CN110564628B - 一种全营养基质微生物培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物培养技术领域，尤其涉及一种全营养基质微生物培养方法。(1)本发明充分利用了马铃薯中大部分淀粉和蛋白质等营养物质，营养成分全面，比传统PDA培养出的菌丝体健壮、浓密、旺盛；(2)本发明的方法培养微生物的菌丝体生长快速，便于观察，对不同条件下培养菌丝生物量的测定了提供便捷的方法；本发明的操作简便易行，极大降低了实验室的工作强度。
Description
技术领域
本发明涉及微生物培养技术领域，尤其是一种全营养基质微生物培养方法。
背景技术
PDA培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PotatoDextroseAgar(Medium)的简称)是一种常用的培养基，常用于培养酵母菌、霉菌、食用菌等真菌。PDA培养基通用性好，能满足绝大多数食用菌的基本生长要求，但是因其制备过程中先要制取马铃薯汁，即取新鲜无霉变无出芽的马铃薯，洗净去皮，切成小块，加水煮烂，纱布过滤，制取马铃薯汁；该取汁过程不仅使PDA培养基的制备过程非常麻烦、耗时长，而且过滤取汁过程中把马铃薯的很多营养成分都扔掉了，既造成了极大浪费，还提高了PDA培养基的生产成本。实际上，在马铃薯的干物质中，76％是可作为优良碳源的淀粉，7.2％是可作为优良氮源的蛋白质，但是由于它们在水中溶解度低，容易造成培养基不透明，因而通过过滤把它们绝大部分都扔掉了。
针对PDA培养基制备比较麻烦的问题，市场上出现了直接将PDA培养基成分浓缩成固体，使用时加入蒸馏水或去离子水，再加热溶解，分装灭菌即可，使PDA培养基的配制变得简单。这些浓缩成固体的PDA培养基中用马铃薯淀粉或马铃薯浸出粉取代了传统的马铃薯汁，如北京奥博星生物技术有限公司生产的马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基和宁夏启元药业有限公司的霉菌培养基(专利申请号为：201310594078.6)都是采用马铃薯浸出粉代替马铃薯汁，马铃薯浸出粉是马铃薯的酶解产物，主要为微生物培养提供碳源和氮源。马铃薯浸出粉是以马铃薯为原料，经粉碎、磨浆、浸渍、抽提、糖化酶解、蛋白酶解、精滤、低温喷雾干燥而成，超细、速溶、浅棕色至深褐色的粉末，具有吸湿性。而进口的DifcoTMPDA培养基则是用马铃薯淀粉取代了马铃薯汁，目前还有使用马铃薯全粉制备PDA培养基的思路，但是马铃薯全粉是以新鲜马铃薯为原料，经清洗，去皮，切片，预煮，冷却，蒸煮，捣泥等工艺过程，再经脱水干燥而得到的片屑状或细粉末状产品。但是，这些PDA培养基仍然除去了马铃薯的大部分淀粉和蛋白质等营养物质，营养成分不全面。另外，这类PDA培养基由于马铃薯淀粉或马铃薯浸出粉的制备成本高，造成所生产的PDA培养基固体部分的生产成本高、价格相当昂贵，难以得到广泛应用，并且，在实验室中，作为实验室基础性培养基PDA的应用，其熬制工作繁琐给实验室工作带来极大不便。
因此，寻找一种操作简便，原料利用率高，成本较低，并且培养出的菌丝体健壮、浓密、旺盛的全营养基质微生物培养方法是当务之急。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供一种全营养基质微生物培养方法，具体是通过以下技术方案得以实现的：
一种全营养基质微生物培养方法，包括以下步骤：
(1)原料准备：微生物菌种培养液、马铃薯、滤纸、辅助碳源；
(2)接种元制备：用打孔器将滤纸达成直径0.2-0.5cm的圆片，得到接种元，将其装在试管内用胶塞塞紧管口；
(3)全营养基质制备：马铃薯洗净去皮，切成(6-8)×(2-3)×(0.15-0.25)cm的片，得到全营养基质；
(4)介质制备：用中速双圈定性滤纸剪成(7-9)×(2-3)cm的纸片，得到介质纸片；
(5)碳源制备：将辅助碳源与水混合制备成浓度35-45g/L的水溶液；
(6)介质处理：将介质纸片在碳源溶液内充分浸湿，贴在全营养基质片上，再贴放到载玻片上；
