CN103013844B

CN103013844B - 一株高产中性蛋白酶的米曲霉菌株及其液体发酵方法

Info

Publication number: CN103013844B
Application number: CN201210559100.9A
Authority: CN
Inventors: 刘顺启; 王兴吉; 李方方; 刘文龙
Original assignee: Shandong Longkete Enzyme Preparation Co Ltd
Current assignee: Shandong Longkete Enzyme Preparation Co Ltd
Priority date: 2012-12-20
Filing date: 2012-12-20
Publication date: 2014-08-27
Anticipated expiration: 2032-12-20
Also published as: CN103013844A

Abstract

本发明涉及一株高产中性蛋白酶的米曲霉突变株及其液体发酵方法，所述米曲霉菌株所产中性蛋白酶酶活力在20821u/mL以上。米曲霉突变菌株CGMCC6848液体发酵产中性蛋白酶的方法，包括如下步骤：1种子培养；2液体发酵；3中性蛋白酶的提取与精制。本发明建立的液体发酵中性蛋白酶的方法，发酵活力在2.5万u/ml，生产的中性蛋白酶在40℃保温1h后剩余酶活为91％，具有良好的耐热性，可广泛应用于食品、饲料、纺织等行业。

Description

一株高产中性蛋白酶的米曲霉菌株及其液体发酵方法

技术领域

本发明涉及一株高产中性蛋白酶的米曲霉突变株及其液体发酵技术，属于生物工程技术领域。

背景技术

中性蛋白酶作用条件温和，是最早发现并广泛应用于工业化生产的蛋白酶制剂，可广泛应用于食品、饲料、制药等行业，现在市场上多是由细菌发酵生产中性蛋白酶，还未发现有通过液体发酵米曲霉来生产中性蛋白酶的方法。米曲霉液体发酵具有酶系丰富、发酵容易控制、发酵后提取工艺简单等优点，因此受到越来越多的关注，米曲霉液体发酵受其表型的影响，产孢子的菌株进行液体发酵时往往会出现菌丝结团、发酵料液粘稠等不利现象，进一步影响发酵活力。所以，选育高产中性蛋白酶的米曲霉菌株，表型适合液体发酵，可进行大规模生产中性蛋白酶是非常有意义的任务。

发明内容

本发明的目的是提供一株适于液体发酵高产中性蛋白酶的米曲霉菌株及其液体发酵生产方法。

本发明提供一种米曲霉(Aspergillus oryzae)菌种，该菌株已经于2012年11月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，(邮编100101)，保藏编号为CGMCC No6848。

所述米曲霉突变菌株CGMCC6848采用米曲霉M321和米曲霉J5进行多轮原生质体电融合育种选育获得。米曲霉M321在麸皮豆粕固体培养基中发酵酶活最高15000u/g，液体发酵中性蛋白酶最高450u/ml，米曲霉J5固体发酵产酶最高活力为8000u/g，液体发酵最高酶活为10000u/ml，突变株CGMCC6848液体发酵酶活达到20000u/ml，经发酵条件优化后，液体发酵平均产酶活力在25000u/ml。

米曲霉M321是经紫外诱变筛选到的高产中性蛋白酶菌株，其液体发酵产中性蛋白酶酶活力极低，不到500u/ml，米曲霉J5生长表型为菌丝型不产孢子，液体培养其菌丝短细，发酵液混合均匀，物料、溶氧传递效果良好，为了得到一株适合液体发酵的高产中性蛋白酶菌株，对两株菌先进行紫外灭活后再进行多轮电融合选育，直到选育出一株低产孢子、高产蛋白酶的菌株。

所述米曲霉菌株所产中性蛋白酶酶活力在20821u/mL以上。

米曲霉突变菌株CGMCC6848液体发酵产中性蛋白酶的的方法，包括如下步骤：

种子培养：菌株进行摇瓶培养，摇瓶培养基配方为淀粉3-10％，大豆蛋白2-5％，麸皮0.2-0.5％，硝酸钠0.2-0.5％，磷酸二氢钾0.2-0.5％，玉米浆0.5-2％。培养温度31-33℃，培养时间50-70小时。

