CN109628275A - 丝状真菌的改良小培养装置及其培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种丝状真菌的改良小培养装置及其培养方法；所述装置包括装载玻片，盖玻片和湿盒；所述装载玻片中间设有中央凹槽，所述中央凹槽外环设有外围凹槽，所述外围凹槽具有主体凹槽、位于主体凹槽的边角且与装载玻片边缘相连通的第一延伸槽，以及与所述第一延伸槽成对角的第二延伸槽。本发明的装置将真菌培养空间压缩在狭窄的玻片内，限制了染液流动的速度，真菌生长可呈现在一个平面内，丝状真菌染色后的形态结构能够得到较好的保护，且平面成像清晰，显微镜下观察真菌的形态效果较好。

Description

丝状真菌的改良小培养装置及其培养方法

技术领域

本发明涉及一种丝状真菌的改良小培养装置及其培养方法。

背景技术

小培养：即玻片培养，是相对于用培养皿或试管进行真菌大培养的方法而言，小培养能够有效地观察真菌产孢现象。

自1932年Emile Rivalier和S.Seydel发明了小培养技术后，小培养技术不断得到改进，目前国内钢圈法小培养和方块法小培养较常用，但基本都是在载玻片平面上捕获真菌。

现有的小培养装置中真菌生长的空间较大，真菌生长时不易粘附在载玻片上，且染色时染液的流动极易破坏丝状真菌的形态、结构，在显微镜下不易观察到完整的真菌平面图像。

通过对现有专利文献的检索发现，申请号为201721012846.2的中国实用新型专利公开了一种大型真菌菌丝培养载玻片，包括：载玻片和培养巢；所述载玻片中央设置有培养巢；所述载玻片长和宽是76x26mm；所述培养巢长4cm、宽2cm、深0.05cm，该巢能容纳PDA培养基400微升。该大型真菌菌丝培养载玻片能够在载玻片上的培养巢培养菌丝，并且靠中间的培养巢来确定培养基的厚度，使菌丝在培养巢上面自然生长蔓延，培养出的菌丝比较薄，适合显微观察；同时能提高显微观察大型真菌菌丝的效果，使观察效果更清晰。然而，此装置的适用对象是大型真菌，虽然在培养皿中培养时是密闭式操作，但真菌的生长仍然是开放式的，若用于临床病原性丝状真菌的培养，则揭开培养皿盖镜检观察时会破坏丝状真菌的培养环境，导致污染环境，生物安全风险太大，不符合生物安全要求；培养过程中丝状真菌菌丝高出培养巢时才能粘附在载玻片上，培养巢上方菌丝产孢量远远多于载玻片上的菌丝产孢量，因此，观察丝状真菌粘附在载玻片上的孢子形态、孢子排列方式还需要排除培养巢上方丝状真菌和观察方法的干扰：直接将载玻片置于显微镜下观察不符合生物安全要求，在培养巢上方加盖片镜检又会引起盖片对孢子排列方式的破坏；400微升培养基相对于微型丝状真菌来说仍然量很大，丝状真菌产孢的时间缩短的机率不大；由于生物安全的要求，载玻片上菌丝产孢过程不能每日显微镜下进行病原性丝状真菌的观察等。

申请号为201210001981.2的中国发明专利申请公开了一种用于丝状真菌显微形态观察的制片方法；首先在水琼脂培养平板上挖取一个凹槽，移除凹槽内的培养基；再将一块尺寸小于凹槽的水琼脂培养基块放置在凹槽内，挑取待鉴定真菌培养物接种于位于凹槽内的水琼脂培养基块朝上的一面，然后将无菌盖玻片盖于水琼脂培养基块上；盖上培养皿盖，密封后于室温下培养，培养结束后取出盖玻片，制作成真菌的观察载玻片。然而，此方法两次切割琼脂块，尤其是将0.4×0.4cm大小琼脂块置于1.6×1.6cm大小琼脂块空缺中的操作，技术要求较高，容易造成其它微生物的污染；20ml培养基倾注于9cm直径大小的培养皿中会产生3～4cm大小的琼脂厚度，若直接显微镜下观察，会出现明显的真菌菌体立体图像，真菌菌体的平面成像感差；充足的营养物质(培养基)不能缩短丝状真菌产孢的时间；将盖片从培养基上揭离和将盖片重新置于载玻片上都会对孢子的排列方式造成破坏，影响丝状真菌的识别。

