CN103361278B - 一种罗氏阿太菌以及采用该菌种生产硬葡聚糖发酵液的方法 - Google Patents
一种罗氏阿太菌以及采用该菌种生产硬葡聚糖发酵液的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及微生物发酵，特别是指一种罗氏阿太菌以及采用该菌种生产硬葡聚糖发酵液的方法。它包括将罗氏阿太菌CGMCCNo.7760接种到含有碳源的培养液中，添加必要的氮源及营养物质；调节培养液的pH，进行通气搅拌发酵等工艺步骤。本发明解决了现有技术中存在的生产成本高、收率低、产品抗温性能差等问题，具有生产成本低，操作安全，收率高，所制备的硬葡聚糖在抗温性能指标上明显优于现有产品，具有较好的工业应用前景等优点。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵，特别是指一种罗氏阿太菌以及采用该菌种生产硬葡聚糖发酵液的方法。
背景技术
硬葡聚糖（商品名为赛优胶）是一种性能优良的微生物多糖，是由微生物发酵生成的水溶性生物聚合物。它具有优良的增稠性、假塑性、耐高温、高盐及较广范围的pH适应性，可广泛用于石油、油漆、陶瓷等行业。这种生物聚合物最初由美国Pittspurg公司生产,以后法国一家公司也进行此产品的生产,成为目前世界上生产这种生物聚合物的主要厂家。他们在生产中采用Sclerotium Rolfsii同一菌属的菌种发酵制取硬葡聚糖发酵液，发酵结束将发酵液用醇类沉淀、干燥得到的固体粉末状产品。
微生物多糖在80年代初引起石油工业界的关注，人们筛选出适合化学驱油用的聚合物包括聚丙烯酞胺、纤维素衍生物、黄原胶、瓜胶、硬葡聚糖在内的140多种聚合物,其中硬葡聚糖具有超群的热稳定性,也具有良好的耐盐性和抗剪切性。随着石油工业的快速发展，硬葡聚糖以其良好性能，在石油工业的三次采油、调剖堵水、钻井液处理等方面具有广阔的应用前景。
传统的硬葡聚糖生产工艺是生产菌以葡萄糖为原料进行需氧发酵制得。发酵时将以萄葡糖、硝酸盐、无机盐等为主要原料的培养基按比例配制、灭菌后接种硬葡聚糖生产菌种，在一定的温度、通无菌空气的情况下进行发酵，随着发酵过程的进行,发酵液中有大量的菌丝生成，培养液出现胶凝粘稠物,且发酵的PH由于酸性物质的积累而下降，经一定的发酵周期后制成硬葡聚糖发酵液。传统生产工艺存在工艺设计（如培养基等）不合理而造成生产成本高、得率低（一般为20g/L左右）的缺点。
发明内容
本发明的目的之一在于公开了一种能够发酵生产硬葡聚糖发酵液的罗氏阿太菌，即罗氏阿太菌CGMCCNo.7760。
本发明的目的之二是公开了以罗氏阿太菌为菌种生产硬葡聚糖发酵液的方法，以获得抗温性能等主要技术指标上均优于现有硬葡聚糖的发酵产物。同时，在发酵后的提取过程中采用中性盐作为调节等电点的主要手段，使制备过程操作安全、生产成本低。
本发明的整体技术构思是：
本发明的中使用的微生物是：
本发明中用于生产硬葡聚糖发酵液的菌种即为具有生产硬葡聚糖能力的菌种，该菌种申请人已于2013年6月21日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）保藏，该保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，该菌种的保藏编号为：CGMCCNo.7760。该菌种建议的分类命名为罗氏阿太菌(拉丁文名称为：Athelia rolfsii)。
该菌种的菌落形态及显微特征如下：
该菌种在麦芽汁培养基上生长快，30℃黑暗条件下培养3天，菌落长满培养皿，菌丝茂盛，棉絮状，大量气生菌丝，白色；菌落背面白色。
菌丝薄壁，直径2.6-6.4μm,常见分枝，单系，具锁状联合。
菌落边缘产生菌核，开始为乳白色，后逐渐变成浅黄色至茶褐色或棕褐色，球形至卵圆形，大小1-2mm，表面光滑具光泽。