液体发酵：在50L发酵罐进行液体发酵实验，接种量10-15％，发酵过程补料控制pH在6.0-6.5，培养温度30-32℃，罐压0.07MPa，风量0.2-1.5vvm，培养周期100-120小时。

中性蛋白酶的提取与精制：发酵结束后，按发酵液体积加入40％的水和0.3％氯化钙，加入3％珍珠岩助滤剂，进行压滤，滤液经超滤浓缩后可进行酒精溶析得到固体酶制剂，也可将浓缩液加入稳定剂(金属离子)得到液体酶制剂。

发酵培养基配方为：淀粉5-10％，大豆蛋白3-6％，麸皮1-3％，硝酸钠0.3-1％，磷酸二氢钾0.2-0.8％，玉米浆1-2％，补料配方为：淀粉10-20％，豆饼粉4-8％，硫酸铵0.2-0.5％，玉米浆0.8-1.5％。

有益效果

本发明通过对原始菌株进行诱变提高酶活后，对两株不同表型的米曲霉进行原生质体融合筛选，再经过培养基优化和发酵工艺条件优化，建立了液体发酵中性蛋白酶的方法，发酵活力在2.5万u/ml，生产的中性蛋白酶在40℃保温1h后剩余酶活为91％，具有良好的耐热性，可广泛应用于食品、饲料、纺织等行业。

附图说明：

图1不同pH下的相对酶活

图2不同温度下的相对酶活

具体实施方式：

以下通过具体实施例对本发明做更详细的说明，具体实施案例仅为举例说明，不作为对本发明实施范围的限定。

菌株的选育：

1原生质体的制备

取两株出发菌株的新鲜斜面，用无菌水洗脱菌体，在有玻璃珠的试管振荡使菌体分散，离心收集菌体，用0.6M山梨醇渗透压稳定剂(0.1M柠檬酸缓冲液+0.6M山梨醇+0.01M EDTA)悬浮，离心洗涤后收集用渗透压稳定剂悬浮，置冰中备用。然后加入溶菌酶1.2％、蜗牛酶0.8％、纤维素酶0.8％，在32℃进行酶解6小时，制得原生质体备用，其中原生质体制备率和再生率的计算方法如下：

在普通培养基培养并计菌落数为A；将原生质体悬浮液稀释一定倍数，在普通培养基培养并计菌落数为B；在高渗再生培养基培养并计菌落数为C。

原生质体制备率=(A-B)/A*100％

原生质体再生率＝(C-B)/(A-B)*100％

普通培养基配方(g/l)：KH₂PO₄1g，MgSO₄0.5g，(NH₄)₂SO₄0.6g，可溶性淀粉20g，琼脂粉20g，豆汁1000ml。

豆汁再生培养基(g/l)：KH₂PO₄1g，MgSO₄0.8g，(NH₄)₂SO₄0.6g，NaCl35.1g，可溶性淀粉12g，琼脂粉20g，豆汁1000ml。

2原生质体电融合

将制得的两株菌的原生质体稀释到浓度为10⁶个/ml，各取5ml分别置于2个平板上，在超净工作台中，于18W紫外灯15cm处照射15min，将紫外灭活的两亲本菌株的原生质体悬液用0.6mol/l的山梨醇溶液洗涤2次后分别悬于电击液中，然后将两亲本菌株的原生质体混合均匀，进行电融合操作，选用方波脉冲，条件为低压：120v；脉冲宽度：100ms；脉冲个数：10；脉冲间隔时间：8s；高压：3000v；脉冲宽度：0.5ms：脉冲个数：3；脉冲间隔时间：6s，电融合结束后，将融合液经稀释后接种在再生培养基上，30℃培养5天，长出单菌落后再将单菌落依次挑取接种在酪蛋白平板上，30℃培养4天，计算HC值，从中选出5株产孢子少且HC(HC＝水解圈直径/菌落直径)值高的新菌株，分别是F-13、F-21、F-40、F-53、F-69。

3摇瓶发酵筛选

将选出的5株菌进行摇瓶发酵，淀粉5％，大豆蛋白4％，麸皮0.5％，硝酸钠0.3％，磷酸二氢钾0.4％，玉米浆1.2％。培养温度31℃培养时间65小时，培养结束后用福林酚法测发酵液中中性蛋白酶活力，5株菌摇瓶实验中性蛋白酶活力如下：