发明内容

本发明的目的在于克服现有的小培养装置在显微镜下不易观察到完整的真菌平面图像的缺陷，提供一种丝状真菌的改良小培养装置及其培养方法。本发明将真菌培养空间压缩在狭窄的玻片内，限制了染液流动的速度，真菌生长可呈现在一个平面内，丝状真菌染色后的形态结构能够得到较好的保护，且平面成像清晰，显微镜下观察真菌的形态效果较好。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

第一方面，本发明涉及一种丝状真菌的改良小培养装置，所述装置包括装载玻片，盖玻片和湿盒；所述装载玻片中间设有中央凹槽，所述中央凹槽外环设有外围凹槽，所述外围凹槽具有主体凹槽、位于主体凹槽的边角且与装载玻片边缘相连通的第一延伸槽，以及与所述第一延伸槽成对角的第二延伸槽。

优选的，所述外围凹槽的深度小于中央凹槽的深度。

更优选的，所述外围凹槽的深度与中央凹槽的深度的比值为0.04～0.06:0.3～0.4。

优选的，所述装载玻片的厚度为10～13mm，中央凹槽深度为0.6～0.8mm，外围凹槽深度为0.08～0.12mm。

更优选的，所述装载玻片的厚度为11.5mm，中央凹槽深度为0.7mm，外围凹槽深度为0.1mm。

优选的，所述装载玻片为矩形玻片，其长度为23～25mm，宽度为23～25mm。

优选的，所述中央凹槽为矩形凹槽，其长度为8～10mm，宽度为4～6mm。

优选的，所述主体凹槽为矩形，其长度为15～17mm，宽度为15～17mm；所述第一延伸槽的宽度为1～2mm，长度为4.5～5mm；所述第二延伸槽的槽宽为4～5mm。

优选的，所述第一延伸槽垂直于中央凹槽的长边；所述第二延伸槽与中央凹槽长边的延长线的夹角为130度～140度。更优选，所述第二延伸槽与中央凹槽长边的延长线的夹角为135度。

优选的，所述第二延伸槽具有平行于主体凹槽的边缘；所述边缘与邻近的装载玻片边缘的距离为1～1.5mm。

优选的，所述盖玻片为大小能覆盖住所述主体凹槽，且不超出装载玻片边缘的玻片。

第二方面，本发明还涉及一种所述的丝状真菌的改良小培养装置进行丝状真菌培养及显微形态观察的方法，所述方法包括如下步骤：

S1、取融化的琼脂真菌培养基15～30μL，注入装载玻片中央的中央凹槽中；

S2、待琼脂真菌培养基冷却后，加入4～6μL无菌蒸馏水；

S3、倾斜装载玻片，使无菌蒸馏水全部浸润中央凹槽中的琼脂真菌培养块后，在琼脂真菌培养块的右下角点种待测真菌；

S4、盖上盖玻片，在所述盖玻片的四角用粘结剂固封后，放入湿盒中25℃～35℃培养；

S5、待达到真菌出现典型结构或达到试验预设目的后，用乳酸酚棉兰染液沿装载玻片和盖玻片间缝隙缓慢加入；

S6、待镜下真菌图片达到预设效果后，用粘结剂将盖玻片和装载玻片间的缝隙密封，保存。

优选的，所述待测真菌为毛霉目、镰刀菌、曲霉菌或赛多孢。

优选的，所述琼脂真菌培养基选用PDA培养基。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1)本发明的装置中，装载玻片中间设中央凹槽，在中央凹槽外环设深度小于中央凹槽深度的外围凹槽；这样的设置刚好够真菌生长，而且生长的足够平整，使得真菌生长可呈现在一个平面内，丝状真菌染色后的形态结构能够得到较好的保护；

2)本发明的装置中，外围凹槽上设有成对角关系的第一、二延伸槽，是为真菌培养提供充足的气体通道，以及染液填充时避免气体形成空泡阻止染液渗入中央凹槽内。同时，通过二者尺寸角度的适配，还起到更好的限制染液流动的速度的作用，从根本上避免了丝状真菌的形态、结构被破坏；

