CN104830697B - 一种丝孢真菌培养物干制标本的制作方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种丝孢真菌培养物干制标本的制作方法，包括以下步骤：将配制好的琼胶培养基加入到培养皿中，制成琼胶培养平板，将剪了多个滤纸孔的湿滤纸平铺在琼胶培养平板表面上，然后在滤纸孔中心接种丝孢真菌菌种，密封后于室温、自然光线下培养得到丝孢真菌培养物；取出琼胶培养平板表面的滤纸放置于另一个培养皿中，于甲醛熏蒸桶中熏蒸6～8天，然后将滤纸在通风处自然晾干，即制作成丝孢真菌培养物干制标本。本发明方法操作简单，培养条件温和，诱导丝孢真菌产孢效果显著，对多数丝孢真菌有效，分生孢子在滤纸上分布均匀，不仅便于观察产孢表型，而且极大的缩短了标本干燥时间，提高了标本制作效率和质量。

Description

一种丝孢真菌培养物干制标本的制作方法

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种丝孢真菌培养物干制标本的制作技术。

背景技术

长期以来，丝孢真菌的分类鉴定主要以菌体形态特点为主，分生孢子的特征(形态、大小、隔膜数量、表面纹饰及附属物等)是丝孢真菌主要的种级分类标准，分生孢子连续产生的外观形态(产孢表型)亦是丝孢真菌种类鉴定的重要依据。而培养物干制标本是丝孢真菌进行长期保存的重要方式之一。

丝孢真菌在人工培养过程中，易出现不产生分生孢子或难产生分生孢子的现象。目前促进丝孢真菌产孢的主要方法有菌落划伤法、紫外光照射法、冷冻刺激法、黑暗/光照交替培养法等，但这些方法均存在以下几个缺点：(1)促进产孢的效果不明显，产孢量少，产孢表型难于观察；(2)难以准确掌握处理时间，处理时间不当会抑制丝孢真菌产孢或致死；(3)培养周期长，往往经过长时间的培养才会产孢；(4)产生的分生孢子特征不稳定，不同培养条件下产生的分生孢子特征存在较大差异。

培养物干制标本在制作时，要求标本能够充分展示丝孢真菌典型的形态特点，包括菌丝、产孢结构、分生孢子等。高品质的丝孢真菌培养物干制标本对于真菌学家开展系统的丝孢真菌分类学研究，特别是对已发现的丝孢真菌新物种鉴定具有重要意义。

目前，丝孢真菌培养物干制标本制作的传统步骤如下：首先根据丝孢真菌特性选择合适的培养基进行培养；然后从培养皿中挖取丝孢真菌菌落置于水琼脂培养平板上，在甲醛熏蒸桶中熏蒸处理；熏蒸结束后，取出带有丝孢真菌菌落的培养平板，于通风背光处自然晾干。但此方法存在以下几个缺点：(1)不同种类的丝孢真菌生长特性差异较大，所需培养基类型也不同，很难准确掌握丝孢真菌的培养时间，难于获得具有典型形态特点的培养物，导致制作的干制标本质量不高；(2)标本制作过程中，除了进行丝孢真菌培养外，仍需配制水琼脂培养基、灭菌、制备培养平板、挖取真菌菌落等操作，制作步骤繁琐；(3)用于丝孢真菌培养的培养基及水琼脂培养平板均含有大量水分，导致标本需要很长时间才能充分晾干，天气良好时充分晾干需要15～20天，天气不好时晾干时间更长并且标本容易变臭，失去保存价值。

因此，急切需要寻求一种新的快速、简便的丝孢真菌培养物干制标本制作方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术存在的不足，提供一种方法简单、步骤简便、能得到形态特征典型的丝孢真菌培养物的丝孢真菌培养物干制标本的制作方法，更有利于真菌学家开展系统的丝孢真菌分类学研究和丝孢真菌新物种鉴定。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

一种丝孢真菌培养物干制标本的制作方法，包括以下步骤：

将配制好的琼胶培养基加入到培养皿中，待琼胶培养基凝固后制成琼胶培养平板，将剪了多个滤纸孔的湿滤纸平铺在所述琼胶培养平板表面上，然后在多个滤纸孔中心接种丝孢真菌菌种，密封后于室温、自然光线下培养得到所述丝孢真菌培养物；所述琼胶培养基、培养皿和滤纸接种前均经过高温高压灭菌。