菌株	摇瓶活力(三次实验平均值)
		F-13	5355
F-21	4976
		F-40	3433
F-53	6559
		F-69	4531

4生产菌株的表型特征

根据摇瓶实验结果，选F-53为生产菌株，进行发酵工艺优化，F-53表型特征为：

平板菌落致密，菌丝呈白色，无孢子，镜检为中间有隔膜的菌丝片段。

液体发酵生产中性蛋白酶及其提取：

发酵培养基配方为：淀粉8％，大豆蛋白5％，麸皮1％，硝酸钠0.5％，磷酸二氢钾0.5％，玉米浆2％，补料配方为：淀粉20％，豆饼粉6％，硫酸铵0.2％，玉米浆1.5％，接种量15％，发酵过程补料控制pH在6.0-6.5，培养温度30℃，罐压0.07MPa，风量0.2-1.5vvm，培养周期120小时，下表是共进行的5批发酵的发酵周期和发酵酶活力，平均发酵活力在25455u/ml。

批次	发酵周期(h)	发酵活力(u/ml)
			1	126	24736
2	124	25894
			3	124	26635
4	125	25142
			5	125	24871

所产中性蛋白酶的基本性质

以pH7.5、温度40℃酶活力51446u/mL为基准，分别在不同pH下和不同温度下测定酶活力，该突变株所产中性蛋白酶的最适作用pH范围在6.5-7.5，其最适温度范围为45-55℃。

另本发明中性蛋白酶酶活测定的具体方法如下

(1)定义

1g酶粉(或1mL液体酶)，在一定温度和pH值的条件下，1min水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位，以u/g(u/mL)。

(2)原理

蛋白酶在一定温度和pH条件下，水解酪素(哺乳类为幼子生长提供氮源的一种蛋白质)底物，产生含有酚基的氨基酸【如：酪氨酸(α-氨基-β-对羟苯基丙酸)，色氨酸(α氨基-β-吲哚基丙酸)等】，在碱性条件下，将福林试剂还原，生成鉬蓝和钨蓝，用分光光度计测定吸光度，计算其酶活力。

(3)试剂和溶液

福林试剂的制备

于2000mL磨口回流装置中加入钨酸钠(Na₂WO₄·2H₂O)100g，钼酸钠(Na₂M₀O₄·2H₂O)25g，水700mL，85％磷酸50mL，浓盐酸100mL，小火沸腾10h，取下回流冷却器，在通风橱中加入硫酸锂(LiSO₄)50g，水50mL和数滴浓溴水(99％)，再微沸15min，以除去多余的溴(冷后仍有绿色再加溴水，再微沸除去过量的溴)，冷却，加水定容至1000mL，混匀，过滤。制得的试剂应呈金黄色，贮存于棕色瓶中。

使用溶液：一份福林试剂与二份水混合，摇匀。

碳酸钠溶液c(Na₂CO₃)=0.4mol/L

取无水碳酸钠42.4g，用水溶解并定容至1000mL。

三氯乙酸c(CCL₃·COOH)=0.4mol/L

取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000mL。

氢氧化钠溶液c＝0.5mol/L

按GB601配制。

盐酸溶液c＝1mol/L及0.1mol/L

GB601：量取90mL盐酸，注入1000mL水中，摇匀，即得1mol/L盐酸。

量取9mL盐酸，注入1000mL水中，摇匀，即得0.1mol/L盐酸。

磷酸缓冲液(pH＝7.5)

称取磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)6.02g和磷酸二氢钠(NaH₂PO₄·2H₂O)0.5g，加水溶解并定容至1000mL，须用pH计校正。

10g/L酪素(酪蛋白)溶液

称取酪素1.000g，精确至0.001g，用少量0.5mol/L氢氧化钠溶液(若酸性蛋白酶则用浓乳酸2～3滴)湿润后，加入pH7.5的缓冲液约80mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转入100mL的容量瓶中，用缓冲液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存，有效期3天。