3)可根据需求自已选择培养基，现用现配，制作方便；

4)所需培养基、染液量均为微量，耗材成本低；

5)整个操作过程为开放式接种、封闭式培养，符合生物安全要求；

6)可在显微镜下观察真菌的动态生长状态、染色变化；

7)使用本发明的装置培养真菌，镜下图像清楚，染色后能够容易获得完整的真菌典型形态结构；

8)使用本发明的装置，封片后真菌形态能够保存较长时间；

9)使用本发明的装置进行真菌培养，可加快真菌产孢速度，部分赛多孢菌、镰刀菌、曲霉菌1天即可见产孢；

10)使用本发明的装置进行真菌培养，连续培养丝状真菌1天后，仍可见部分真菌生长。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为装载玻片的结构示意图；

图2为装载玻片上点种待测真菌的位置示意图；

图3为装载玻片的截面示意图；

图4为盖玻片加盖在装载玻片上的位置示意图；

图5为采用本发明的培养装置观察到的共头霉(毛霉目)的显微照片；

图6为采用本发明的培养装置观察到的镰刀菌的显微照片；

图7为采用本发明的培养装置观察到的曲霉菌的显微照片；

图8为采用本发明的培养装置观察到的赛多孢的显微照片；

其中，1为中央凹槽；2为外围凹槽，3为第一延伸槽，4为第二延伸槽。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1

本实施例涉及一种丝状真菌的改良小培养装置及其培养方法；该装置由装载玻片，盖玻片和湿盒组成。

如图1、3所示，所述装载玻片中间设有中央凹槽1，所述中央凹槽1外环设有外围凹槽2，所述外围凹槽2具有主体凹槽、位于主体凹槽的边角且与装载玻片边缘相连通的第一延伸槽3，以及与所述第一延伸槽3成对角的位于主体凹槽的另一侧边角的第二延伸槽4，所述第一延伸槽3、第二延伸槽4的作用是为真菌培养提供充足的气体通道，以及染液填充时避免气体形成空泡阻止染液渗入凹槽内；此外，因第一延伸槽所在的中央凹槽和外周凹槽的形成的空间较窄，为避免真菌沿第一延伸槽生长，故第一延伸槽槽道较窄。

所述盖玻片为大小能覆盖住所述主体凹槽，且不超出装载玻片边缘的玻片，如图4；在本实施例中，装载玻片为矩形玻片，其长度为24mm，宽度为24mm；盖玻片尺寸为22mm×22mm大小。

所述湿盒包括目前国内使用的任何可提供湿度环境的装置。

作为本实施例装置的一个优选方案，装载玻片的整体厚度为11.5mm，中央凹槽深度为0.7mm，外围凹槽生长区域深度0.1mm，刚好够真菌生长，而且足够平整。

在本实施例中，中央凹槽为矩形凹槽，其长度为9mm，宽度为5mm；主体凹槽为正方形，边长为16mm；第一延伸槽的宽度为1.5mm，长度为4.75mm，垂直于中央凹槽的长边；；第二延伸槽的槽宽为4.5mm，第二延伸槽与中央凹槽长边的延长线的夹角为135度，且第二延伸槽具有平行于主体凹槽的边缘；所述边缘与邻近的装载玻片边缘的距离为1.2mm。本实施例通过各凹槽、延伸槽尺寸的合理设置，能够更好的将真菌培养空间压缩在狭窄的玻片内，限制了染液流动的速度，真菌生长可呈现在一个平面内，丝状真菌染色后的形态结构能够得到较好的保护。

本实施例涉及的丝状真菌的改良小培养方法需借助上述丝状真菌的改良小培养装置，即在本实施例的装置的凹槽玻片的中央凹槽处装载真菌培养基，接种真菌样本后，用盖玻片完全覆盖外围凹槽，固定后将接种真菌的玻片置于湿盒中，进行真菌培养。

具体培养的步骤如下：

1、取融化的真菌培养基(常用为PDA)15～30μL，用加样枪注入装载玻片中央的小槽中(图1)；

2、待琼脂(真菌培养基)稍冷却后，加入5μL无菌蒸馏水；

3、稍倾斜玻片，使无菌蒸馏水全部浸润小槽中琼脂块后，在琼脂块的右下角(图2中a位置)点种待测真菌；

4、盖上盖玻片后，在盖玻片的四角外用指甲油固封(图4中的b、c、d)；

5、将步骤4处理后的已接种待测菌株的玻片(加盖盖玻片的装载玻片)置于湿盒中25℃和/或35℃培养。

6、每日观察真菌生长情况，待达到真菌出现典型结构或检测者认为符合自己试验目的后，用乳酸酚棉兰染液沿装载玻片和盖玻片间缝隙逐滴(建议1μL)缓慢加入，至镜下图片达到满意效果为止。