该菌种的rRNA基因序列测定结果如下（包括18SrRNA片段，ITS1-5.8SrRNA-ITS2的全序列及28S rRNA序列片段）：
5'-GAGGTCAATGGTCAATATATGCACTTATATGCTAGATATATGCGCATGATTTTATAAGTAGTACATACAAGCTAGAATCCCCTTCCGGTATAGGCGTAGACATATTATCACACCAACCGTAGGCATTTCTACATGTCCTACTAATAGTTTTAAAGAGAGCCAGTCAGAATATACTCTAACCAGCAACTCTCACATCCAAGCCTTGACAAATACAAAAATTTGTAAGGTTGAGAATTTAATGACTCTCAAACAGGCATGCCCCTCGGAATACCAAAGGGCGCAAGGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGGATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCAAGAGCCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTGTATATTTTTAATTAAGAGAAACTTGTCAGAAAACAAAGTTTCAATATGAGATCGTTCTATGTAACATACAATAAGAGTTATATAGGGTAATCATAGTTAGGATTTCTCCTGACTACAGTTGGTTCACAGGTGTATATATTATATAGCTCCAGAGTGTGCACATGCAATATTCATTACCAGCACAACTCCTTCGCATATATGAATTCAATAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAACCTTGTT-3'。
本发明中利用罗氏阿太菌为菌种生产硬葡聚糖发酵液的方法，包括如下工艺步骤：
A、将罗氏阿太菌CGMCCNo.7760为菌种接种到含有碳源的培养液中，添加必要的氮源及营养物质；
B、调节培养液的pH，进行通气搅拌发酵得到硬葡聚糖发酵液。
其中生产方法中的各工艺步骤的工艺条件如下：
所述的培养液中的碳源选自葡萄糖、白砂糖、废糖蜜或废葡萄糖母液中的一种或其混合物。
发酵培养液由如下质量百分数的组分组成：
废糖蜜3.0%-3.5% 废葡萄糖母液2.0%-2.5% 豆粕水解液0.2%-0.3%
鱼粉水解液0.1%-0.2% 磷酸氢二钾0.1%-0.15% 聚醚消泡剂0.05%-0.15%
余量为无菌水 pH为5-6；
其中豆粕水解液采用如下方法制作：将豆粕用自来水配置成质量百分比浓度为30%的混合液，调pH为9-10，升温至80-90℃，维持40分钟后过滤取清液；
鱼粉水解液采用如下方法制作：将鱼粉用自来水配置成质量百分比浓度为30%的混合液，调pH为9-10，升温至80-90℃，维持40分钟后过滤取清液，加入双氧水进行脱色处理。
所述的豆粕水解液及鱼粉水解液的制作中采用氢氧化钠溶液调pH，鱼粉水解液的制作中双氧水的质量百分比浓度为2%-3%。
为便于发酵过程能够顺利实现，同时降低生产成本，优选的技术方案是，将罗氏阿太菌CGMCCNo.7760经过扩大培养后，按照种子液：培养液的质量百分比为5%-10%的接种量接种于培养液中。
由于发酵过程中随着周期增长发酵液粘度越来越高，发酵热散发慢，因此优选的技术方案是采用按发酵周期进行培养温度阶梯控制，同时为避免发酵时由于酸性物质的积累而使发酵液的pH下降。保证发酵过程中pH保持相对的稳定，提高生产的得率。优选的发酵条件是：
10小时内：温度30℃-35℃、压力0.03-0.05MPa、pH值5.0-6.0，通风量0.2-0.3vvm；
10-20小时：温度30℃-35℃、压力0.03-0.05MPa、pH值4.5-5.0、通风量0.3-0.4vvm；