取出琼胶培养平板表面的滤纸放置于另一个培养皿中，于甲醛熏蒸桶中熏蒸6～8天，熏蒸结束后将滤纸在通风处自然晾干，即制作成丝孢真菌培养物干制标本。

作为一种改进的技术方案，所述琼胶培养基的制备方法为：在1000ml水中加入10～20g琼脂粉、5～10g葡萄糖、5～10g淀粉、3～5g羧甲基纤维素钠、5～10g蛋白胨、2～5g硫酸镁、2～5g磷酸二氢钾、2～5g硫酸亚铁和50～80mg维生素B₁，搅拌均匀。

作为一种优选的技术方案，所述丝孢真菌培养物的培养方法具体包括以下步骤：

(1)取圆形滤纸，在所述滤纸上均匀剪出4个以上的滤纸孔，平放于培养皿中，加适量蒸馏水将所述滤纸浸湿，进行高温高压灭菌后，取出滤纸。

(2)配制琼胶培养基，将配制好的琼胶培养基灭菌，然后加入到灭菌后的培养皿中，每培养皿加入量为15～20ml，待琼胶培养基凝固后制成琼胶培养平板。

(3)用无菌镊子将所述经过灭菌的滤纸平铺在琼胶培养平板表面上，使所述滤纸与所述琼胶培养平板之间无空隙，无气泡。

(4)然后用无菌针挑取适量丝孢真菌菌种，接种于所述滤纸上的各个滤纸孔中心位置的改良琼胶培养平板上。

(5)盖上培养皿盖，用封口膜密封，然后于室温、自然光线下培养10～30天，滤纸表面形成典型的丝孢真菌菌落(包括大量菌丝、产孢结构及分生孢子)，即得到所述丝孢真菌培养物。

上述各步骤均在超净工作台中完成。

作为一种优选的技术方案，步骤(1)中，在所述滤纸上均匀剪出4～6个滤纸孔。

作为进一步优选的技术方案，所述滤纸直径为65～75mm，所述滤纸孔的直径为12～18mm。

作为一种优选的技术方案，步骤(4)中，所述丝孢真菌菌种的接种量为每孔接种直径2～5mm菌饼。

作为一种优选的技术方案，所述的高温高压灭菌是在温度121℃、压力120kPa条件下保持灭菌20分钟。

由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

本发明方法在丝孢真菌培养时在一个培养皿中多位点接种，实现菌落多发，分生孢子在滤纸上分布均匀，相比传统的每皿只接种一个位点、接种多皿的操作方法，大大减少工作量，并且在产生分生孢子后，同时进行丝孢真菌不同时期产孢表型的连续观察，避免多次重复培养，节省时间，节约成本；在丝孢真菌培养结束后，只需取出表层滤纸进行熏蒸、晾干即可完成标本制作，不需要配制水琼脂培养基、灭菌、平板制作及挖取真菌菌落等繁琐操作，整个制作过程相比现有技术更加简便，而且经过培养后滤纸表面长有大量丝孢真菌菌落(包括菌丝、典型产孢结构及分生孢子)，并且滤纸的含水量极少，在通风处仅需1-2小时就可完全干燥，相对于传统方法，极大的缩短了标本干燥时间，提高了标本制作效率和质量。

本发明琼胶培养基的制备方法为：在1000ml水中加入10～20g琼脂粉、5～10g葡萄糖、5～10g淀粉、3～5g羧甲基纤维素钠、5～10g蛋白胨、2～5g硫酸镁、2～5g磷酸二氢钾、2～5g硫酸亚铁和50～80mg维生素B₁，搅拌均匀得到，本发明使用的改良琼胶培养基含有的营养成分及微量元素，满足了丝孢真菌前期菌丝生长及后期孢子产生所需营养物质，并在室温、自然光线下培养，接近丝孢真菌在自然环境中的生长条件(自然光照、温度、寡营养)，诱导产生的分生孢子特征稳定，能够充分表现出自身的种级特征。

