CN106337071A - 小核菌硬葡聚糖工业量产发酵及提取工艺 - Google Patents

小核菌硬葡聚糖工业量产发酵及提取工艺 Download PDF

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CN106337071A CN201610077473.0A CN201610077473A CN106337071A CN 106337071 A CN106337071 A CN 106337071A CN 201610077473 A CN201610077473 A CN 201610077473A CN 106337071 A CN106337071 A CN 106337071A
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马辉
石光东
丁攀攀
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    • C12P19/08—Dextran
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Abstract

本发明公开了一种小核菌硬葡聚糖工业量产发酵及提取工艺，发酵工艺培养基碳源、氮源、硝酸钠、磷酸二氢钾、硫酸镁、消泡剂，剩余为无菌水，PH＝4.5-6.0构成，并在发酵阶段无需调节发酵液的PH，同时采用了90％-95％(V/V)浓度的乙醇溶液提取发酵液；本工艺操作简单，适宜工业大生产，同时产品屈服性能YP值≥30。

Description

小核菌硬葡聚糖工业量产发酵及提取工艺
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其涉及是一种小核菌硬葡聚糖工业量产发酵及提取工艺。
背景技术
硬葡聚糖是通过小核菌发酵而得的非离子生物聚合物，又称小核菌多糖，该微生物多糖具有良好的增稠、悬浮、乳化性，其溶液粘度在PH值2-12基本保持不变，热稳定性好，适应温度高、耐高盐、抗氧化及抗酶解能力强。同时，其与酸、碱、盐、防腐剂、天然的或合成的增稠剂在同一溶液体系中具有良好的兼容性，还可以与卡拉胶、黄原胶、瓜尔胶、刺槐豆胶等复配。该生物聚合物被广泛应用于石油、化妆品、印染等行业。尤其在石油钻井的增稠性、堵漏及三次采用上应用量较大。随着国内外石油开采量的不断递增，对该生物聚合物的需求量日益增长。目前硬葡聚糖的主要生产厂家为法国Sanofi Industrie公司，现已被美国Cargill公司收购作为国外唯一对该生物聚合物进行量产的企业，国内乃至整个亚洲均没有发现对该微生物多糖进行工业量产的企业。因此，中国国内生物发酵企业研发并对该微生物多糖进行工业量产势在必行。
当前，我们在研发和实现硬葡聚糖的工业量产上均与国内外企业及相关研究所进行了一定的技术探讨和交流发现：国内外现有技术及国内外公开的专利文献CN201110006769.0、CN201310283916.8、CN201410572695.0、CN201010605447.3和EP1417325A2中存在以下技术问题：
(1)现有技术中，为维持培养基在发酵阶段的菌种适宜PH环境，均在发酵阶段对培养基的PH进行加碱维持PH值恒定，操作难度大。还常出现因加碱液过多导致PH值超高而抑制菌种生长，同时加碱操作时存在安全隐患，进而造成劳动强度大的不足。
(2)随着石油开采地质的变化及钻井难度的增加，国内外石油企业对硬葡聚糖的屈服性能YP值提出了更高的要求，虽目前国内的检测标准中并没有对硬葡聚糖的屈服性能出台国标，但借鉴国外的检测标准对国内企业单位通过实验罐发酵获得的硬葡聚糖进行检测，目前现有技术中虽有检测硬葡聚糖的屈服性能YP值能够达到26.5-27，但无法实现更高要求(屈服性能YP值≥30)，因此这也是影响国内外石油企业对中国国内发酵企业生产硬葡聚糖的需求订单寥寥无几，进而无法刺激国内发酵企业实现对硬葡聚糖的大规模工业量产。
