用于唯一地识别每个凹陷的装置。 
在凹陷内提供凹穴将通过使显微对象沿斜坡下滑以安置在带有适合于显微镜检查的例如具有平底的小凹穴中将显微对象自动定位在预定点。凹穴保证随后的操作不会扰乱对象在显微镜载玻片内的位置。因此，显微对象例如活体生物的自动密度驱动定位在凹陷内的中心凹穴中被提供。中心凹穴构成储室，其可以例如通过自动图像分析算法容易地被检测，使得可以执行储室内的对象的无人照管自动显微镜检查。优选地，通向储室的孔的面倾斜以便提高在尺寸大得多的凹陷内的尺寸较小凹穴内部找到对象的概率。 
在一个载玻片上提供一个以上的凹穴可以减小操作时间，原因是对于每个待观察的新对象可以在不必去除载玻片和插入新的载玻片的情况下进行观察和成 像。 
在第二方面中本发明涉及一种被布置用于执行至少两个显微对象的监测和/或培养的系统，包括用于操作至少两个显微对象和对象介质的设备，所述设备包括：载玻片，包括在其顶表面中的至少两个凹陷；每个凹陷包括横截面比所述凹陷更小的凹穴以用于容纳各个显微对象和对象介质，其中至少所述凹穴具有对应于其在所述载玻片上的轮廓的底表面型面；其中所述系统还带有包括载玻片座的定位装置，所述载玻片座适于匹配至少对应于至少所述至少两个凹穴的轮廓的所述底表面型面。 
在第三方面中本发明涉及一种用于操作如上所述的设备的方法，包括通过使至少对应于至少所述至少两个凹穴的轮廓的所述设备的所述底表面型面匹配包括所述系统的载玻片座的相应定位装置将所述设备定位在如上所述的系统内的步骤。 
所述的凹穴、设备、系统和方法特别适合于使用任何类型的可用玻璃毛细管设备、系统和方法执行胚胎氧呼吸率传感器探查。 
附图说明
在附图中，将参考在未按比例的示意图中所示的一些实施例更详细地描述本发明，其中相似的数字表示相同的特征，其中： 
图1A，1B是根据本发明的一个实施例用于培养和/或监测胚胎的设备的包含凹穴的凹陷的侧视图，和包括图1的设备中的所述胚胎的凹穴的详图； 
图2是根据本发明的第一实施例的适合于胚胎培育和检查的设备的细节的侧视剖面图； 
图3是根据本发明的第二实施例的适合于胚胎培育和检查的设备的细节的侧视剖面图； 
图4是根据本发明的第三实施例的设备的细节的侧视剖面图； 
图5是图4的设备的技术绘图，还包括操作突出部； 
图6是沿着图5中所示的截面A-A的透视剖面图； 
图7是由透明聚合物材料制造的图4，5和6中的设备的透视图； 
图8是图4，5和6的设备的透视图，还包括设在底表面型面（即，凹陷、凹穴和设在其中的储室的相反轮廓）的一部分的铝制导热层； 
图9是适合于与根据本发明的第一实施例的系统配合的热源的图像； 
图10是根据本发明的第一实施例的系统的图像；以及 
图11A，11B分别是根据本发明的设备的一个凹陷和六个凹陷的顶视图像，还包括凹陷和/或凹穴中的个体凹穴识别ID。 
图12是在分析显微镜操作期间可以容易地被观察的带有微型数字的孔ID编号。数字“5”大约为1.mm高和0.4mm宽。 
具体实施方式
在图1A中显示了根据本发明的一个实施例的设备的包含凹穴的凹陷的载玻片或设备的侧视剖面图，并且在图1B中显示了保存显微对象例如胚胎的图1A的凹穴的详图。凹陷和设备特别适合于胚胎的基于密度的定位以用于胚胎培养和/或显微镜载玻片中的监测和/或培养。 
所述显微对象可以是显微生物，例如生长细胞培养物，并且所述设备特别适合于操作、显微镜检查和/或培养发育胚胎。所述显微对象可以是或大或小（例如小于或大于凹穴的直径）的对象的一部分。术语“显微对象”被定义为其最大尺寸小于2mm，优选小于1mm，优选小于500μm，最优选小于200μm的对象。 
胚胎1大体为球形并且由胶状壳体（一种被称为透明带的非细胞基质）所围绕的一个或多个细胞（分裂球）组成。透明带执行各种功能直到胚胎孵化，并且是胚胎评估的好指标。所述带为球状和半透明的，并且应当可清楚地与细胞残骸区分。 
当通过融合或注入精细胞或精子使卵母细胞受精时形成胚胎。该术语习惯上在孵化之后被使用，所述孵化包括透明带的破裂和随后的植入。对于人类受精卵母细胞在前八周习惯上被称为胚胎。之后即八周后并且当所有主要器官形成时它被称为胎儿。然而胚胎和胎儿之间的区别通常并不很明确。 