本发明丝孢真菌培养方法操作简单，培养条件温和，无需特殊设备，一般微生物实验室均可进行，所用改良琼胶培养基可培养诱导绝大多数丝孢真菌产孢，不需要根据丝孢真菌种类选择培养基类型，且诱导丝孢真菌产孢效果显著，对多数丝孢真菌有效，分生孢子在滤纸上分布均匀，不仅便于观察培养过程的产孢表型，而且制作的干制标本能够充分展示丝孢真菌典型的形态特点，便于其他真菌工作者的后续研究。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

图1是用于丝孢真菌培养的琼胶培养平板；

图2是丝孢真菌菌株(菌株编号为YC1407)在本发明的琼胶培养基上不同培养时间的菌落形态；

图3是丝孢真菌菌株(菌株编号为YC1407)在本发明的琼胶培养基上不同培养时间的产孢形态；

图4是丝孢真菌菌株(菌株编号为YC1407)在本发明的琼胶培养基上不同培养时间的产孢结构和分生孢子；

图5是丝孢真菌菌株(菌株编号为YC1407)在PDA培养基上不同培养时间的菌落形态；

图6是丝孢真菌菌株(菌株编号为YC1407)在PDA培养基上不同培养时间的产孢形态；

图7是丝孢真菌在本发明琼胶培养基上的菌落形态；

图8是本发明制作的丝孢真菌培养物干制标本。

图9是对比例2中利用现有技术制作的丝孢真菌培养物干制标本。

具体实施方式

下面结合附图和具体的实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

取圆形滤纸，在所述滤纸上均匀剪出4个滤纸孔，平放于培养皿中，加适量蒸馏水将所述滤纸浸湿，在温度121℃、压力120kPa条件下保持灭菌20分钟后，取出滤纸。

配制琼胶培养基，将配制好的琼胶培养基在温度121℃、压力120kPa条件下灭菌，然后加入到灭菌后的培养皿中，待琼胶培养基凝固后制成琼胶培养平板。

用无菌镊子将所述经过灭菌的滤纸平铺在琼胶培养平板表面上，使所述滤纸与所述琼胶培养平板之间无空隙，无气泡。

然后用无菌针挑取适量丝孢真菌菌种，接种于所述滤纸上的各个滤纸孔中心位置的改良琼胶培养平板上。

盖上培养皿盖密封，然后于室温、自然光线下培养，第10天开始滤纸表面产生分生孢子，培养10～30天，滤纸表面形成典型的丝孢真菌培养物(包括大量菌丝、产孢结构及分生孢子)。

取出琼胶培养平板表面的滤纸放置于另一个培养皿中，于甲醛熏蒸桶中熏蒸7天，熏蒸结束后将滤纸在通风处自然晾干1.5小时，即制作成丝孢真菌培养物干制标本。

实施例2

取直径为70mm的圆形滤纸，在所述滤纸上均匀剪出直径为15mm的5个滤纸孔，平放于直径为90mm的培养皿中，加适量蒸馏水将所述滤纸浸湿，在温度121℃、压力120kPa条件下保持灭菌20分钟后，取出滤纸。

在1000ml水中加入15g琼脂粉、8g葡萄糖、8g淀粉、4g羧甲基纤维素钠、8g蛋白胨、3g硫酸镁、3g磷酸二氢钾、4g硫酸亚铁和75mg维生素B₁，搅拌均匀，配制成琼胶培养基，将配制好的琼胶培养基在温度121℃、压力120kPa条件下灭菌，然后加入到灭菌后的培养皿中，每培养皿加入量为18ml，待琼胶培养基凝固后制成琼胶培养平板。

用无菌镊子将所述经过灭菌的滤纸平铺在琼胶培养平板表面上，使所述滤纸与所述琼胶培养平板之间无空隙，无气泡。

然后用无菌针挑取适量丝孢真菌菌种，接种于所述滤纸上的各个滤纸孔中心位置的改良琼胶培养平板上。

盖上培养皿盖，用封口膜密封，然后于室温、自然光线下培养，第10天滤纸表面开始产生分生孢子，培养10～30天，滤纸上形成典型的丝孢真菌培养物(包括大量菌丝、典型产孢结构及分生孢子)。