(3)虽法国Sanofi Industrie公司(Cargill公司)作为国内外生产硬葡聚糖的主要企业，发酵时间长、培养基和提取工艺相对复杂，进而造成其生产的硬葡聚糖成本高，因此国际上硬葡聚糖的售价较高，国内企事业单位的现有技术中虽能将原来的发酵时间96h，缩短至现在的60h，但其因发酵周期缩短，检测时发现其产生的生物聚合物无法达到国内外石油企业更高要求的屈服性能YP值标准及热稳定性上大打折扣，产率不高，进而生产成本较高。同时我们还发现，Cargill公司在提取硬葡聚糖时，采用异丙醇进行提取，异丙醇在提取时易使盐类沉淀、气味难挥发，造成提取后的产物纯度低、异味、产物水粘度不高和提取成本高的缺陷。
发明内容
本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一种更为优化的小核菌硬葡聚糖工业量产发酵及提取工艺，该工艺实现了发酵过程不需要加碱液或其他碱性物质调节发酵液的PH环境，实现了发酵时间缩短和高产率的同时还提高了产品屈服性能YP值，提高了产品纯度，实现了产品无异味的目的。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
小核菌硬葡聚糖工业量产发酵及提取工艺，包括发酵和提取工艺，所述发酵工艺如下步骤：
(1).菌种培养：
菌种培养基的组成及其质量百分比：碳源50-100g/L、氮源5-10g/L、硝酸钠0.5-3g/L、磷酸二氢钾1.0-2.0g/L、硫酸镁1.5-2.5g/L、消泡剂0.1-0.5g/L，剩余为无菌水，PH＝4.5-6.0。将备有上述培养基的摇瓶置于温度为27℃-31℃摇床上，所述摇床转速100-140rpm，培养小核菌种子液，培养时间24h。
(2).一级种子培养：
一级种子培养基的组成及其质量百分比：碳源50-100g/L、氮源5-10g/L、硝酸钠0.5-3g/L、磷酸二氢钾1.0-2.0g/L、硫酸镁1.5-2.5g/L、消泡剂0.1-0.5g/L，剩余为无菌水，PH＝4.5-6.0。将上述培养基置入无菌的一级种子罐内，接着采用蒸汽对罐内培养基进行121℃-124℃的灭菌处理，灭菌时间30分钟-40分钟；降温至27℃-31℃后通过无菌接种管道将(1)中培养的小核菌种子液置入一级种子罐中培养；接种后的一级种子罐培养方法如下：
培养时间0-10h，风量1-2m3/h。
培养时间11-20h，风量2-3m3/h。
培养时间20h以后，风量3-4m3/h。
(3).二级种子培养：
二级种子培养基的组成及其质量百分比：碳源50-100g/L、氮源5-10g/L、硝酸钠0.5-3g/L、磷酸二氢钾1.0-2.0g/L、硫酸镁1.5-2.5g/L、消泡剂0.1-0.5g/L，剩余为无菌水，PH＝4.5-6.0。将上述培养基置入无菌的二级种子罐内，接着采用蒸汽对罐内培养基进行121℃-124℃的灭菌处理，灭菌时间30分钟-40分钟；降温至27℃-31℃后通过无菌接种管道将(2)中培养的一级种子液置入二级种子罐中培养；接种后的二级种子罐培养方法如下：
培养时间0-10h，风量2-3m3/h。
培养时间11-20h，风量4-5m3/h。
培养时间20h以后，风量8-10m3/h。
(4).发酵罐发酵：
发酵罐原料液的组成及其质量百分比：碳源50-100g/L、氮源5-10g/L、硝酸钠0.5-3g/L、磷酸二氢钾1.0-2.0g/L、硫酸镁1.5-2.5g/L、消泡剂0.1-0.5g/L，剩余为无菌水，PH＝4.5-6.0。将上述原料液通过UHT连续灭菌，温度121℃-124℃蒸汽喷射后注入发酵罐内，发酵料液体积是发酵罐体积的70％-75％，后通过循环冷却水对培养基进行降温至温度27℃-31℃，通过无菌接种管道将二级种子罐内培养的种子液置入发酵罐中发酵培养，二级种子液是所述发酵罐中的发酵料液的体积5-10％。接种后的发酵罐发酵方法如下：
发酵时间0-10h，风量400-600m3/h，搅拌器电机转速600r/min。
发酵时间11-30h，风量600-1000m3/h，搅拌器电机转速600-800r/min。
发酵时间31h以后，风量1300-1500m3/h；搅拌器电机转速900-1100r/min。