载玻片或设备表面在所述设备的上表面带有至少一个充满介质的凹陷3，所述凹陷优选地为圆柱形，例如具有大约4.0mm的直径的凹陷，取决于应用所述直径可以从1到25mm变化。胚胎可以使用标准IVF移液管容易地沉淀到凹陷中，原因是凹陷的直径远远大于关心对象。选择凹陷的其他尺寸例如高度和垂直和水平剖面形状使得显微对象可以容易地插入凹陷中。通过保证周围生长介质密度略低于胚胎的密度和提供所述凹陷3的相对平滑壁，胚胎缓慢地下降到凹陷的底部。 
凹陷的基本圆锥形平滑底部分或漏斗31被提供，备选地所述漏斗可以以角锥形、缝形、楔形、梯形或任何其他合适形状的垂直剖面被提供，如图1A中所示相对于垂直线具有大约5到60度，通常30度的角。因此，当胚胎到达凹陷的底部分，即所述漏斗31上面或内部时，胚胎将通过重力和/或施加的离心力滚入在凹陷3和/或漏斗31的中心的凹穴4中。当介质具有相对较高的粘度时无人照管装载过程耗费几分钟。小凹穴保证了尽管有操作运动胚胎仍保持在它的位置。 
漏斗可以易于将关心对象从凹陷引导到凹穴。漏斗通常放置在凹陷的底部以俘获和定位比周围介质密度更高的对象。优选表面基本平滑的漏斗相对于水平线具有大约5到60度，优选10到45度之间，更优选15到35度之间，最优选25到30度之间的角。 
凹穴4的尺寸常常被选择为与凹陷的直径相比相对较小，并且与对象的尺寸相比，大约为1.1×到10×对象的直径，优选1.5×到3×对象的直径，使得对象位置相对于载玻片自身很明确。因此，如果载玻片相对于所述显微镜的位置是已知的，可以容易地获得整个凹穴体积的高分辨率图像和监测。凹穴优选地带有基本平面的底表面40以便易于通过显微镜检查等监测和/或培养所述胚胎。 
凹穴4的最佳高度由尽管有操作运动仍保持胚胎1固定的需要确定。带有更高壁的更深凹穴将保护胚胎免于上覆生长介质的整体运动。然而，在观察期结束之后胚胎可以被转移到受体患者。因此，更浅的凹穴将有助于容易的胚胎转移。合理的可行折衷似乎是凹穴的深度基本类似于它的宽度，即0.5×到10×胚胎的直径。如图1B中所示可以选择0.3mm的深度和0.2mm的直径。胚胎凹穴的壁是基本垂直的，但是可以略微倾斜以便加宽凹穴的开口和便于胚胎转移，例如如图1B中所示从5到20度。凹穴可以备选地形成圆柱形、盒形、圆锥形、截头或圆锥形等任何合适的形状以容纳显微对象，防止通过操作和环境影响以及诱发的介质整体流动而意外移位。凹穴的尺寸越小显微对象的位置限定越佳。然而，如果凹穴很小在观察期结束时可能很难将显微对象从凹穴转移。 
在一个实施例中凹穴的尺寸具有基本相等的直径和深度。此外，所述凹穴优选地基本居中地设在它们各自的凹陷内。 
载玻片的尺寸优选地例如适配在标准和/或专用显微镜系统和/或培养系统中，例如为25×76mm。 
凹陷和/或凹穴的垂直剖面可以具有包括下列的组中的任何一个的形状：圆 柱形、锥形、圆锥形、缝形、角锥形、梯形、部分圆形或基本圆形。凹陷和/或凹穴的水平剖面可以具有包括下列的组中的任何一个的形状：圆形、椭圆形、矩形、菱形或六角形。 
在图2中显示了根据本发明的第一实施例的设备。所述设备包括显微镜载玻片2，其包括在载玻片材料的顶表面2A中的一系列，即至少两个所述凹陷3a，3b。每个凹陷3a，3b包括横截面比凹陷更小的用于接收和容纳各自显微对象1a，1b和对象介质5a，5b的凹穴4a，4b，每个凹穴和/或凹陷例如具有根据上文的尺寸和/或形状。两个显微对象（即胚胎1a，1b）被插入显微镜载玻片2中，即分别插入每个凹穴4a和4b中。所述对象介质5a，5b可以是用于围绕、容纳和保护所述显微对象的任何合适的介质，例如用于这样的胚胎的细胞生长介质。取决于设备的应用，所述介质5a可以与所述其他介质5b不同或相同。 