100ug/mL L-酪氨酸标准溶液

a.称取预先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g，精确至0.0002g，用1mol/L盐酸60mL溶解后定容至100mL，即为1mg/mL酪氨酸标准溶液。

b.吸取1mg/mL酪氨酸标准溶液10.00mL，用0.1mol/L盐酸定容至100mL，即得到100ug/mL-酪氨酸标准溶液。

(4)仪器和设备

恒温水浴锅：40±0.2℃

分光光度计：应符合GB9721的规定

(5)分析步骤

标准曲线的绘制

a.L-酪氨酸标准溶液

b.分别取1.00mL(须做平行试验)，各加0.4mol/L碳酸钠溶液5.00mL，福林试剂使用溶液1.00mL，置于40±0.2℃水浴中显色20min，取出，用分光光度计于波长680nm，分别测定其吸光值，以不含酪氨酸的“0”号管为空白，以吸光值A为纵坐标，酪氨酸浓度c为横坐标，绘制标准曲线(此曲线应通过零点)。

根据作图或用回归方程，计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量(ug)，即为吸光常数K值。其K值应在95～100范围内。

(6)待测酶液的制备

a.滤液根据酶活力用缓冲液稀释至适当浓度，供测定用(稀释至被测吸光值在0.25～0.40范围内)。

b.按下列程序操作：

试管A(空白)

加酶液1.00mL(40±0.2℃℃)

加三氯乙酸2.00mL(摇匀)(40±0.2℃℃)

加酪素1.00mL(摇匀)

取出静止10min，过滤

取1.00mL滤液

加碳酸钠溶液5.00mL

加福林试剂使用液1.00mL，(40±0.2℃℃，显色20min)

于680nm波长，用10mm比色皿测其吸光值

试管B(酶样品，需做三个平行试样)

加酶液1.00mL(40±0.2℃℃)

加酪素1.00mL(摇匀，40±0.2℃℃反应10min)

加三氯乙酸2.00mL(摇匀)

取出静止10min，过滤

取1.00mL滤液

加碳酸钠溶液5.00mL

加福林试剂使用液1.00mL，(40±0.2℃℃，显色20min)

于680nm波长，用10mm比色皿测其吸光值

(7)酶活力计算

X=A×K×4/10×n

式中：

X----样品的酶活力，u/g(u/mL)；

A----样品平行试验的平均吸光值；

K----吸光常数；

4----反应的总体积；

10---反应时间10min，以1min计；

n----稀释倍数。

所得结果表示至整数，平行试验结果的允许差不得超过3％。

Claims

1.一株高产中性蛋白酶的米曲霉菌株(Aspergillus oryzae)，其特征在于：所述菌株保藏号为CGMCC No.6848，具有低产孢子、高产中性蛋白酶的特性，所产中性蛋白酶活力在20821u/mL以上，经发酵条件优化后平均产酶活力在2.5万u/ml。

2.一种利用米曲霉菌株CGMCC No.6848生产中性蛋白酶的方法，包括如下步骤：

种子培养：菌株进行摇瓶培养，摇瓶培养基配方为淀粉3-10%，大豆蛋白2-5%，麸皮0.2-0.5%，硝酸钠0.2-0.5%，磷酸二氢钾0.2-0.5%，玉米浆0.5-2%；培养温度31-33℃，培养时间50-70小时；

液体发酵：在50L发酵罐进行液体发酵实验，接种量10-15%，发酵过程补料控制pH在6.0-6.5，培养温度30-32℃，罐压0.07MPa,风量0.2-1.5vvm,培养周期100-120小时；发酵培养基配方为：淀粉5-10%，大豆蛋白3-6%，麸皮1-3%，硝酸钠0.3-1%，磷酸二氢钾0.2-0.8%,玉米浆1-2%，补料配方为：淀粉10-20%,豆饼粉4-8%，硫酸铵0.2-0.5%，玉米浆0.8-1.5%；发酵后进行中性蛋白酶的提取与精制,方法如下：发酵结束后，按发酵液体积加入40%的水和0.3%氯化钙，加入3%珍珠岩助滤剂，进行压滤，滤液经超滤浓缩后可进行酒精溶析得到固体酶制剂。

3.根据权利要求1所述的高产中性蛋白酶的米曲霉菌株在生产中性蛋白酶中的应用。