所述提取工艺步骤如下：
第一步.发酵液前处理：将含有硬葡聚糖的发酵液90℃-100℃热处理5-10min，降温45℃-55℃并保温15min，并用20％-30％浓度的氢氧化钠溶液或20％-30％碳酸钠溶液将所述发酵液PH调至7.5-8.5；
第二步.一次萃取：将处理后的发酵液与90％-95％(V/V)浓度的乙醇溶液按体积比1∶2混合，搅拌至出现絮状沉淀；
第三步.一次离心：将一次萃取后的混合溶液固液分离，分理出纤维状硬葡聚糖；
第四步.二次萃取：将上述纤维状硬葡聚糖与90％-95％(V/V)浓度的乙醇溶液混合搅拌清洗，乙醇加入量为一次萃取的二分之一；
第五步.二次离心：将二次萃取后的混合溶液固液分离，分离出纤维状硬葡聚糖；
第六步.压榨：将分离出纤维状硬葡聚糖输入压榨机进行积压排出多余的乙醇，制得纤维状硬葡聚糖；
第七步.干燥：将第六步中制得的纤维状硬葡聚糖于真空干燥机中干燥，干燥温度60℃-65℃，真空度为-0.05---0.08MPa，干燥时间100-120分钟；
第八步.磨粉：将干燥后的硬葡聚糖纤维用粉碎机磨粉，至产品完全通过80-200目筛；
最为优选的，所述碳源为淀粉、蔗糖、麦芽糖、葡萄糖中的一种或其任意比例的混合物。
最为优选的，所述氮源为玉米浆、大豆、酵母膏或粉、硝酸中的三种或任意比例的混合物。
最为优选的，所述二级种子液是所述发酵罐中的发酵料液的体积5％-10％。
最为优选的，所述的发酵罐中的发酵料液体积是发酵罐待容纳体积的75％-85％。
最为优选的，所述干燥后的纤维状硬葡聚糖经粉碎完全通过80目筛。
需要说明的是，消泡剂选用乳化硅油消泡剂。
需要再次说明的是，淀粉依次首选玉米淀粉、土豆淀粉、马铃薯淀粉。
需要重点说明是是，在发酵罐发酵40h和48h时，分别取发酵罐内发酵液样200mL-500mL，检测其PH、旋转粘度、残糖和得率。
接上，若40h或48h时检测的残糖低于0.5且旋转粘度高于10000cp，终止发酵放罐。
接上，若48h时检测的残糖在0.8-1.2且旋转粘度大于10000cp，则向发酵罐补无菌水，补水体积是发酵液体积的5％-8％，温度27℃-31℃，继续发酵至残糖低于0.5％。
所述PH、旋转粘度、残糖(RD)和得率的检测方法，具体步骤如下：
规程内容：
l个人作业任务分配
l指定作业频率
l作业完成时间
l以及执行该规程的逐步说明
范围
本文的范围涉及到执行该标准操作规程的所有必需信息。
部门 作业编号 负责人 频率 完成时间
发酵车间 4 中间检验员 依送样频率而定 15s
安全注意事项
劳保器材(PPE)要求：无。
工具
1.镊子
2.量程在6.4～8.0的精密pH试纸
3.pH计
步骤
一.使用pH试纸测pH
1.先估计被测液体的PH值；
2.将pH试纸剪成小段，放于干燥洁净的培养皿内。待用时用镊子夹取一段；
3.取其范围内的精密试纸一条，浸入欲测液体中，十秒钟后取出，与标准色板比较，确定和记录最接近的PH值；
4.将用过的pH试纸弃于垃圾桶；
二.使用pH计测pH
1.用蒸馏水清洗电极头部，用水纸将电极头部沾的水渍吸干；
2.把电极插入被测溶液内，待示值稳定时即为溶液的pH.
注意事项
1.pH试纸应避光放于干燥处，谨防受潮。
2.取下电极套后，应避免电极的造纸厂玻璃球泡与硬物接触，否则任何破损或擦毛都可能使电极失效。
3.测量后，及时将电极保护套套上，电极套内应放少量外参比补充液以保持电极球泡的湿润。切忌泡在蒸馏水中。
规程内容：
l个人作业任务分配
l指定作业频率
l作业完成时间
l以及执行该规程的逐步说明
范围
本文的范围涉及到执行该标准操作规程的所有必需信息。
安全注意事项
劳保器材(PPE)要求：无。
仪器
1.100ml高脚烧杯
2.NDJ-1粘度计，3号转子或4号转子
步骤
1.取100ml左右成熟发酵醪置于100ml高型烧杯
2.使用NDJ-1粘度计3号转子或4号转子，料液漫至转子标识位置时开启开关。
3.把档位调至6r/min，当表盘读数稳定以后，记录读数为测量值。
规程内容：
l个人作业任务分配
l指定作业频率