如图2和3中所示，所述凹陷3a，3b带有储室6A，6B以用于以这样的方式在所述凹陷3a，3b之间提供公共覆盖层7使得当在所述凹陷和/或凹穴内部提供对象介质5a，5b时介质5a不与介质5b相互流体连通。因此减小了在所述设备的操作期间在不同凹陷和/或凹穴之间溢出对象介质5a，5b的风险，这再次减小了所述显微对象1a，1b之间不利影响的引入，例如当对象是胚胎并且设备是培养皿并且所述胚胎中的一个溶解时。此外，设备的运动可以诱发覆盖层的微小整体运动，但是在所述对象介质内显著减小的运动减小了胚胎随着时间的运动，这在所述对象的显微镜检查和/或培养期间是特别有利的。此外，通过在所述对象介质上提供覆盖层，所述对象介质更好地被保护免于有害环境影响，例如温度、湿度和/或压力变化，并且进一步减小了污染对象和对象介质的风险。 
如图2中所示所述储室作为所述顶表面2A内的公共凹槽6A被提供，其允许形成覆盖层或顶层例如浸油的公共储室。作为替换或作为补充，如图3中所示，显示了所述设备的第二实施例，所述储室是流体连接6B，例如在所述至少两个凹陷3a，3b之间分别连通或不连通外表面的通道或管。因此，用于允许容纳凹陷和凹穴的载玻片的总高度可以减小。 
所述载玻片2带有储室6以用于以这样的方式在所述凹陷3a，3b之间提供公共覆盖层7使得所述介质5a，5b不相互流体连通。 
此外，共用浸渍流体储室（即，公共储室）因此提供容易的操作和培育而不需要生长介质的辅助湿度控制。而且，尺寸相对较大或较深浸渍流体储室分离个 体凹穴和/或凹陷中的介质并且减小来自周围空气中的微粒、气体的污染等的风险。 
每个显微镜载玻片包含一系列凹穴，每个凹穴容纳单一显微对象，例如每个凹穴包含来自相同患者或不同患者的胚胎。通过以这样的方式提供用于分离介质的装置使得在不相互连通的情况下保持每个凹陷中的介质，这减小了介质从一个凹陷和/或凹穴溢出到另一个的风险。此外，特别地，通过为每个对象例如胚胎提供单个介质隔室，这可以防止污染或不利影响，例如如果在附近凹穴中的一个胚胎或细胞培养物将溶解的话。由于每个生物被放置在包含例如由浸油的覆盖层分离的介质的不同凹穴中，有害化合物将很难能够通过疏水油扩散到相邻凹穴。 
对象介质优选地以这样的方式被填充到每个所述凹陷和/或凹穴中，使得在所述介质5a，5b的顶表面的水平不在从所述凹陷到所述储室6的过渡区的水平之上，参见图2和3。所述介质可以是任何合适的材料，例如胚胎生长介质，其他细胞培养介质等液态、柔性、半硬性或硬性介质。培养细胞群的不同介质在本领域中是已知的。培养胚胎的一个例子在PCT申请No.WO2004/056265中被描述。 
此外，浸渍介质例如具有不同粘度的合适的油（例如液态、柔性、半硬性或硬性）的覆盖层可以被提供以至少覆盖容纳待培养和/或显微镜检查的显微对象的每个凹穴或凹陷的上部直径。 
所述对象介质和/或覆盖层可以在这样一种材料中被提供，所述材料的粘度和/或透明度和/或密度是温度可变的，例如当被加热到培养温度时，所述介质和/或层是透明的和/或至少所述层具有比所述介质更高的粘度，和/或所述介质具有比所述层更高的密度。 
如图4中所示，所示凹穴4a，4b和/或所述凹陷1a，1b的提供和提供相对均匀的载玻片材料总厚度（参见图4和6）导致的事实在于载玻片的底表面2B具有的底表面型面20对应于至少所述凹穴和/或所述凹陷在所述载玻片2上的轮廓。当该设备被插入具有对应于所述底表面型面20的上表面的载玻片座中时这是有利的，所述载玻片座例如可以设在例如培养和/或显微镜检查系统内，这将在下面结合图10进一步进行论述。根据本发明的一个或多个设备可以带有相同的独特底部形貌以用于与包括一个以上设备和/或适于随着时间互换一个或多个所述设备的大型系统配合。 
因此，在一个实施例中培养载玻片的非平面底表面型面匹配固定载玻片的可 选加热铝座的轮廓使得凹穴被插入铝座中的凹陷中。 
如图4中所示，在设备的一个实施例中所述型面20的至少一部分带有导热层23a，23b，优选地至少形成所述凹穴的底表面的一部分。因此，当布置所述设备用于连接到热源时，胚胎的受控恒温环境可以长时期被提供和保持，这减小了执行所述胚胎的快速分析的必要性并易于对其进行操作。所述导热层可以是金属例如铝或钢。 
优选地，所述导热层23适于连接到热源，例如所述热源可以设在培养箱和/或显微镜检查器械中。 