取出琼胶培养平板表面的滤纸放置于另一个培养皿中，于甲醛熏蒸桶中熏蒸7天，熏蒸结束后将滤纸在通风处自然晾干1.5小时，即制作成丝孢真菌培养物干制标本。

实施例3

取直径为70mm的圆形滤纸，在所述滤纸上均匀剪出直径为12mm的6个滤纸孔，平放于直径为90mm的培养皿中，加适量蒸馏水将所述滤纸浸湿，在温度121℃、压力120kPa条件下保持灭菌20分钟后，取出滤纸。

在1000ml水中加入18g琼脂粉、6g葡萄糖、6g淀粉、4g羧甲基纤维素钠、7g蛋白胨、4g硫酸镁、4g磷酸二氢钾、3g硫酸亚铁和70mg维生素B₁，搅拌均匀，配制成琼胶培养基，将配制好的琼胶培养基在温度121℃、压力120kPa条件下灭菌，然后加入到灭菌后的培养皿中，每培养皿加入量为16ml，待琼胶培养基凝固后制成琼胶培养平板。

用无菌镊子将所述经过灭菌的滤纸平铺在琼胶培养平板表面上，使所述滤纸与所述琼胶培养平板之间无空隙，无气泡。

然后用无菌针挑取经过一段时间培养的丝孢真菌菌种，按照丝孢真菌菌种直径5mm菌饼的接种量接种于所述滤纸上的各个滤纸孔中心位置的改良琼胶培养平板上。

盖上培养皿盖，用封口膜密封，然后于室温、自然光线下培养，第10天滤纸表面开始产生分生孢子，培养10～20天，滤纸上形成典型的丝孢真菌培养物(包括大量菌丝、产孢结构及分生孢子)。

取出琼胶培养平板表面的滤纸放置于另一个培养皿中，于甲醛熏蒸桶中熏蒸8天，熏蒸结束后将滤纸在通风处自然晾干1小时，即制作成丝孢真菌培养物干制标本。

对比实验例

以一株分离自人工盐池的丝孢真菌(菌株编号为YC1407)为例，丝孢真菌培养和干制标本制作条件为：

实验例

利用本发明实施例2的培养方法进行丝孢真菌YC1407培养和干制标本的制作，用于丝孢真菌培养的改良琼胶培养平板见附图1所示，经过20天连续培养，分别在第10天、15天、20天观察菌落形态，其菌落形态如附图2所示。由图2可见，随着培养时间延长，菌株YC1407在琼胶培养平板上菌丝量增加，其菌落颜色逐渐加深。将上述培养菌落在体视镜下观察(如附图3、附图4所示)，菌株YC1407在培养第10天时，滤纸表面开始形成产孢结构和分生孢子，随着培养时间延长，滤纸表面形成的典型产孢结构及分生孢子逐渐增加，培养第20天时可见在滤纸表面密集产生大量菌丝、产孢结构及分生孢子。

待充分培养后，其培养菌落形态如附图7所示。将表面的滤纸取出，经过熏蒸、晾干，制作成丝孢真菌培养物干制标本(见附图8)。由图8可见，利用本发明方法制作的丝孢真菌培养物干制标本非常平展，表面带有大量丝孢真菌的菌丝、产孢结构和分生孢子。

对比例1

对比例1与实验例不同的是，使用的培养基为PDA培养基，而非本发明的改良琼胶培养基，而且只进行丝孢真菌的培养。丝孢真菌YC1407在PDA培养基上培养产生大量菌丝。如附图5所示，分别在培养第10天、15天、20天观察菌落形态，可见培养基表面产生大量菌丝，菌丝灰白色，呈絮状。在体视镜下观察产孢情况(附图6)，虽然经过长时间培养但未见产孢结构及分生孢子产生，仅可见灰白色细丝状菌丝。