l作业完成时间
l以及执行该规程的逐步说明
范围
本文的范围涉及到执行该标准操作规程的所有必需信息。
部门 作业编号 负责人 频率 完成时间
发酵车间 5 中间检验员 依送样频率而定 10min
安全注意事项
劳保器材(PPE)要求：无。
仪器设备
1.50ml碱式滴定管
2.电炉
3.石棉网
4.150ml与250ml三角瓶
5.5ml吸量管、10ml吸量管
6.托盘天平、砝码
7.药匙
步骤
1.空白试验
1.1 吸取甲、乙液各5.0ml，置于150ml锥形瓶中，加水10ml，加入玻璃珠2粒，加热至沸后，在继续沸腾下用葡萄糖标准溶液逐滴滴定，直到溶液蓝色刚消失为终点。记下葡萄糖标准液的用量。
1.2 吸取甲、乙液各5.0ml，置于150ml锥形瓶中，加水10ml，再用滴定管加入标准葡萄糖比预备试验所消耗的量少1ml，置于石棉网上电炉加热，沸腾时计时器计时1min后，用0.001g/ml的标准葡萄糖溶液继续逐滴滴定至蓝色刚好褪之为终点，自沸腾至滴定结束总时间不得超过3min。计下葡萄糖标准液的用量。
1.3 第二步重复三次，所消耗的葡萄糖溶液体积取算术平均值即为空白试验消耗的葡萄糖体积。
2.正式测定
2.1 准确称取一定量的样品，加清水稀释。根据经验，稀释倍数可与毛细粘度测定的稀释倍数相同。
2.2 预备试验：吸取甲、乙液各5.0ml，置于150ml锥形瓶中，加水10ml，加入玻璃珠2粒，滴加待测液1ml，加热至沸后，在继续沸腾下用葡萄糖标准溶液逐滴滴定，直到溶液蓝色刚消失为终点。
2.3 正式测定：吸取甲、乙液各5.0ml，置于150ml锥形瓶中，加水10ml，加样品待测液，再用滴定管加入标准葡萄糖比预备试验所消耗的量少1ml，置于石棉网上电炉加热，沸腾时计时器计时1min后，用0.001g/ml标准葡萄糖溶液继续逐滴滴定至蓝色刚好褪之为终点，自沸腾至滴定结束总时间不得超过3min。
2.4 第二步重复三次，所得结果取算术平均值就是正式测定需要消耗的葡萄糖体积。
式中：A一空白滴定消耗标准葡萄糖溶液的体积ml
B-试样正式测定时消耗标准葡萄糖溶液的体积ml
C-标准葡萄糖溶液的浓度0.001g/ml
W-稀释试样时所取试样的质量g
V1-测定时吸取稀释试样液的体积ml
V-稀释试样液总体积ml
100-g/(g发酵液)换算成g/(100g发酵液)
注意事项
上述试验过程是对还原糖含量较低而言的。若样品还原糖较高时，应取适量样品，进行稀释定容后，再按上述方法测定。
规程内容：
l个人作业任务分配
l指定作业频率
l作业完成时间
l以及执行该规程的逐步说明
范围
本文的范围涉及到执行该标准操作规程的所有必需信息。
部门 作业编号 负责人 频率 完成时间
发酵车间 6 中间检验员 依送样频率而定 1h8min
安全注意事项
劳保器材(PPE)要求：乳胶手套。
仪器与试剂
1.恒温鼓风电热干燥箱
2.95％乙醇
3.天平
4.漏斗、过滤网
5.烧杯、玻棒
步骤
1.用天平称取100g或50g发酵醪，置于一烧杯内，慢慢加酒精少量，然后用玻璃棒迅速搅拌，边加酒精边快速搅拌使成絮状，然后刚过滤网过滤，再用酒精提取两遍后挤干，加少量酒精溶解，用滤网过滤挤干。
2.将提取物无损的平铺于干净的滤纸上面，放干燥箱中丁110℃烘60min后称取其质量差。
3.M1提取得率＝M1/M2×100％
式中：M1——提取物干燥后的质量g
M2——取发酵醪的克数g
注意事项
1.第一遍提取后过滤时，不可用手挤压
2.提取时尽量减少提取物的损失
本发明的工艺简单、原料低廉、易于采购、发酵成本低；发酵时间在40h-52h，发酵周期短，发酵期间不需要维持发酵液或者培养基的PH环境；得率(收率)能达到3.6g/L以上；同时成品屈服性能YPYP能达到35；采用乙醇溶液提取加上本发明的提取方法，使得获得的产品无论在纯净度上还是异味上要比国内外同类产品指标好，成品经客户检测屈服性能YPYP值、0.5％水溶液粘度、纯净度和PH均达到客户要求，尤其我们成品的屈服性能YPYP值35以上获得客户的高度认可。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述，但不应理解为对本发明的限定，本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准，任何依据说明书做出的等效技术手段替换，均不脱离本发明的保护范围。