在图4中，所述导热层23a和23b沿着凹穴的基本平面底部设在底表面型面上，并且保证胚胎由供热环境包围。备选地或作为补充，所述层23围绕所述凹穴的壁的底表面型面被提供，所述设备包括带有凹陷的一次性培养载玻片，所述凹陷容纳处在合适介质中的生物。 
备选地或作为补充，所述导热层23提供载玻片2的上表面2A的至少一部分，优选凹穴4a，4b和/或凹陷3a，3b的内表面的至少一部分。 
凹穴和/或所述导热层的底部分优选地是平面的和透明的，例如通过使所述导热层23a，23b带有合适布置的通孔以保证从下面或上面例如使用标准或反向显微镜检查和/或图形采集和/或分析无阻碍地监测胚胎。 
如图5中所示所述设备的一部分带有操作突出部（70），所述部分是所述顶表面2A内的合适位置和范围；备选地或作为补充所述部分是所述底部分2B。在所述载玻片的侧部分上提供所述操作突出部是可能的。在设备中所述操作突出部70的至少一部分垂直向上和/或向下从所述载玻片延伸。所述操作突出部70优选地可以包括翼片，例如带有除了载玻片的侧面之外的另外一个延伸部或多个延伸部，其中所述操作突出部70设在导热材料和/或聚合物材料中。 
优选地，所述操作突出部70被布置用于在其上提供识别标签（未显示）。 
通过布置操作突出部本发明提供了易于操作和插入载玻片而没有任何污染风险的装置。当载玻片被放置在载玻片座中时操作突出部是尤其重要的。在一个实施例中，由于载玻片座和载玻片底部的匹配轮廓，载玻片必须垂直地被插入载玻片座中。在载玻片上没有好的把手的情况下这是困难的。在一个优选实施例中操作突出部并不干扰盖，并且接触操作突出部不会象通常通过接触侧面操作载玻片那样构成污染风险。 
如图6中所示，在设备中设有一系列凹陷3a，3b，其中所述凹陷（3a，3b）沿至少一个方向相互等距地被定位，易于定位在其上执行的测量和在监测/培养期间的操作。 
如图7中所示，所述凹穴4a，4b和/或所述凹陷（3a，3b）的内表面的至少一部分由聚合物制造，优选地基本整个显微镜载玻片2由聚合物制造，其中所述聚合物可以是具有低胚胎毒性的聚酯，例如PEN、PETg和/或PET，该低胚胎毒性可以归因于聚合物内的细胞毒性化合物的高度内部固定性。 
如图7中所示，在凹穴的所述基本平面底表面之中和/或之上和/或在所述底表面型面之中和/或之上和/或在所述凹穴的所述透明底部分内还设有个体凹穴标识41，其优选地在更高分辨率下例如在显微镜检查特别是反向显微镜检查期间可见。 
图8是带有高导电材料例如铝的载玻片或设备。 
图9是适于固定四个独立载玻片或设备的铝制载玻片座臂的实验室试验设备。 
设备载玻片优选地适于放置在这样一种系统中，所述系统提供生物的温度环境（温度、气体组成、湿度等）并且允许通过摄像术进行生物的无人照管监测、代谢的测量等。 
1）所述系统优选地提供 
a．通过器械中的铝座和插入载玻片的匹配轮廓的温度控制。位于每个孔中的生物因此由导热金属围绕并且因此在受控环境中。 
b．载玻片和载玻片座的匹配轮廓之间的紧密配合保证了当载玻片居于座中时容易以μm精度定位载玻片。所以即使在去除和再插入载玻片之后也可能进行无人照管显微镜检查。 
c．胚胎和载玻片的自动定位是时滞图像的自动采集的先决条件。 
如图10中所示，本发明还涉及一种被布置用于执行至少两个显微对象1a，1b的显微镜检查和/或培养的系统，包括如上所述根据本发明的设备以及用于固定所述设备的定位装置。优选地显微镜和所述定位装置被布置用于将所述设备定位在显微镜之下或相对于其被定位。所述系统还可以包括适合于提供培养所述至少两个显微对象（1a，1b）温度的热源，和被布置用于相对于所述热源定位设备所述定位装置。所述定位装置包括载玻片座，所述载玻片座优选地适于匹配至少 对应于至少所述至少两个凹穴的轮廓的所述底表面型面，并且可以作为用于手动和/或自动监测和分析的培养和/或监测系统中的载玻片座被提供。 
该系统还可以带有适于将指定稳定温度提供给至少所述凹穴的导热层，所述温度适合于培养，尤其是培育所述至少两个显微对象。 