(7)介质灭菌：将贴放有介质纸片的载玻片用镊子装进试管内，沿管壁滴加碳源溶液，塞紧试管口，连同接种元一起高压灭菌，然后冷却至室温；
(8)将接种元放进微生物菌种培养液内浸湿，用接种针挑取接种元接种在介质纸片上，塞紧管口，置恒温恒湿培养箱内，静置培养，观察菌丝体。
优选的，所述辅助碳源，是葡萄糖、可溶性淀粉、玉米粉中的一种或多种。进一步优选的，所述玉米粉，是80目熟玉米粉。碳源是微生物生长一类营养物，是含碳化合物，针对微生物种类和马铃薯的营养物质进行补充，可以使培养基的营养物质比例更加均衡，葡萄糖、可溶性淀粉、玉米粉均是较好的碳源，80目熟玉米粉用作碳源与马铃薯全营养基质的契合度更好。
优选的，所述步骤(6)，载玻片的介质面朝上。可以防止介质纸片脱出或位移。
优选的，所述步骤(7)，其中试管是直径3cm的试管，沿管壁滴加碳源溶液的量是1.5ml。此用量较为适中。
优选的，所述步骤(7)，是置高压灭菌锅内灭菌30分钟，然后置无菌操作台中冷却至室温。
优选的，所述步骤(8)，恒温恒湿培养箱内温度控制在对应微生物的适宜生长温度，以利于微生物生长。
优选的，所述步骤(8)，介质纸片朝上倾斜20°-30°，以利于微生物生长。
优选的，所述步骤(8)，静置培养的时间为5天。此时微生物生长进度较为合适，菌丝体生长呈现差异较为明显，适宜观察。
目前，大多数PDA培养基仍然除去了马铃薯的大部分淀粉和蛋白质等营养物质，营养成分不全面。另外，这类PDA培养基由于马铃薯淀粉或马铃薯浸出粉的制备成本高，造成所生产的PDA培养基固体部分的生产成本高、价格相当昂贵，难以得到广泛应用，并且，在实验室中，作为实验室基础性培养基PDA的应用，其熬制工作繁琐给实验室工作带来极大不便，本发明采用新鲜马铃薯，与辅助碳源、介质、接种元等进行合理配置，充分利用了新鲜马铃薯中全面的营养物质，使微生物能够快速生长，并且利于观察菌丝体，得到了一种操作简便，原料利用率高，成本较低，并且培养出的菌丝体健壮、浓密、旺盛的全营养基质微生物培养方法。
与现有技术相比，本发明创造的技术效果体现在：
(1)本发明充分利用了马铃薯中大部分淀粉和蛋白质等营养物质，营养成分全面，比传统PDA培养出的菌丝体健壮、浓密、旺盛；
(2)本发明的方法培养微生物的菌丝体生长快速，便于观察，对不同条件下培养菌丝生物量的测定了提供便捷的方法；
(3)本发明的操作简便易行，极大降低了实验室的工作强度。
具体实施方式
下面结合具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。
实施例1
(1)原料准备：微生物菌种培养液、马铃薯、滤纸、辅助碳源；
(2)接种元制备：用打孔器将滤纸达成直径0.35cm的圆片，得到接种元，将其装在试管内用胶塞塞紧管口；
(3)全营养基质制备：马铃薯洗净去皮，切成7cm×2.5cm×0.2cm的片，得到全营养基质；
(4)介质制备：用中速双圈定性滤纸剪成8cm×2.5cm的纸片，得到介质纸片；
(5)碳源制备：将辅助碳源与水混合制备成浓度40g/L的水溶液；
(6)介质处理：将介质纸片在碳源溶液内充分浸湿，贴在全营养基质片上，再贴放到载玻片上，保持载玻片的介质面朝上；
(7)介质灭菌：将贴放有介质纸片的载玻片用镊子装进直径3cmd试管内，沿管壁滴加碳源溶液1.5ml，塞紧试管口，连同接种元一起置高压灭菌锅内灭菌30分钟，然后置无菌操作台中冷却至室温；
(8)将接种元放进微生物菌种培养液内浸湿，用接种针挑取接种元接种在介质纸片上，介质纸片朝上倾斜25°，塞紧管口，置恒温恒湿培养箱内于温度25℃、湿度85％下培养，静置培养5d，观察菌丝体。
所述辅助碳源，是葡萄糖、可溶性淀粉、玉米粉等比例混合得到。
实施例2
(1)原料准备：微生物菌种培养液、马铃薯、滤纸、辅助碳源；
(2)接种元制备：用打孔器将滤纸达成直径0.2cm的圆片，得到接种元，将其装在试管内用胶塞塞紧管口；
(3)全营养基质制备：马铃薯洗净去皮，切成6cm×2cm×0.15cm的片，得到全营养基质；
(4)介质制备：用中速双圈定性滤纸剪成7cm×2cm的纸片，得到介质纸片；
(5)碳源制备：将辅助碳源与水混合制备成浓度35g/L的水溶液；
(6)介质处理：将介质纸片在碳源溶液内充分浸湿，贴在全营养基质片上，再贴放到载玻片上，保持载玻片的介质面朝上；