20-30小时：温度28℃-30℃、压力0.03-0.05MPa、pH值4.5-5.0，通风量0.4-0.5vvm；
30-40小时：温度28℃-30℃、压力0.03-0.05MPa、pH值4.5-5.0、通风量0.4-0.5vvm；
40-60小时：温度28℃-30℃、压力0.03-0.05MPa、pH值4.5-5.0、通风量0.5-0.6vvm，
60小时-放罐：温度28℃-30℃、压力0.03-0.05MPa、pH值3.5-4.5、通风量0.5-0.6vvm；
发酵过程中加入浓氨水控制发酵液的pH，浓氨水的质量百分比浓度优选为18%-20%。放罐结束的标准为发酵液粘度不再增长或发酵周期≤70小时中的一种。
发酵液粘度采用如下方法测定：
选用测定误差±5%的NDJ—4型旋转粘度计，测定条件为转子型4号，步骤为取发酵液500ml置于烧杯内，用4号转子60rpm测定，读出表盘示数乘以系数即得粘度值。
菌种的扩大培养及接种过程可以根据实际生产的需要采用多种方式，均不脱离本发明的实质，其中较为优选的技术方案是：
（1）将罗氏阿太菌CGMCCNo.7760斜面菌种经扩大培养后制成种子液；
（2）将制成的种子液按种子液：培养液为5%-10%的接种量接入发酵罐中的培养液，进行通气发酵;
所述的斜面菌种培养基选用麦芽汁培养基。
所述的步骤（1）中的扩大培养依次包括摇瓶种子的制备、一级种子的制备、二级种子的制备；其中摇瓶种子的制备是挑取一环斜面菌种接入灭菌后的摇瓶种子培养基中，经振荡培养制成摇瓶种子，培养温度为30-35℃、转速为200-220转/分钟，培养周期为30-35小时；
摇瓶种子培养基采用如下方法制作：称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000ml加热至沸腾保持30分钟，纱布过滤后加入10g-20g葡萄糖，充分溶解后趁热纱布过滤，灭菌备用。
所述的一级种子的制备过程中一级种子培养液由下列质量百分数的组分组成：
白砂糖2%-3%；蛋白胨0.2%-0.3%；酵母膏0.2%-0.3%；生物素5-10ppm；余量为无菌水；pH5.0-6.0;
接种量为摇瓶种子：一级种子培养液=5%-10%，将摇瓶种子接入灭菌后的一级种子培养液经过培养制成一级种子，一级种子的制备过程中的工艺条件是培养温度30℃-35℃、通风量0.4vvm-0.6vvm、培养周期20h-24h。
所述的二级种子的制备过程中的二级种子培养液由下列质量百分数的组分组成：
废糖蜜0.5%-1.0%；废葡萄糖母液0.5%-1.0%；大豆蛋白肽0.2%-0.3%；酵母膏0.2%-0.3%；MgSO40.15%-0.25%;FeSO410ppm-15ppm；聚醚消泡剂0.05%-0.15%;余量为无菌水；pH5.0-6.0;
接种量为一级种子：二级种子培养液=5%-10%，将一级种子接入灭菌后的二级种子培养液经过培养制成二级种子，二级种子的制备过程中的工艺条件是培养温度30℃-35℃、通风量0.4vvm-0.6vvm、培养周期18h-22h。
所述的二级种子培养液和发酵培养液中的废糖蜜在使用前采用浓度为2-3万ppm的臭氧将稀释8-12倍的废糖蜜处理40-60分钟，升温至60-70℃后加入活性炭维持30分钟进行脱色、过滤处理。
因为废糖蜜、废葡萄糖母液中糖浓度不稳定，在使用时测定其含糖的实际浓度，根据工艺要求的浓度计算并配制后加入到培养液中，从而保证培养液中糖浓度的稳定。
所述的活性炭占物料的质量百分比为0.2%-0.3%。
采用本发明的方法制备的硬葡聚糖的性能指标检测结果如下：
一、抗温性能的检测
由于硬葡聚糖的抗温性能测定尚无国标，因此申请人借鉴国外企业的标准对采用本发明的方法获得的硬葡聚糖抗温性能进行了测定，具体的方法步骤如下：
测定项目：硬葡聚糖抗温性能（140℃）
1、所用仪器