所述热源可以作为载玻片座被提供，其适于匹配至少对应于至少所述至少两个凹穴的轮廓的所述底表面型面。优选地所述载玻片座作为导热臂被提供，优选地由金属例如铝、钢等制造。 
在另一个系统中所述设备的底表面型面（23）带有适于连接到所述热源的导热层。 
所述显微镜还可以包括成像装置，例如照相机或视频设备。定位装置还可以包括 
-延伸通过载玻片座的至少一个垂直孔； 
-提供垂直光的光发射器，例如激光器； 
-相对于光发射器在显微镜载玻片（2）的相对侧的光传感器，当载玻片座处于用于显微镜检查的正确位置时用于感测发射的光。 
定位装置还包括用于相对于所述显微镜和/或所述热源定位所述设备的控制单元。 
控制单元还可以适于为稳定的培育箱环境控制所述热源的温度，和/或适于使用所述成像装置监测和/或采集所述显微对象的图像，和/或为了所述对象的质量评价分析所述图像，和/或记录更换载玻片。 
在另一个实施例中系统还包括用于执行代谢活动的无创测量的装置，所述装置包括用于测量例如pH、氧含量等的微传感器。 
系统优选地包括用于固定如上所述的一个以上设备的装置，例如能够固定几个设备例如4或6个设备的载玻片座。 
系统优选地是气体培育箱的组合，例如三元气体培育箱和用于无人照管图像采集的数字显微镜。系统可以被看作带有内装显微镜的培育箱或带有内装培育箱的显微镜。 
在一个优选实施例中系统包括： 
1）恒温铝臂，其被设计为适合聚合物载玻片特有的底部形貌以保证胚胎由导热铝围绕。 
2）能够通过使用微传感器执行代谢活动的无创测量的装置。一个例子是使用氧微电极测量氧呼吸或使用pH微传感器测量CO2浓度。传感器的精确定位由载玻片座中的微孔和照射传感器尖端的垂直激光器保证。载玻片座垂直地移动直到传感器尖端由穿过孔的激光照射，然后测量载玻片座的X-Y坐标。然后载玻片座移动直到微孔居中于照相机系统的视野中并且测量新的X-Y坐标。两次观察之间的坐标差是照相机与传感器尖端之间的偏移的量度。偏移然后可以用于将居中于照相机视野中的可见对象移动到传感器尖端，即通过使用偏移有可能将关心对象从图像采集位置无人照管移动到微传感器定型位置。 
3）能够操作一个以上设备（即同时来自一个以上患者的生物/细胞/胚胎）的装置。本发明将容易地操作总共带有48到60个生物的四个或五个不同载玻片。 
4）无人照管监测生物的控制软件采集和分析图像并且提供内部生物的质量分析。软件接受新皿的加入和其他的终止而不影响正在进行的测量。 
使用的软件例如可以包括如WO2007/042044和WO2007/144001中所述的方法。 
在用于监测定位在设备的凹陷中的对象的自动系统中重要的是能够定位显微镜和采集对象的图像几次而不失去每个对象的追踪，即重要的是每个对象可以在监测和采集图像的每个间期唯一地被识别，以便提供对象的任何变化的信息。所以，在又一个实施例中本发明涉及一种用于监测和/或培养至少两个显微对象（1a，1b）和对象介质（5a，5b）的设备，包括：载玻片（2），包括在其顶表面（2A）中的至少两个凹陷（3a，3b）；其中所述载玻片包括用于唯一地识别每个凹陷的装置。优选的是唯一标识是机器可读的，并且此外优选的是唯一标识可以自动被记录。 
由于显微镜用于成像对象，于是优选的是唯一标识在用于成像对象的放大率下可读。因此，优选的是每个凹陷的唯一标识小于1.5mm，例如1mm或以下。更优选的是唯一标识被布置为使得它可以在与它涉及的显微对象相同的图像视野中被成像。 
用于唯一识别每个凹陷的装置可以以几种方式实现： 
-通过使设备带有定位装置使得它可以相对于显微镜和照相机被定位在仅仅一个唯一位置，例如能够啮合载玻片座的相应部分的凹槽或突出部分，或者定位装置包括载玻片上的标记，由此确定每个凹陷相对于所述标记的位置。 
-通过提供关于载玻片的X-Y位置信息，例如在所述载玻片用于识别凹陷行的至少一个标记和用于识别凹陷列的至少一个标记。 
-通过提供关于每个凹陷的个体识别标记，例如在凹穴的所述基本平面底表面之中和/或之上和/或在所述底表面型面之中和/或之上和/或在所述凹穴的所述透明底部分内的个体凹穴标识（41）。 