实施例1
小核菌硬葡聚糖工业量产发酵及提取工艺，包括发酵和提取工艺，发酵工艺如下步骤：
(1).菌种培养：
菌种培养基的组成及其质量百分比：葡萄糖50g/L、玉米浆2g/L、大豆4g/L、硝酸4g/L、硝酸钠0.5g/L、磷酸二氢钾1.0g/L、硫酸镁1.5g/L、乳化硅消泡剂0.2g/L，剩余为无菌水或无菌自来水，PH＝6.0；将备有上述培养基的摇瓶置于温度为28.5℃摇床上，摇床转速100rpm，培养小核菌种子液，培养时间24h。
(2).一级种子培养：
一级种子培养基的组成及其质量百分比：葡萄糖60g/L、玉米浆4g/L、大豆2g/L、硝酸1g/L、硝酸钠0.6g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、硫酸镁2.0g/L、乳化硅消泡剂0.2g/L，剩余为剩余为无菌水或无菌自来水，PH＝6.0；将上述培养基置入无菌的一级种子罐内，接着采用蒸汽对罐内培养基进行121℃的灭菌处理，灭菌时间30分钟；降温至28.5℃后通过无菌接种管道将(1)中培养的小核菌种子液置入一级种子罐中培养，菌种接种量是一级发酵罐料液体积的0.5％；接种后的一级种子罐培养方法如下：
培养时间1-10h，风量1m3/h。
培养时间10-20h，风量2m3/h。
培养时间20h以后，风量3m3/h。
(3).二级种子培养：
二级种子培养基的组成及其质量百分比：葡萄糖80g/L、玉米浆7g/L、大豆2g/L、硝酸1g/L、硝酸钠2.5g/L、磷酸二氢钾2.0g/L、硫酸镁2.0g/L、乳化硅消泡剂0.5g/L，剩余为无菌水或无菌自来水，PH＝6.0；将上述培养基置入无菌的二级种子罐内，接着采用蒸汽对罐内培养基进行121℃℃的灭菌处理，灭菌时间30分钟；降温至28.5℃后通过无菌接种管道将(2)中培养的一级种子液置入二级种子罐中培养，一级菌种接种量是一级种子液体积的50％；接种后的二级种子罐培养方法如下：
培养时间1-10h，风量2m3/h。
培养时间10-20h，风量4m3/h。
培养时间20h以后，风量8m3/h。
(4).发酵罐发酵：
发酵罐原料液的组成及其质量百分比：葡萄糖90g/L、玉米浆8g/L、大豆1g/L、硝酸1g/L、硝酸钠2.5g/L、磷酸二氢钾1.75g/L、硫酸镁1.75g/L、乳化硅消泡剂0.5g/L，剩余为无菌水，PH＝6.0；将上述原料液通过UHT连续灭菌，温度121℃-124℃蒸汽喷射后注入发酵罐内，发酵料液体积是发酵罐体积的75％，后通过循环冷却水对发酵培养基进行降温至培养温度28.5℃，最后通过无菌接种管道将二级种子罐内培养的种子液置入发酵罐中发酵，二级种子液是所述发酵罐中的发酵料液的体积10％；接种后的发酵工艺控制方法如下：
发酵时间0-10h，风量600m3/h，搅拌器电机转速600r/min。
发酵时间11-30h，风量1000m3/h，搅拌器电机转速800r/min。
发酵时间31h以后，风量1500m3/h；搅拌器电机转速1100r/min。
上述发酵时间在40h时，取发酵罐内发酵液500mL。检测其PH、旋转粘度、残糖和得率，测得数据如下：
样品编号 取样时间 培养时间 PH 旋转粘度 残糖 得率％
1# 2015/5/12/8：00 40h 4.21 9500cp 0.75 2.96
如上数据，继续发酵，风量1500m3/h；搅拌器转速1100r/min。
当上述发酵时间为48h时，再次取发酵液500mL。检测其PH、旋转粘度、残糖和得率，测得数据如下：
样品编号 取样时间 培养时间 PH 旋转粘度 残糖 得率％
1# 2015/5/12/16：00 48h 4.16 14000cp 0.23 3.55
根据检测得出的结果，发酵终止放罐。
将上述放罐后的发酵液按照如下提取工艺提取：