a）滚子加热炉；
b）ZNN-D6六速旋转粘度计；
c）NGJ-2型搅拌器；
d）温度计；
e）分析天平；
2、测试步骤
将350ml天然海水倒入搅拌杯中，依次将样品3.0g，亚硫酸钠（L.R级）1.0g，在高速搅拌、低档条件下缓慢加入，中档搅拌30分钟，将溶液置于陈化釜内于140℃条件下热滚16小时，冷却至室温，搅拌器中档搅拌15分钟，用ZNN-D6六速旋转粘度计测试600rpm和300rpm读值。
YP值=300rpm-（600rpm-300rpm）
3、检测结果
采用本发明的方法制备的硬葡聚糖的抗温性能YP值约为26，而现有的硬葡聚糖产品的抗温性能YP值为20。
二、收率的检测
收率的检测目前尚无国标，行业中的测定一般采用如下方法：
1、所用仪器
恒温箱、分析天平（0.001g）
2、检测方法
将发酵液倒入一定体积的小烧杯中，用玻璃棒搅拌使其无气泡，用玻璃棒把表面抹平，把杯子外的发酵液清洗干净。发酵液用90%-95%的乙醇提取、沉降、过滤布挤干，将其撕碎后全部彻底移入到培养皿中，然后放入105℃烘箱中烘至恒重（约4小时），拿出称重。
固含量=称样克数/体积×100%
3、检测结果
采用本发明的方法的收率为30-35g/L，而现有的工艺收率为20g/L。
本发明所取得的实质性特点和显著的技术进步在于：
1、本发明公开了一种罗氏阿太菌CGMCCNo.7760，该菌种具有具有较好的硬葡聚糖生产能力。
2、采用本发明的方法制备硬葡聚糖，收率明显高于现有工艺，所制备的产品在抗温性能等主要指标上明显优于现有产品，在应用于石油钻采的过程中在同等温度条件下其粘稠度变化小，具有更好的工业适应性和应用前景。
3、发酵过程中以废糖蜜或废葡萄糖母液为基础原料，价格便宜；氮源使用有机氮源豆粕、鱼粉水解液代替传统生产方法中的无机氮源，制备过程操作安全、生产成本低。
4、在发酵过程中通过补入氨水解决发酵过程中由于酸性物质的积累导致的pH下降的问题。使发酵过程中pH保持相对的稳定，可有效提高收率。
5、本发明采用按发酵周期进行培养温度阶梯控制的方法，可有效解决硬葡聚糖发酵过程中随着周期的增长发酵液粘度越来越高，发酵热散发慢的问题，保证了发酵过程的持续稳定运行。
本发明中涉及的菌种申请人已于2013年6月21日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）保藏，保藏编号为：CGMCCNo.7760。附图说明
图1是罗氏阿太菌CGMCCNo.7760的序列表。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述，但不应理解为对本发明的限定，本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准，任何依据说明书作出的等效技术手段替换，均不脱离本发明的保护范围。
实施例1
本实施例包括如下工艺步骤：
A、将罗氏阿太菌CGMCCNo.7760为菌种接种到含有碳源的培养液中，添加必要的氮源及营养物质；
B、调节培养液的pH，进行通气搅拌发酵得到硬葡聚糖发酵液。
其中生产方法中的各工艺步骤的工艺条件如下：
发酵培养液由如下质量百分数的组分组成：
废糖蜜3.0% 废葡萄糖母液2.0% 豆粕水解液0.2%
鱼粉水解液0.1% 硫酸氢二钾0.1% 聚醚消泡剂0.05%-0.15%
余量为无菌水 pH为5-6；
其中豆粕水解液采用如下方法制作：将豆粕用自来水配置成质量百分比浓度为30%的混合液，调pH为9-10，升温至80-90℃，维持40分钟后过滤取清液；
鱼粉水解液采用如下方法制作：将鱼粉用自来水配置成质量百分比浓度为30%的混合液，调pH为9-10，升温至80-90℃，维持40分钟后过滤取清液，加入双氧水进行脱色处理。
所述的豆粕水解液及鱼粉水解液的制作中采用氢氧化钠溶液调pH，鱼粉水解液的制作中双氧水的质量百分比浓度为2%-3%。