对比例2

对比例2采用现有技术进行丝孢真菌的培养和干制标本的制作，丝孢真菌培养和干制标本的条件为：将丝孢真菌YC1407，采用PDA培养基进行培养30天；培养结束从培养皿中挖取丝孢真菌菌落置于水琼脂培养平板上，在甲醛熏蒸桶中熏蒸处理；熏蒸结束后，取出带有丝孢真菌菌落的培养平板，于通风背光处自然晾干，晾干20天得到干制标本(见附图9)。由图9可见，利用现有技术制作的丝孢真菌培养物干制标本菌丝较厚，但缺少典型的产孢结构和分生孢子，表面皱缩，标本质量较差。

对比试验结论：

利用本发明方法，能成功的快速诱导菌株YC1407产生大量典型产孢结构和分生孢子。利用本发明方法制作的丝孢真菌培养物干制标本非常平展，表面带有典型的丝孢真菌菌落(包括大量菌丝、产孢结构及分生孢子)，且干制标本制作方法简单，效率高，科研价值更高。通过制作菌体玻片观察其产孢结构和分生孢子特征，查阅文献资料，鉴定菌株YC1407为Alternaria alternata，属半知菌门，丝孢纲(Hyphomycetes)，丝孢目(Hyphomycetales)，暗色孢科(Dematiaceae)。

Claims (7)

1.一种丝孢真菌培养物干制标本的制作方法，其特征在于包括以下步骤：

将配制好的琼胶培养基加入到培养皿中，待琼胶培养基凝固后制成琼胶培养平板，将剪了多个滤纸孔的湿滤纸平铺在所述琼胶培养平板表面上，然后在多个滤纸孔中心接种丝孢真菌菌种，密封后于室温、自然光线下培养得到所述丝孢真菌培养物；所述琼胶培养基、培养皿和滤纸接种前均经过高温高压灭菌；

取出琼胶培养平板表面的滤纸放置于另一个培养皿中，于甲醛熏蒸桶中熏蒸6～8天，熏蒸结束后将滤纸在通风处自然晾干，即制作成丝孢真菌培养物干制标本。

2.如权利要求1所述的一种丝孢真菌培养物干制标本的制作方法，其特征在于所述琼胶培养基的制备方法为：在1000ml水中加入10～20g琼脂粉、5～10g葡萄糖、5～10g淀粉、3～5g羧甲基纤维素钠、5～10g蛋白胨、2～5g硫酸镁、2～5g磷酸二氢钾、2～5g硫酸亚铁和50～80mg维生素B₁，搅拌均匀。

3.如权利要求1所述的一种丝孢真菌培养物干制标本的制作方法，其特征在于所述丝孢真菌培养物的培养方法包括以下步骤：

(1)取圆形滤纸，在所述滤纸上均匀剪出4个以上的滤纸孔，平放于培养皿中，加蒸馏水将所述滤纸浸湿，进行高温高压灭菌后，取出滤纸；

(2)配制琼胶培养基，将配制好的琼胶培养基灭菌，加入到灭菌后的培养皿中，每培养皿加入量为15～20ml，待琼胶培养基凝固后制成琼胶培养平板；

(3)将所述经过灭菌的滤纸平铺在琼胶培养平板表面上，使所述滤纸与所述琼胶培养平板之间无空隙，无气泡；

(4)然后挑取适量丝孢真菌菌种，接种于所述滤纸上的各个滤纸孔中心位置的改良琼胶培养平板上；

(5)盖上培养皿盖密封，然后于室温、自然光线下培养10～30天，滤纸上产生大量菌丝、产孢结构及分生孢子，即得到所述丝孢真菌培养物。

4.如权利要求3所述的一种丝孢真菌培养物干制标本的制作方法，其特征在于：步骤(1)中，在所述滤纸上均匀剪出4～6个滤纸孔。

5.如权利要求4所述的一种丝孢真菌培养物干制标本的制作方法，其特征在于：所述滤纸直径为65～75mm，所述滤纸孔的直径为12～18mm。

6.如权利要求3所述的一种丝孢真菌培养物干制标本的制作方法，其特征在于：步骤(4)中，所述丝孢真菌菌种的接种量为每孔接种直径2～5mm菌饼。

7.如权利要求1至6任一权利要求所述的一种丝孢真菌培养物干制标本的制作方法，其特征在于：所述的高温高压灭菌是在温度121℃、压力120kPa条件下保持灭菌20分钟。