第一步.发酵液预处理：将含有硬葡聚糖的发酵液90℃热处理5min，降温至50℃，并用30％浓度的氢氧化钠溶液将所述发酵液PH调至7.5；
第二步.一次萃取：将处理后的发酵液与90％(V/V)浓度的乙醇溶液按体积比1∶2混合，搅拌至出现絮状沉淀；
第三步.一次离心：将一次萃取后的混合溶液固液分离，分离出纤维状硬葡聚糖；
第四步.二次萃取：将上述纤维状硬葡聚糖与90％(V/V)浓度的乙醇溶液混合搅拌清洗，乙醇加入量为一次萃取的二分之一；
第五步.二次离心：将二次萃取后的混合溶液固液分离，分理出纤维状硬葡聚糖；
第六步.压榨：将分离出纤维状硬葡聚糖输入压榨机进行积压排出多余的乙醇，制得纤维状硬葡聚糖；
第七步.干燥：将第六步中制得的纤维状硬葡聚糖于真空干燥机中干燥，干燥温度60℃，真空度为-0.05MPa，干燥时间100分钟；
第八步.磨粉：将干燥后的硬葡聚糖纤维用粉碎机磨粉，至产品完全通过80目筛。
参照客户的检测标准，对产品进行性能检测，并检测数据如下：
实施例2
小核菌硬葡聚糖工业量产发酵及提取工艺，包括发酵和提取工艺，发酵工艺如下步骤：
(1).菌种培养：
菌种培养基的组成及其质量百分比：葡萄糖100g/L、玉米浆6g/L、大豆2g/L、硝酸2g/L、硝酸钠3g/L、磷酸二氢钾2.0g/L、硫酸镁2.5g/L、乳化硅消泡剂0.5g/L，剩余为无菌水或无菌自来水，PH＝6.0；将备有上述培养基的摇瓶置于温度为29.5℃摇床上，摇床转速140rpm，培养小核菌种子液，培养时间24h。
(2).一级种子培养：
一级种子培养基的组成及其质量百分比：葡萄糖100g/L、玉米浆6g/L、大豆2g/L、硝酸2g/L、硝酸钠3g/L、磷酸二氢钾2.0g/L、硫酸镁2.5g/L、乳化硅消泡剂0.5g/L，剩余为剩余为无菌水或无菌自来水，PH＝6.0；将上述培养基置入无菌的一级种子罐内，接着采用蒸汽对罐内培养基进行121℃的灭菌处理，灭菌时间30分钟；降温至29.5℃后通过无菌接种管道将(1)中培养的小核菌种子液置入一级种子罐中培养，菌种接种量是一级发酵罐料液体积的0.5％；接种后的一级种子罐培养方法如下：
培养时间0-10h，风量1m3/h。
培养时间11-20h，风量2m3/h。
培养时间20h以后，风量3m3/h。
(3).二级种子培养：
二级种子培养基的组成及其质量百分比：葡萄糖100g/L、玉米浆7g/L、大豆2g/L、硝酸1g/L、硝酸钠3g/L、磷酸二氢钾2.0g/L、硫酸镁2.5g/L、乳化硅消泡剂0.5g/L，剩余为无菌水或无菌自来水，PH＝6.0；将上述培养基置入无菌的二级种子罐内，接着采用蒸汽对罐内培养基进行121℃的灭菌处理，灭菌时间30分钟；降温至29.5℃后通过无菌接种管道将(2)中培养的一级种子液置入二级种子罐中培养，一级菌种接种量是一级种子液体积的3％；接种后的二级种子罐培养方法如下：
培养时间0-10h，风量2m3/h。
培养时间11-20h，风量4m3/h。
培养时间20h以后，风量8m3/h。
(4).发酵罐发酵：
发酵罐原料液的组成及其质量百分比：葡萄糖100g/L、玉米浆7g/L、大豆2g/L、硝酸1g/L、硝酸钠3g/L、磷酸二氢钾2.0g/L、硫酸镁2.5g/L、乳化硅消泡剂0.5g/L，剩余为无菌水，PH＝6.0；将上述原料液通过UHT连续灭菌，温度121℃-124℃蒸汽喷射后注入发酵罐内，发酵料液体积是发酵罐体积的75％，通过循环冷却水对发酵培养基进行降温至培养温度29.5℃，最后通过无菌接种管道将二级种子罐内培养的种子液置入发酵罐中发酵，二级种子液是所述发酵罐中的发酵料液的体积5％；接种后的发酵罐工艺控制方法如下：
发酵时间0-10h，风量600m3/h，搅拌器电机转速600r/min。
发酵时间11-30h，风量1000m3/h，搅拌器电机转速800r/min。
发酵时间31h以后，风量1500m3/h；搅拌器电机转速1100r/min。
发酵时间在48h时，取发酵罐内发酵液200mL-500mL检测其PH、旋转粘度、残糖和得率，如下：发酵时间在40h时，取发酵罐内发酵液500mL检测其PH、旋转粘度、残糖和得率，如下：