将罗氏阿太菌CGMCCNo.7760经过扩大培养后，按照种子液：培养液的质量百分比为5%的接种量接种于培养液中。
发酵过程中的发酵条件是：
10小时内：温度30℃-35℃、压力0.03-0.05MPa、pH值5.0-6.0，通风量0.2-0.3vvm；
10-20小时：温度30℃-35℃、压力0.03-0.05MPa、pH值4.5-5.0、通风量0.3-0.4vvm；
20-30小时：温度28℃-30℃、压力0.03-0.05MPa、pH值4.5-5.0，通风量0.4-0.5vvm；
30-40小时：温度28℃-30℃、压力0.03-0.05MPa、pH值4.5-5.0、通风量0.4-0.5vvm；
40-60小时：温度28℃-30℃、压力0.03-0.05MPa、pH值4.5-5.0、通风量0.5-0.6vvm，
60小时-放罐：温度28℃-30℃、压力0.03-0.05MPa、pH值3.5-4.5、通风量0.5-0.6vvm；
发酵过程中加入浓氨水控制发酵液的pH，浓氨水的质量百分比浓度优选为18%-20%。放罐结束的标准为发酵液粘度不再增长或发酵周期≤70小时中的一种。
发酵液粘度采用如下方法测定：
选用测定误差±5%的NDJ—4型旋转粘度计，测定条件为转子型4号，步骤为取发酵液500ml置于烧杯内，用4号转子60rpm测定，读出表盘示数乘以系数即得粘度值。
菌种的扩大培养及接种过程是：
（1）将罗氏阿太菌CGMCCNo.7760斜面菌种经扩大培养后制成种子液；
（2）将制成的种子液按种子液：培养液为5%的接种量接入发酵罐中的培养液，进行通气发酵;
斜面菌种培养基选用北京奥博星生物技术有限公司生产的麦芽汁琼脂培养基。
所述的步骤（1）中的扩大培养依次包括摇瓶种子的制备、一级种子的制备、二级种子的制备；其中摇瓶种子的制备是挑取一环斜面菌种接入灭菌后的摇瓶种子培养基中，经振荡培养制成摇瓶种子，培养温度为30℃、转速为200转/分钟，培养周期为35小时；
摇瓶种子培养基采用如下方法制作：称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000ml加热至沸腾保持30分钟，纱布过滤后加入10g-20g葡萄糖，充分溶解后趁热纱布过滤，灭菌备用。
所述的一级种子的制备过程中一级种子培养液由下列质量百分数的组分组成：
白砂糖2%；蛋白胨0.2%；酵母膏0.2%；生物素5ppm；余量为无菌水；pH5.0-6.0;
接种量为摇瓶种子：一级种子培养液=5%，将摇瓶种子接入灭菌后的一级种子培养液经过培养制成一级种子，一级种子的制备过程中的工艺条件是培养温度30℃、通风量0.4vvm-0.6vvm、培养周期24h。
所述的二级种子的制备过程中的二级种子培养液由下列质量百分数的组分组成：
废糖蜜0.5%；废葡萄糖母液0.5%；大豆蛋白肽0.2%；酵母膏0.2%；MgSO40.15%;FeSO410ppm；聚醚消泡剂0.05%;余量为无菌水；pH5.0-6.0;
接种量为一级种子：二级种子培养液=5%，将一级种子接入灭菌后的二级种子培养液经过培养制成二级种子，二级种子的制备过程中的工艺条件是培养温度30℃、通风量0.4vvm-0.6vvm、培养周期22h。
所述的二级种子培养液和发酵培养液中的废糖蜜在使用前采用浓度为2-3万ppm的臭氧将稀释8-12倍的废糖蜜处理40-60分钟，升温至60-70℃后加入活性炭维持30分钟进行脱色、过滤处理。
因为废糖蜜、废葡萄糖母液中糖浓度不稳定，在使用时测定其含糖的实际浓度，根据工艺要求的浓度计算并配制后加入到培养液中，从而保证培养液中糖浓度的稳定。
所述的活性炭占物料的质量百分比为0.2%-0.3%。
本实施例的工艺收率为33g/L，抗温性能（140℃）YP为26.5。
实施例2
本实施例包括如下工艺步骤：