(7)介质灭菌：将贴放有介质纸片的载玻片用镊子装进直径3cmd试管内，沿管壁滴加碳源溶液1.5ml，塞紧试管口，连同接种元一起置高压灭菌锅内灭菌30分钟，然后置无菌操作台中冷却至室温；
(8)将接种元放进微生物菌种培养液内浸湿，用接种针挑取接种元接种在介质纸片上，介质纸片朝上倾斜20°，塞紧管口，置恒温恒湿培养箱内于温度25℃、湿度85％下培养，静置培养5d，观察菌丝体。
所述辅助碳源，是葡萄糖、可溶性淀粉、玉米粉等比例混合得到。
实施例3
(1)原料准备：微生物菌种培养液、马铃薯、滤纸、辅助碳源；
(2)接种元制备：用打孔器将滤纸达成直径0.5cm的圆片，得到接种元，将其装在试管内用胶塞塞紧管口；
(3)全营养基质制备：马铃薯洗净去皮，切成8cm×3cm×0.25cm的片，得到全营养基质；
(4)介质制备：用中速双圈定性滤纸剪成9cm×3cm的纸片，得到介质纸片；
(5)碳源制备：将辅助碳源与水混合制备成浓度45g/L的水溶液；
(6)介质处理：将介质纸片在碳源溶液内充分浸湿，贴在全营养基质片上，再贴放到载玻片上，保持载玻片的介质面朝上；
(7)介质灭菌：将贴放有介质纸片的载玻片用镊子装进直径3cmd试管内，沿管壁滴加碳源溶液1.5ml，塞紧试管口，连同接种元一起置高压灭菌锅内灭菌30分钟，然后置无菌操作台中冷却至室温；
(8)将接种元放进微生物菌种培养液内浸湿，用接种针挑取接种元接种在介质纸片上，介质纸片朝上倾斜30°，塞紧管口，置恒温恒湿培养箱内于温度25℃、湿度85％下培养，静置培养5d，观察菌丝体。
所述辅助碳源，是葡萄糖、可溶性淀粉、玉米粉等比例混合得到。
实施例4
(1)原料准备：微生物菌种培养液、马铃薯、滤纸、辅助碳源；
(2)接种元制备：用打孔器将滤纸达成直径0.35cm的圆片，得到接种元，将其装在试管内用胶塞塞紧管口；
(3)全营养基质制备：马铃薯洗净去皮，切成7cm×2.5cm×0.2cm的片，得到全营养基质；
(4)介质制备：用中速双圈定性滤纸剪成8cm×2.5cm的纸片，得到介质纸片；
(5)碳源制备：将辅助碳源与水混合制备成浓度40g/L的水溶液；
(6)介质处理：将介质纸片在碳源溶液内充分浸湿，贴在全营养基质片上，再贴放到载玻片上，保持载玻片的介质面朝上；
(7)介质灭菌：将贴放有介质纸片的载玻片用镊子装进直径3cmd试管内，沿管壁滴加碳源溶液1.5ml，塞紧试管口，连同接种元一起置高压灭菌锅内灭菌30分钟，然后置无菌操作台中冷却至室温；
(8)将接种元放进微生物菌种培养液内浸湿，用接种针挑取接种元接种在介质纸片上，介质纸片朝上倾斜25°，塞紧管口，置恒温恒湿培养箱内于温度25℃、湿度85％下培养，静置培养5d，观察菌丝体。
所述辅助碳源，是葡萄糖。
实施例5
(1)原料准备：微生物菌种培养液、马铃薯、滤纸、辅助碳源；
(2)接种元制备：用打孔器将滤纸达成直径0.35cm的圆片，得到接种元，将其装在试管内用胶塞塞紧管口；
(3)全营养基质制备：马铃薯洗净去皮，切成7cm×2.5cm×0.2cm的片，得到全营养基质；
(4)介质制备：用中速双圈定性滤纸剪成8cm×2.5cm的纸片，得到介质纸片；
(5)碳源制备：将辅助碳源与水混合制备成浓度40g/L的水溶液；
(6)介质处理：将介质纸片在碳源溶液内充分浸湿，贴在全营养基质片上，再贴放到载玻片上，保持载玻片的介质面朝上；
(7)介质灭菌：将贴放有介质纸片的载玻片用镊子装进直径3cmd试管内，沿管壁滴加碳源溶液1.5ml，塞紧试管口，连同接种元一起置高压灭菌锅内灭菌30分钟，然后置无菌操作台中冷却至室温；
(8)将接种元放进微生物菌种培养液内浸湿，用接种针挑取接种元接种在介质纸片上，介质纸片朝上倾斜25°，塞紧管口，置恒温恒湿培养箱内于温度25℃、湿度85％下培养，静置培养5d，观察菌丝体。
所述辅助碳源，是可溶性淀粉。
实施例6
(1)原料准备：微生物菌种培养液、马铃薯、滤纸、辅助碳源；
(2)接种元制备：用打孔器将滤纸达成直径0.35cm的圆片，得到接种元，将其装在试管内用胶塞塞紧管口；
(3)全营养基质制备：马铃薯洗净去皮，切成7cm×2.5cm×0.2cm的片，得到全营养基质；