如显示根据本发明的载玻片或设备的部分的顶侧图像的11A和11B中所示，还可以以印刷、模塑或雕刻字母、符号或数字的形式在凹穴的所述基本平面底表面之中和/或之上和/或在所述底表面型面之中和/或之上和/或在所述凹穴和/或所示凹陷的所述透明底部分内设有个体凹穴标识41。 
胚胎的选择或识别。本发明还允许选择胚胎进行移植的应用。该方法意味着胚胎用如上所述用于确定胚胎的变化的方法进行监视以便确定何时发生了细胞分裂和可选地是否发生了细胞死亡以及细胞分裂的质量和胚胎的总体质量。优选的是选择具有导致差异图像中的尖锐极值的基本同步细胞分裂的胚胎，更优选的是选择没有细胞死亡的胚胎。 
选择或识别方法可以与如上所述的其他测量组合以便评估胚胎的质量。胚胎的形态学评估的重要标准是：（1）胚胎的形状，包括卵裂球的数量和断裂的程度；（2）透明带的存在和质量；（3）大小；（4）颜色和质地；（5）胚胎关于其发育阶段的的年龄的知识，和（6）卵裂球膜完整性。 
每个凹陷（3a，3b）和/或凹穴（4a，4b）的尺寸可以适于选择的应用。 
在一个实施例中布置用于执行至少两个显微对象的显微镜检查和/或培养的系统，包括用于操作至少两个显微对象和对象介质的设备，所述设备包括显微镜载玻片，所述显微镜载玻片包括在其顶表面上的至少两个凹陷；每个凹陷包括横截面比所述凹陷更小的凹穴以用于容纳各个显微对象和对象介质，其中至少所述凹穴具有对应于其在所述载玻片上的轮廓的底表面型面；其中所述系统还带有包括载玻片座的定位装置，所述载玻片座适于匹配至少对应于至少所述至少两个凹穴的轮廓的所述底表面型面。 
载玻片和载玻片座的匹配轮廓之间的紧密配合保证了当载玻片居于座中时容易以μm精度定位载玻片。所以即使在去除和再插入载玻片之后也可能进行无人照管显微镜检查。因此，在这样的载玻片中将显微对象定位在可以进行例行检查、操作和/或自动摄像的限定点。 
在另一方面中本发明涉及一种用于操作如上所述的设备的方法，包括通过使至少对应于至少所述至少两个凹穴的轮廓的所述设备的所述底表面型面（20）匹配包括所述系统的载玻片座的相应定位装置将所述设备定位在根据本发明的系统内的步骤。 
此外，本发明涉及一种用于在系统中显微镜检查和/或培养如上所述的设备中的对象的方法，包括将设备相对于其定位在显微镜和/或热源之下的步骤，所述热源适合于为培养所述至少两个显微对象（1a，1b）提供温度。 
在一个实施例中所述方法还包括使至少对应于至少所述至少两个凹穴的轮廓的所述设备的所述底表面型面（20）匹配包括所述系统的载玻片座的相应定位装置的步骤。可以通过基本水平地保持显微镜载玻片的顶表面和将载玻片移动到载玻片座之上的位置并且将载玻片垂直向下下降到所述载玻片座上执行匹配的步骤。 
执行所述至少两个显微对象（1a，1b）的显微镜检查的步骤可以手动地或自动地，并且相继地或基本同时地执行。 
提供培养温度的步骤优选地通过将所述导热层连接到所述热源将指定稳定温度提供给至少所述凹穴，所述温度适合于培养，尤其是培育所述至少两个显微对象。所述热源可以连接到所述载玻片、所述载玻片座和/或所述突出部。 
所述方法还可以包括在某个时期为导热层提供适合于培养的预定温度的步骤。 
所述方法还包括以下步骤：以这样的方式在至少每个所述凹穴（4a，4b）中提供对象介质（5a，5b）使得所述介质（5a，5b）不相互流体连通； 
-在所述至少两个凹穴（4a，4b）的每一个中提供显微对象（1a，1b）； 
-以这样的方式在所述至少一个储室（6）内提供公共覆盖层（7）使得所述介质（5a，5b）不相互流体连通；和 
-执行所述至少两个显微对象的显微镜检查和/或培养。 
公共覆盖层可以是流体、半固体和/或固体，并且优选地在培养温度期间是流体。此外，对象介质可以是流体、半固体和/或固体，并且优选地在培养温度期间是流体。 
显微对象（1a，1b）例如是显微生物，例如生长细胞培养物，尤其是发育胚胎。在一个优选实施例中显微生物选自包含下列的组：体外细胞培养物，例如单 细胞培养物，胚胎，例如卵母细胞、胚胎、胚细胞、细胞核等，和/或细菌，生物样本和它们的任何组合。 