样品编号 取样时间 培养时间 PH 旋转粘度 残糖％ 得率％
1# 40h 2015/3/26/2：00 4.3 9000cp 0.97 2.57
发酵时间在48h时，取发酵罐内发酵液500mL检测其PH、旋转粘度、残糖和得率，如下：
样品编号 取样时间 培养时间 PH 旋转粘度 残糖％ 得率％
1# 48h 2015/3/26/10：00 4.01 15000cp 0.55 3.45
如上数据，向发酵罐中补入无菌自来水，补入水的体积是发酵液体积的8％，继续发酵，风量1500m3/h；搅拌器转速1100r/min。
当52h取发酵罐内发酵液500mL检测其PH、旋转粘度、残糖和得率，如下：
样品编号 取样时间 培养时间 PH 旋转粘度 残糖％ 得率％
1# 52h 2015/3/26/14：00 4.30 17000cp 0.36 3.63
如上数据，将可以终止发酵，放罐。
提取工艺步骤如下：
第一步.发酵液前处理：将含有硬葡聚糖的发酵液90℃热处理5min，降温50℃并保温，并用20％浓度的碳酸钠溶液将所述发酵液PH调至8.5；
第二步.一次萃取：将处理后的发酵液与90％(V/V)浓度的乙醇溶液按体积比1∶2混合，搅拌至出现絮状沉淀物；
第三步.一次离心：将一次萃取后的混合溶液固液分离，分离出纤维状硬葡聚糖；
第四步.二次萃取：将上述纤维状硬葡聚糖与90％(v/v)浓度的乙醇溶液混合搅拌清洗，乙醇加入量为一次萃取的二分之一；
第五步.二次离心：将二次萃取后的混合溶液固液分离，分离出纤维状硬葡聚糖；
第六步.压榨：将分离出纤维状硬葡聚糖输入压榨机进行积压排出多余的乙醇，制得高含量固形物；
第七步.干燥：将第六步中制得的固形物于真空干燥机中干燥，干燥温度60℃，真空度为-0.08MPa，干燥时间120分钟；
第八步.磨粉：将干燥后的硬葡聚糖纤维用粉碎机磨粉，至产品完全通过200目筛。
参照客户的检测标准，对产品性能进行检测，并检测数据如下：
结合实施例1和2中对产品性能的检测数据，本技术方案中获得产品符合PH＝7.5-8.5的要求，同时产品屈服性能YP≥30，且产品1％水粘度及0.5％水粘度在30rpm中符合客户要求的2000cp和500cp以上的标准。
应当指出的是，具体实施方式只是本发明比较有代表性的例子，，还可以有很多变形。本领域的普通技术人员，以本发明所明确公开的或根据文件的书面描述毫无异议的得到的，均应认为是本专利所要保护的范围。

Claims (9)

1.小核菌硬葡聚糖工业量产发酵及提取工艺，包括发酵和提取工艺，其特征在于，所述发酵工艺如下步骤：
(1).菌种培养：
菌种培养基的组成及其质量百分比：碳源50-100g/L、氮源5-10g/L、硝酸钠0.5-3g/L、磷酸二氢钾1.0-2.0g/L、硫酸镁1.5-2.5g/L、消泡剂0.1-0.5g/L，剩余为无菌水，PH＝4.5-6.0：将备有上述培养基的摇瓶置于温度为27℃-31℃℃摇床上，所述摇床转速100-140rpm，培养小核菌种子液，培养时间24h束。
(2).一级种子培养：
一级种子培养基的组成及其质量百分比：碳源50-100g/L、氮源5-10g/L、硝酸钠0.5-3g/L、磷酸二氢钾1.0-2.0g/L、硫酸镁1.5-2.5g/L、消泡剂0.1-0.5g/L，剩余为无菌水，PH＝4.5-6.0。将上述培养基置入无菌的一级种子罐内，接着采用蒸汽对罐内培养基进行121℃-124℃的灭菌处理，灭菌时间30分钟。降温至培养温度27℃-31℃后通过无菌接种管道将(1)中培养的小核菌种子液置入一级种子罐中培养。接种后的一级种子罐培养方法如下：
培养时间0-10h，风量1-2m3/h。
培养时间11-20h，风量2-3m3/h。
培养时间20h以后，风量3-4m3/h。
(3).二级种子培养：
二级种子培养基的组成及其质量百分比：碳源50-100g/L、氮源5-10g/L、硝酸钠0.5-3g/L、磷酸二氢钾1.0-2.0g/L、硫酸镁1.5-2.5g/L、消泡剂0.1-0.5g/L，剩余为无菌水，PH＝4.5-6.0。将上述培养基置入无菌的二级种子罐内，接着采用蒸汽对罐内培养基进行121℃-124℃的灭菌处理，灭菌时间30分钟。降温至培养温度27℃-31℃后通过无菌接种管道将(2)中培养的一级种子液置入二级种子罐中培养。接种后的二级种子罐培养方法如下：