(4)介质制备：用中速双圈定性滤纸剪成8cm×2.5cm的纸片，得到介质纸片；
(5)碳源制备：将辅助碳源与水混合制备成浓度40g/L的水溶液；
(6)介质处理：将介质纸片在碳源溶液内充分浸湿，贴在全营养基质片上，再贴放到载玻片上，保持载玻片的介质面朝上；
(7)介质灭菌：将贴放有介质纸片的载玻片用镊子装进直径3cmd试管内，沿管壁滴加碳源溶液1.5ml，塞紧试管口，连同接种元一起置高压灭菌锅内灭菌30分钟，然后置无菌操作台中冷却至室温；
(8)将接种元放进微生物菌种培养液内浸湿，用接种针挑取接种元接种在介质纸片上，介质纸片朝上倾斜25°，塞紧管口，置恒温恒湿培养箱内于温度25℃、湿度85％下培养，静置培养5d，观察菌丝体。
所述辅助碳源，是80目熟玉米粉。
对比例1
将接种元放进微生物菌种培养液内浸湿，用接种针挑取接种元接种在未处理的马铃薯片上，于恒温恒湿培养箱内于温度25℃、湿度85％下培养，静置培养5d。
对比例2
将接种元放进微生物菌种培养液内浸湿，用接种针挑取接种元接种在常规的PDA培养基上，于恒温恒湿培养箱内于温度25℃、湿度85％下培养，静置培养5d。
对比例3
按照专利申请CN201610740833.0的实施例1中的培养基C进行配置，将接种元放进微生物菌种培养液内浸湿，用接种针挑取接种元接种在所得培养基上，于恒温恒湿培养箱内于温度25℃、湿度85％下培养，静置培养5d。
实施例1-6，对比例1-3所用的微生物菌种培养液是担子菌松乳菇真菌菌种培养液，将静置培养5天后的微生物菌丝进行对比：
最后，应当指出，以上实施例仅是本发明较有代表性的例子。显然，本发明的技术方案并不限于上述实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种全营养基质微生物培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)原料准备：微生物菌种培养液、马铃薯、滤纸、辅助碳源，所述辅助碳源，是葡萄糖、可溶性淀粉、玉米粉中的一种或多种；
(2)接种元制备：用打孔器将滤纸打成直径0.2-0.5cm的圆片，得到接种元，将其装在试管内用胶塞塞紧管口；
(3)全营养基质制备：马铃薯洗净去皮，切成(6-8)×(2-3)×(0.15-0.25)cm的片，得到全营养基质；
(4)介质制备：用中速双圈定性滤纸剪成(7-9)×(2-3)cm的纸片，得到介质纸片；
(5)碳源制备：将辅助碳源与水混合制备成浓度35-45g/L的水溶液；
(6)介质处理：将介质纸片在碳源溶液内充分浸湿，贴在全营养基质片上，再贴放到载玻片上；
(7)介质灭菌：将贴放有介质纸片的载玻片用镊子装进试管内，沿管壁滴加碳源溶液，塞紧试管口，连同接种元一起高压灭菌，然后冷却至室温；
(8)将接种元放进微生物菌种培养液内浸湿，用接种针挑取接种元接种在介质纸片上，塞紧管口，置恒温恒湿培养箱内，静置培养，观察菌丝体。
2.根据权利要求1所述的全营养基质微生物培养方法，其特征在于，所述玉米粉，是80目熟玉米粉。
3.根据权利要求1所述的全营养基质微生物培养方法，其特征在于，所述步骤(6)，载玻片的介质面朝上。
4.根据权利要求1所述的全营养基质微生物培养方法，其特征在于，所述步骤(7)，其中试管是直径3cm的试管，沿管壁滴加碳源溶液的量是1.5ml。
5.根据权利要求1所述的全营养基质微生物培养方法，其特征在于，所述步骤(7)，是置高压灭菌锅内灭菌30分钟，然后置无菌操作台中冷却至室温。
6.根据权利要求1所述的全营养基质微生物培养方法，其特征在于，所述步骤(8)，恒温恒湿培养箱内温度控制在对应微生物的适宜生长温度。
7.根据权利要求1所述的全营养基质微生物培养方法，其特征在于，所述步骤(8)，介质纸片朝上倾斜20°-30°。
8.根据权利要求1所述的全营养基质微生物培养方法，其特征在于，所述步骤(8)，静置培养的时间为5天。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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