A、将罗氏阿太菌CGMCCNo.7760为菌种接种到含有碳源的培养液中，添加必要的氮源及营养物质；
B、调节培养液的pH，进行通气搅拌发酵得到硬葡聚糖发酵液。
其中生产方法中的各工艺步骤的工艺条件如下：
发酵培养液由如下质量百分数的组分组成：
废糖蜜3.5% 废葡萄糖母液2.5% 豆粕水解液0.3%
鱼粉水解液0.2% 磷酸氢二钾0.15% 聚醚消泡剂0.15%
余量为无菌水 pH为5-6；
其中豆粕水解液及鱼粉水解液的制作方法同实施例1。
将罗氏阿太菌CGMCCNo.7760经过扩大培养后，按照种子液：培养液的质量百分比为5%-10%的接种量接种于培养液中。
发酵过程中的发酵条件及发酵终点的控制同实施例1。
菌种的扩大培养及接种过程是：
（1）将罗氏阿太菌CGMCCNo.7760斜面菌种经扩大培养后制成种子液；
（2）将制成的种子液按种子液：培养液为10%的接种量接入发酵罐中的培养液，进行通气发酵;
斜面菌种培养基选用北京奥博星生物技术有限公司生产的麦芽汁琼脂培养基。
所述的步骤（1）中的扩大培养依次包括摇瓶种子的制备、一级种子的制备、二级种子的制备；其中摇瓶种子的制备是挑取一环斜面菌种接入灭菌后的摇瓶种子培养基中，经振荡培养制成摇瓶种子，培养温度为35℃、转速为220转/分钟，培养周期为30小时。
摇瓶种子培养基的制作方法同实施例1。
所述的一级种子的制备过程中一级种子培养液由下列质量百分数的组分组成：
白砂糖3%；蛋白胨0.3%；酵母膏0.3%；生物素10ppm；余量为无菌水；pH5.0-6.0;
接种量为摇瓶种子：一级种子培养液=10%，将摇瓶种子接入灭菌后的一级种子培养液经过培养制成一级种子，一级种子的制备过程中的工艺条件是培养温度35℃、通风量0.4vvm-0.6vvm、培养周期20h。
所述的二级种子的制备过程中的二级种子培养液由下列质量百分数的组分组成：
废糖蜜1.0%；废葡萄糖母液1.0%；大豆蛋白肽0.3%；酵母膏0.3%；MgSO40.25%;FeSO415ppm；聚醚消泡剂0.15%;余量为无菌水；pH5.0-6.0;
接种量为一级种子：二级种子培养液=10%，将一级种子接入灭菌后的二级种子培养液经过培养制成二级种子，二级种子的制备过程中的工艺条件是培养温度35℃、通风量0.6vvm、培养周期18h。
所述的二级种子培养液和发酵培养液中的废糖蜜处理方法同实施例1。
本实施例的工艺收率为31g/L，抗温性能（140℃）YP为26。
实施例3
本实施例包括如下工艺步骤：
A、将罗氏阿太菌CGMCCNo.7760为菌种接种到含有碳源的培养液中，添加必要的氮源及营养物质；
B、调节培养液的pH，进行通气搅拌发酵得到硬葡聚糖发酵液。
其中生产方法中的各工艺步骤的工艺条件如下：
发酵培养液由如下质量百分数的组分组成：
废糖蜜3.2% 废葡萄糖母液2.3% 豆粕水解液0.25%
鱼粉水解液0.15% 磷酸氢二钾0.13% 聚醚消泡剂0.1%
余量为无菌水 pH为5-6；
其中豆粕水解液及鱼粉水解液的制作方法同实施例1。
将罗氏阿太菌CGMCCNo.7760经过扩大培养后，按照种子液：培养液的质量百分比为8%的接种量接种于培养液中。
发酵过程中的发酵条件及发酵终点的控制同实施例1。
菌种的扩大培养及接种过程是：
（1）将罗氏阿太菌CGMCCNo.7760斜面菌种经扩大培养后制成种子液；
（2）将制成的种子液按种子液：培养液为8%的接种量接入发酵罐中的培养液，进行通气发酵;
斜面菌种培养基选用北京奥博星生物技术有限公司生产的麦芽汁琼脂培养基。
所述的步骤（1）中的扩大培养依次包括摇瓶种子的制备、一级种子的制备、二级种子的制备；其中摇瓶种子的制备是挑取一环斜面菌种接入灭菌后的摇瓶种子培养基中，经振荡培养制成摇瓶种子，培养温度为32℃、转速为200转/分钟，培养周期为32小时；
摇瓶种子培养基的制作方法同实施例1。