培养时间0-10h，风量2-3m3/h。
培养时间11-20h，风量4-5m3/h。
培养时间20h以后，风量8-10m3/h。
(4).发酵罐发酵：
发酵培养基的组成及其质量百分比：碳源50-100g/L、氮源5-10g/L、硝酸钠0.5-3g/L、磷酸二氢钾1.0-2.0g/L、硫酸镁1.5-2.5g/L、消泡剂0.1-0.5g/L，剩余为无菌水，PH＝4.5-6.0。将上述原料液通过UHT连续灭菌，温度121。℃-124℃蒸汽喷射后注入发酵罐内，发酵料液体积是发酵罐体积的70％-75％，后通过循环冷却水对发酵培养基进行降温至培养 温度27℃-31℃，通过无菌接种管道将二级种子罐内培养的种子液置入发酵罐中发酵培养，二级种子液是所述发酵罐中的发酵料液的体积5-10％。接种后的发酵罐工艺控制方法如下：
发酵时间0-10h，风量400-600m3/h，搅拌器电机转速600r/min。
发酵时间11-30h，风量600-1000m3/h，搅拌器电机转速600-800r/min。
发酵时间31h以后，风量1300-1500m3/h；搅拌器电机转速900-1100r/min。
所述提取工艺步骤如下：
第一步.发酵液预处理：将含有硬葡聚糖的发酵液90℃-100℃热处理10min，降温至45℃-55℃，并用30％浓度的氢氧化钠溶液或20％碳酸钠溶液将所述发酵液PH调至7.5-8.5；
第二步.一次萃取：将处理后的发酵液与90％-95％(V/V)浓度的乙醇溶液按体积比1∶2混合，搅拌至出现絮状沉淀物；
第三步.一次离心：将一次萃取后的混合溶液固液分离，分离出纤维状硬葡聚糖；
第四步.二次萃取：将上述纤维状硬葡聚糖与90-95％(V/V)浓度的乙醇溶液混合搅拌清洗，乙醇加入量为一次萃取的二分之一；
第五步.二次离心：将二次萃取后的混合溶液固液分离，分离出纤维状硬葡聚糖；
第六步.压榨：将分离出纤维状硬葡聚糖输入压榨机进行积压排出多余的乙醇，制得纤维状硬葡聚糖：
第七步.干燥：将第六步中制得的固形物于真空干燥机中干燥，干燥温度60℃-65℃，真空度为-0.05--0.08MPa，干燥时间100-120分钟；
第八步.磨粉：将干燥后的硬葡聚糖纤维用粉碎机磨粉，至产品完全通过80-200目筛。
2.如权利要求1所述的小核菌硬葡聚糖工业量产发酵及提取工艺，其特征是，所述碳源为淀粉、蔗糖、麦芽糖、葡萄糖中的一种或其任意比例的混合物。
3.如权利要求1或2所述的小核菌硬葡聚糖工业量产发酵及提取工艺，其特征是，所述氮源为玉米浆、大豆、酵母膏或粉、硝酸中的三种或任意比例的混合物。
4.如权利要求2或3所述小核菌硬葡聚糖工业量产发酵及提取工艺，其特征是，二级种子液是所述发酵罐中的发酵料液的体积5％-10％。
5.如权利要求4所述小核菌硬葡聚糖工业量产发酵及提取工艺，其特征是，所述的发酵罐中的发酵料液体积是发酵罐待容纳体积的75％-85％。
6.如权利要求1或5所述小核菌硬葡聚糖工业量产发酵及提取工艺，其特征是，所述干燥后的纤维状硬葡聚糖经粉碎完全通过80目筛。
7.如权利要求1所述小核菌硬葡聚糖工业量产发酵及提取工艺，其特征是，在发酵罐发酵40h和48h时，分别取发酵罐内发酵液样200mL-500mL，检测其PH、旋转粘度、残糖。
8.如权利要求1或7所述小核菌硬葡聚糖工业量产发酵及提取工艺，其特征是，所述40h或48h时检测的残糖低于0.5％且旋转粘度高于10000cp，终止发酵放罐。
9.如权利要求8所述小核菌硬葡聚糖工业量产发酵及提取工艺，其特征是，所述48h时检测的残糖在0.8-1.2且旋转粘度大于10000cp，则向发酵罐补无菌水，补水体积是发酵液体积的5％-8％，温度27℃-31℃，继续发酵至残糖低于0.5％。
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