优选地通过沿X，Y和/或Z方向操作所述操作突出部（70）和/或所述载玻片座进行手动和/或自动定位来执行定位所述设备的步骤。因此，在一个实施例中定位步骤还包括相对于所述显微镜和/或所述热源使用所述控制单元自动定位所述设备，例如其中定位步骤还包括： 
-发射光，例如激光以用于提供至少一个垂直光束， 
-相对于所述显微镜和/或所述热源定位所述载玻片直到所述至少一个光束穿过延伸通过载玻片座的所述至少一个垂直孔并且由在显微镜载玻片的相对侧的所述传感器感测。 
根据本发明的方法还可以包括使用例如上述和在WO2007/042044和WO2007/144001中所述的所述照相机和/或视频设备监测和/或提供所述载玻片的图像的步骤。 
此外，根据本发明的方法可以包括测量照相机与传感器尖端之间的偏移的步骤。 
在另一个实施例中根据本发明的方法还可以包括为稳定的培育箱环境控制所述热源的温度的步骤，和/或使用所述成像装置监测和/或采集所述显微对象的图像的步骤，和/或为了所述对象的质量评价分析所述图像，和/或记录更换载玻片。 
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Claims (52)

1.一种用于监测和/或培养至少两个显微对象（1a，1b）和对象介质（5a，5b）的设备，包括：
-载玻片（2），包括在其顶表面（2A）中的至少两个凹陷（3a，3b）；
-其中每个凹陷（3a，3b）包括横截面比所述凹陷更小的凹穴（4a，4b）以用于容纳各个显微对象（1a，1b）和对象介质（5a，5b），
-所述载玻片（2）带有储室（6）以用于以这样的方式在所述凹陷（3a，3b）之间提供公共覆盖层（7）使得所述介质（5a，5b）不相互流体连通。
2.根据权利要求1所述的设备，其中所述载玻片包括用于唯一地识别每个凹陷的装置。
3.根据权利要求1或2所述的设备，其中至少所述凹陷（3a，3b）和/或所述凹穴（4a，4b）具有对应于其在所述载玻片（2）上的轮廓的底表面型面（20）；所述型面（20）的形貌适于匹配载玻片座的相应形貌。
4.根据权利要求3所述的设备，其中所述底表面型面（20）的至少一部分带有导热层（23a，23b）。
5.根据权利要求1或2所述的设备，其中所述设备的至少一部分带有操作突出部（70）。
6.根据权利要求1或2所述的设备，其中所述储室（6）是所述顶表面（2A）内的公共凹槽（6A）。
7.根据权利要求1或2所述的设备，其中所述储室（6）是所述至少两个凹陷（3a，3b）之间的流体连接（6B）。
8.根据权利要求1或2所述的设备，其中所述凹陷具有对应于其在所述载玻片（2）上的轮廓的底表面型面（20）；所述型面（20）带有导热层（23）。
9.根据权利要求4所述的设备，其中所述导热层（23）是金属。
10.根据权利要求9所述的设备，其中所述导热层（23）是铝或钢。
11.根据权利要求4所述的设备，其中所述导热层（23）适于连接到热源。
12.根据权利要求4所述的设备，其中所述导热层（23）提供载玻片（2）的顶表面（2A）的至少一部分。
13.根据权利要求12所述的设备，其中所述导热层（23）提供凹穴（4a，4b）和/或凹陷（3a，3b）的内表面的至少一部分。
14.根据权利要求5所述的设备，其中所述顶表面（2A）和/或所述底部分（2B）的至少一部分带有所述操作突出部（70）。
15.根据权利要求5所述的设备，其中所述操作突出部（70）的至少一部分从所述载玻片垂直向上和/或向下延伸。
16.根据权利要求5所述的设备，其中所述操作突出部（70）包括翼片。
17.根据权利要求5所述的设备，其中所述操作突出部（70）在导热材料和/或聚合物材料中被提供。
18.根据权利要求5所述的设备，其中所述操作突出部（70）被布置用于在其上提供载玻片识别标签。
19.根据权利要求1或2所述的设备，其中所述凹穴（4a，4b）和/或所述凹陷（3a，3b）的内表面的至少一部分由聚合物制造。
20.根据权利要求1或2所述的设备，其中整个载玻片（2）由聚合物制造。