所述的一级种子的制备过程中一级种子培养液由下列质量百分数的组分组成：
白砂糖2.5%；蛋白胨0.25%；酵母膏0.25%；生物素8ppm；余量为无菌水；pH5.0-6.0;
接种量为摇瓶种子：一级种子培养液=8%，将摇瓶种子接入灭菌后的一级种子培养液经过培养制成一级种子，一级种子的制备过程中的工艺条件是培养温度32℃、通风量0.4vvm-0.6vvm、培养周期22小时。
所述的二级种子的制备过程中的二级种子培养液由下列质量百分数的组分组成：
废糖蜜0.8%；废葡萄糖母液0.8%；大豆蛋白肽0.25%；酵母膏0.25%；MgSO40.2%;FeSO410ppm-15ppm；聚醚消泡剂0.1%;余量为无菌水；pH5.0-6.0;
接种量为一级种子：二级种子培养液=8%，将一级种子接入灭菌后的二级种子培养液经过培养制成二级种子，二级种子的制备过程中的工艺条件是培养温度32℃、通风量0.4vvm-0.6vvm、培养周期20h。
所述的二级种子培养液和发酵培养液中的废糖蜜处理方法同实施例1。
本实施例的工艺收率为32g/L，抗温性能（140℃）YP为27。
Claims (17)
1.一种罗氏阿太菌(Athelia rolfsii)，其保藏编号为CGMCCNo.7760。
2.一种以罗氏阿太菌为菌种生产硬葡聚糖发酵液的方法，其特征在于该方法包括如下工艺步骤：
A、将保藏编号为CGMCCNo.7760的罗氏阿太菌为菌种接种到含有碳源的培养液中，添加必要的氮源及其它营养物质；
B、调节培养液的pH，进行通气搅拌发酵得到硬葡聚糖发酵液。
3.根据权利要求2所述的以罗氏阿太菌为菌种生产硬葡聚糖发酵液的方法，其特征在于所述的培养液中的碳源选自葡萄糖、白砂糖、废糖蜜或废葡萄糖母液中的一种或其混合物。
4.根据权利要求2所述的以罗氏阿太菌为菌种生产硬葡聚糖发酵液的方法，其特征在于所述的培养液由如下质量百分数的组分组成：
废糖蜜 3.0％-3.5％ 废葡萄糖母液 2.0％-2.5％ 豆粕水解液 0.2％-0.3％
鱼粉水解液 0.1％-0.2％ 磷酸氢二钾 0.1％-0.15％ 聚醚消泡剂 0.05％-0.15％
余量为无菌水 pH为5-6。
5.根据权利要求4所述的以罗氏阿太菌为菌种生产硬葡聚糖发酵液的方法，其特征在于所述的豆粕水解液采用如下方法制作：将豆粕用自来水配制成质量百分比浓度为30％的混合液，调pH为9-10，升温至80-90℃，维持40分钟后过滤取清液。
6.根据权利要求4所述的以罗氏阿太菌为菌种生产硬葡聚糖发酵液的方法，其特征在于所述的鱼粉水解液采用如下方法制作：将鱼粉用自来水配制成质量百分比浓度为30％的混合液，调pH为9-10，升温至80-90℃，维持40分钟后过滤取清液，加入双氧水进行脱色处理，鱼粉水解液的制作中双氧水的质量百分比浓度为2％-3％。
7.根据权利要求5或6所述的以罗氏阿太菌为菌种生产硬葡聚糖发酵液的方法，其特征在于所述的豆粕水解液及鱼粉水解液的制作中采用氢氧化钠溶液调pH。
8.根据权利要求4所述的以罗氏阿太菌为菌种生产硬葡聚糖发酵液的方法，其特征在于所述的发酵条件是：
10小时内：温度30℃-35℃、压力0.03-0.05MPa、pH值5.0-6.0，通风量0.2-0.3vvm；
10-20小时：温度30℃-35℃、压力0.03-0.05MPa、pH值4.5-5.0、通风量0.3-0.4vvm；
20-30小时：温度28℃-30℃、压力0.03-0.05MPa、pH值4.5-5.0，通风量0.4-0.5vvm；
30-40小时：温度28℃-30℃、压力0.03-0.05MPa、pH值4.5-5.0、通风量0.4-0.5vvm；
40-60小时：温度28℃-30℃、压力0.03-0.05MPa、pH值4.5-5.0、通风量0.5-0.6vvm；
60小时-放罐：温度28℃-30℃、压力0.03-0.05MPa、pH值3.5-4.5、通风量0.5-0.6vvm；