7、待镜下真菌图片达到满意效果后，可用指甲油将盖玻片和装载玻片间的缝隙全部密封、保存。

使用本发明的装置进行真菌培养，可加快真菌产孢速度，部分赛多孢菌、镰刀菌、曲霉菌1天即可见产孢；连续培养丝状真菌1天后，仍可见部分真菌生长。检测时发现，本发明的装置对于生长较快的真菌镜下成像效果较好(如毛霉目、镰刀菌、曲霉菌、赛多孢等)。

图5、6、7、8为分别采用本发明的培养装置观察到的共头霉(毛霉目)、镰刀菌、曲霉菌、赛多孢的显微照片；由图5、6、7、8可知，真菌生长呈现在一个平面内，丝状真菌染色后的形态结构能够得到较好的保护，且平面成像清晰。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (10)

1.一种丝状真菌的改良小培养装置，其特征在于，所述装置包括装载玻片，盖玻片和湿盒；所述装载玻片中间设有中央凹槽，所述中央凹槽外环设有外围凹槽，所述外围凹槽具有主体凹槽、位于主体凹槽的边角且与装载玻片边缘相连通的第一延伸槽，以及与所述第一延伸槽成对角的第二延伸槽。

2.根据权利要求1所述的丝状真菌的改良小培养装置，其特征在于，所述装载玻片的厚度为10～13mm，中央凹槽深度为0.6～0.8mm，外围凹槽深度为0.08～0.12mm。

3.根据权利要求2所述的丝状真菌的改良小培养装置，其特征在于，所述装载玻片的厚度为11.5mm，中央凹槽深度为0.7mm，外围凹槽深度为0.1mm。

4.根据权利要求1所述的丝状真菌的改良小培养装置，其特征在于，所述装载玻片为矩形玻片，其长度为23～25mm，宽度为23～25mm。

5.根据权利要求1所述的丝状真菌的改良小培养装置，其特征在于，所述中央凹槽为矩形凹槽，其长度为8～10mm，宽度为4～6mm。

6.根据权利要求1所述的丝状真菌的改良小培养装置，其特征在于，所述主体凹槽为矩形，其长度为15～17mm，宽度为15～17mm；所述第一延伸槽的宽度为1～2mm，长度为4.5～5mm；所述第二延伸槽的槽宽为4～5mm。

7.根据权利要求6所述的丝状真菌的改良小培养装置，其特征在于，所述第一延伸槽垂直于中央凹槽的长边；所述第二延伸槽与中央凹槽长边的延长线的夹角为130度～140度。

8.根据权利要求6所述的丝状真菌的改良小培养装置，其特征在于，所述第二延伸槽具有平行于主体凹槽的边缘；所述边缘与邻近的装载玻片边缘的距离为1～1.5mm。

9.根据权利要求1所述的丝状真菌的改良小培养装置，其特征在于，所述盖玻片为大小能覆盖住所述主体凹槽，且不超出装载玻片边缘的玻片。

10.一种根据权利要求1～9中任一项所述的丝状真菌的改良小培养装置进行丝状真菌培养及显微形态观察的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

S1、取融化的琼脂真菌培养基15～30μL，注入装载玻片中央的中央凹槽中；

S2、待琼脂真菌培养基冷却后，加入4～6μL无菌蒸馏水；

S3、倾斜装载玻片，使无菌蒸馏水全部浸润中央凹槽中的琼脂真菌培养块后，在琼脂真菌培养块的右下角点种待测真菌；

S4、盖上盖玻片，在所述盖玻片的四角用粘结剂固封后，放入湿盒中25℃～35℃培养；

S5、待达到真菌出现典型结构或达到试验预设目的后，用乳酸酚棉兰染液沿装载玻片和盖玻片间缝隙缓慢加入；

S6、待镜下真菌图片达到预设效果后，用粘结剂将盖玻片和装载玻片间的缝隙密封，保存。