21.根据权利要求17所述的设备，其中所述聚合物是聚酯。
22.根据权利要求21所述的设备，其中所述聚合物是PEN、PETG和/或PET。
23.根据权利要求1或2所述的设备，其中显微对象（1a，1b）是显微生物。
24.根据权利要求23所述的设备，其中显微对象（1a，1b）是生长细胞培养物。
25.根据权利要求23所述的设备，其中显微对象（1a，1b）是发育胚胎。
26.根据权利要求1或2所述的设备，其中设有一系列凹陷（3a，3b）。
27.根据权利要求26所述的设备，其中所述凹陷（3a，3b）沿至少一个方向相互等距地被定位。
28.根据权利要求1或2所述的设备，其中每个凹陷（3a，3b）和/或凹穴（4a，4b）的尺寸适于选择的应用。
29.根据权利要求1或2所述的设备，其中凹陷和/或凹穴的垂直剖面具有包含下列的组中的任何一个的形状：圆柱形、锥形、圆锥形、缝形、角锥形、梯形、部分圆形或圆形或它们的任何组合。
30.根据权利要求1或2所述的设备，其中凹陷和/或凹穴的水平剖面具有包含下列的组中的任何一个的形状：圆形、椭圆形、矩形、菱形或六角形或它们的任何组合。
31.根据权利要求1或2所述的设备，其中所述凹陷还包括漏斗形状的平滑底部分以用于将所述显微对象引导到所述凹穴中，所述漏斗的形状选自水平剖面组成的组。
32.根据权利要求1或2所述的设备，其中凹穴的尺寸具有相等的直径和深度。
33.根据权利要求1或2所述的设备，其中凹陷的尺寸具有相等的直径和深度。
34.根据权利要求1或2所述的设备，其中凹穴（4；4a，4b）的尺寸被选择为与凹陷（3；3a，3b）的尺寸相比相对较小，并且与待监测/培养的对象的尺寸相比，为1.1倍到10倍对象的直径。
35.根据权利要求34所述的设备，其中凹穴（4；4a，4b）的尺寸与待监测/培养的对象的尺寸相比，为1.5倍到3倍待监测/培养的对象的直径。
36.根据权利要求1或2所述的设备，其中取决于应用，所述至少两个凹陷的直径在1到25mm之间。
37.根据权利要求36所述的设备，所述至少两个凹陷的直径在2到5mm。
38.根据权利要求36所述的设备，所述至少两个凹陷的直径为4.0mm。
39.根据权利要求1或2所述的设备，其中每个所述凹穴居中地设在它们各自的凹陷内。
40.根据权利要求1或2所述的设备，其中每个凹穴的底部分是平面的。
41.根据权利要求1或2所述的设备，其中每个凹穴的至少底部分是透明的。
42.根据权利要求1或2所述的设备，其中载玻片的尺寸使得适配在标准和/或专用显微镜系统和/或培养系统中。
43.根据权利要求42所述的设备，其中载玻片的尺寸为25×76mm。
44.根据权利要求1或2所述的设备，其中所述至少一个凹陷的底部分带有表面平滑漏斗，相对于水平线具有5到60度的角。
45.根据权利要求44所述的设备，其中所述漏斗相对于水平线具有10到45度的角。
46.根据权利要求44所述的设备，其中所述漏斗相对于水平线具有15到35度的角。
47.根据权利要求44所述的设备，其中所述漏斗相对于水平线具有25到30度的角。
48.根据权利要求2所述的设备，其中所述用于唯一地识别每个凹陷的装置包括在所述载玻片的至少一个定位标记。
49.根据权利要求48所述的设备，其中所述至少一个定位标记是能够啮合载玻片座上的相应部分的凹槽或突出部分。
50.根据权利要求2所述的设备，其中所述用于唯一地识别每个凹陷的装置包括在所述载玻片用于识别凹陷行的至少一个标记和用于识别凹陷列的至少一个标记。
51.根据权利要求2所述的设备，其中所述用于唯一地识别每个凹陷的装置在凹穴的所述平面底表面之中和/或之上，和/或在所述底表面型面之中和/或之上，和/或在所述凹穴的所述透明底部分内提供个体凹穴标识（41）。
52.根据权利要求2所述的设备，其中所述用于唯一地识别每个凹陷的装置由靠近凹穴（4a，4b）放置的显微数字组成，使得在分析显微镜中操作期间可以看到它们。
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