发酵过程中加入浓氨水控制发酵液的pH，放罐结束的标准为发酵液粘度不再增长或发酵周期≤70小时中的一种。
9.根据权利要求8所述的以罗氏阿太菌为菌种生产硬葡聚糖发酵液的方法，其特征在于所述的浓氨水的质量百分比浓度为18％-20％。
10.根据权利要求8所述的以罗氏阿太菌为菌种生产硬葡聚糖发酵液的方法，其特征在于所述的发酵液粘度采用如下方法测定：
选用测定误差±5％的NDJ—4型旋转粘度计，测定条件为使用4号转子，步骤为取发酵液500ml置于烧杯内，用4号转子60rpm测定，读出表盘示数乘以系数即得粘度值。
11.根据权利要求2所述的以罗氏阿太菌为菌种生产硬葡聚糖发酵液的方法，其特征在于将保藏编号为CGMCCNo.7760的罗氏阿太菌经过扩大培养后，按照种子液：培养液的质量百分比为5％-10％的接种量接种于培养液中。
12.根据权利要求11所述的以罗氏阿太菌为菌种生产硬葡聚糖发酵液的方法，其特征在于所述的扩大培养及接种过程包括：
(1)将保藏编号为CGMCCNo.7760的罗氏阿太菌斜面菌种经扩大培养后制成种子液；
(2)将制成的种子液按种子液：培养液为5％-10％的接种量接入发酵罐中的培养液，进行通气发酵；
所述斜面菌种的培养基选用麦芽汁培养基。
13.根据权利要求12所述的以罗氏阿太菌为菌种生产硬葡聚糖发酵液的方法，其特征在于所述的步骤(1)中的扩大培养依次包括摇瓶种子的制备、一级种子的制备、二级种子的制备；其中摇瓶种子的制备是挑取一环斜面菌种接入灭菌后的摇瓶种子培养基中，经振荡培养制成摇瓶种子，培养温度为30-35℃、转速为200-220转/分钟，培养周期为30-35小时；
摇瓶种子培养基采用如下方法制作：称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000ml加热至沸腾保持30分钟，纱布过滤后加入10g-20g葡萄糖，充分溶解后趁热纱布过滤，灭菌备用。
14.根据权利要求13所述的以罗氏阿太菌为菌种生产硬葡聚糖发酵液的方法，其特征在于所述的一级种子的制备过程中一级种子培养液由下列质量百分数的组分组成：
白砂糖2％-3％；蛋白胨0.2％-0.3％；酵母膏0.2％-0.3％；生物素5-10ppm；余量为无菌水；pH5.0-6.0；
接种量为摇瓶种子：一级种子培养液＝5％-10％，将摇瓶种子接入灭菌后的一级种子培养液经过培养制成一级种子，一级种子的制备过程中的工艺条件是培养温度30℃-35℃、通风量0.4vvm-0.6vvm、培养周期20h-24h。
15.根据权利要求13所述的以罗氏阿太菌为菌种生产硬葡聚糖发酵液的方法，其特征在于所述的二级种子的制备过程中的二级种子培养液由下列质量百分数的组分组成：
废糖蜜0.5％-1.0％；废葡萄糖母液0.5％-1.0％；大豆蛋白肽0.2％-0.3％；酵母膏0.2％-0.3％；MgSO4 0.15％-0.25％；FeSO4 10ppm-15ppm；聚醚消泡剂0.05％-0.15％；余量为无菌水；pH 5.0-6.0；
接种量为一级种子：二级种子培养液＝5％-10％，将一级种子接入灭菌后的二级种子培养液经过培养制成二级种子，二级种子的制备过程中的工艺条件是培养温度30℃-35℃、通风量0.4vvm-0.6vvm、培养周期18h-22h。
16.根据权利要求4或15中任一项所述的以罗氏阿太菌为菌种生产硬葡聚糖发酵液的方法，其特征在于所述的废糖蜜在使用前采用浓度为2-3万ppm的臭氧将稀释8-12倍的废糖蜜处理40-60分钟，升温至60-70℃后加入活性炭维持30分钟进行脱色、过滤处理。
17.根据权利要求16所述的以罗氏阿太菌为菌种生产硬葡聚糖发酵液的方法，其特征在于所述的活性炭占物料的质量百分比为0.2％-0.3％。
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