CN103045503B - 一种产生胶原蛋白酶的菌株及其应用 - Google Patents

一种产生胶原蛋白酶的菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种产胶原蛋白酶的新型微生物嗜虫沙雷氏菌（Serratiaentomophila）DLW-22及其筛选方法和应用，该菌在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.6488。该菌株是从海参肠道混合菌液通过分离、筛选得到的。该菌株能够胞外产生高活性的胶原蛋白酶，传代培养8～12代后，仍高产胶原蛋白酶，在对鱼皮等大分子的胶原蛋白具有很好的降解作用。该菌株在胶原蛋白的水解以及利用胶原蛋白的产品的制备方面具有广阔的应用前景。

Description

一种产生胶原蛋白酶的菌株及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株产生胶原蛋白酶的菌株的分离、筛选，鉴定和其在降解胶原蛋白中的应用以及利用该菌生产胶原蛋白酶的方法。
背景技术
胶原蛋白是一种白色、不透明、无支链的天然的纤维蛋白质，它广泛存在于动物的皮肤、骨骼、牙齿、肌腱韧带和血管中，是哺乳动物体内含量最丰富的蛋白质之一。其主要功能是维持皮肤和组织器官的形态和结构，起到支撑器官和保护机体的功能。
由于胶原蛋白具有独特的三股超螺旋结构，性质十分稳定，一般的加工温度及短时间加热都不能使其分解，从而造成其消化吸收困难，不易被人体充分利用。而将胶原蛋白水解为胶原短肽，则其在消化吸收、营养、功能特性等方面都会得到显著地提高。公开文献（唐传核等.胶原的开发及利用.肉类研究，2000，3：41～44）已报道，将胶原蛋白水解成寡肽产物，可以在不破坏其营养价值的情况下获得如下功能性：胶原蛋白短肽具有易消化吸收、保护胃黏膜及抗溃疡、抗过敏、降血压、抗菌、抗氧化、降胆固醇、抗衰老、促进伤口愈合、增强骨强度和预防骨质疏松、预防关节炎、促进角膜上皮损伤的修复和促进角膜上皮的生长等多种生理活性。另外，通过水解将大分子的胶原蛋白转化成主要含有小分子肽和氨基酸的水解物，可以改善胶原蛋白的水溶性，方便加工，有利于开拓其食品用途。如鱼皮胶原为原料制备出类此水解物，则可以为鱼皮的合理利用开辟新途径。
目前，将食品蛋白质水解为肽的方法主要有酸、碱解法和酶解法。其中酶水解法，水解条件温和，氨基酸不被破坏等优点，目前在广泛应用。酶水解食品蛋白的具体方法,如专利：JP8027035A；CN1344138A等。现在制备胶原蛋白短肽的酶均为市售的普通蛋白酶。酶源单一，成本较高等特点影响了胶原蛋白及相关产品的开发和利用。筛选新的胶原蛋白酶产生菌，优化胶原蛋白酶产生菌的培养条件，分离胶原蛋白酶等的研究对丰富和利用胶原蛋白酶及胶原蛋白的开发利用有深远意义。海参体壁主要成分是胶原蛋白，海参肠道自溶酶对其体壁蛋白质水解活性十分高，而且其自溶酶主要来自于自身肠道菌。海参肠道菌群是筛选产胶原蛋白酶菌的很好的原料。
发明内容
本发明的一个目的是提供一株产胶原蛋白酶的菌株及其筛选方法。
本发明所提供的嗜虫沙雷氏菌（Serratia entomophila）DLW-22是从海参肠道菌群中分离、筛选得到的，已于2012年8月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称：CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101），保藏号为CGMCCNo.6488，属于沙雷氏菌属（Serratia）。
本发明的嗜虫沙雷氏菌（Serratia entomophila）DLW-22用如下方法分离、筛选得到：
①海参肠道混合菌液的制备：用无菌水将海参活体洗净，取部分肠段或全肠，混合于无菌水中，震荡，离心后吸取上清液，接种于5～15倍体积的基础培养基中富集培养，在25～45℃，摇瓶培养24～48h，获得海参肠道菌混合液；
其中所述基础培养基：每升蒸馏水中含有酵母膏5g，NaCl 10g,蛋白胨10g,pH为自然；
②初筛：将步骤(1)制备的海参肠道菌混合液，梯度稀释后涂布于初筛培养基平板上，25～45℃倒置培养至形成单菌落，观察并选取具有透明圈的单菌落，转至另一初筛平板上，30～40℃培养24～48h，在菌落周围滴加酸性汞试剂，观察透明圈形成情况；
其中所述的初筛培养基：每升蒸馏水中明胶20g，葡萄糖30g,蛋白胨5g，KH2PO4 0.5g，MgSO4.7H2O 0.2g，NaCl 0.1g，pH为自然；所述的酸性汞试剂：HgCl2 15g，浓盐酸20g，溶于蒸馏水，定容至100mL；
③复筛：挑取滴加酸性汞试剂时有明显透明圈的菌落，接种于种子培养基中，摇瓶培养12～24h；接种至发酵培养基中，25～45℃摇瓶培养24～48h，得到菌培养液；
其中所述的种子培养基：每升蒸馏水中含有酵母膏10g，蛋白胨10g，NaCl5g,pH为6.5～9.5；发酵培养基：每升蒸馏水中含有葡萄糖20g，酵母膏1.5g，蛋白胨10g，CaC12 0.05g，NaH2PO4.2H2O 0.5g，K2HPO4.3H2O 2.5g，pH为6.5～9.5；
④对步骤③得到的菌培养液进行活菌数的测定,并对其离心后的上清液进行胶原蛋白酶酶活力测定，筛选出一株活菌数和胶原蛋白酶活力良好的菌株，命名为DLW-22。
经形态鉴定及生物学特性研究，本发明的嗜虫沙雷氏菌（Serratiaentomophila）DLW-22（保藏号：CGMCC No.6488），具有以下特征：
（1）形态特征
菌落形态小于0.5mm的圆形白色小菌落，边缘整齐，菌落不透明，有臭味，表面光滑，中央微隆起；细胞卵圆形或不规则，直径约0.5～0.7μm，常二联；半固体培养基穿刺接种，生长物向四周呈云雾状扩散，其边缘呈云雾状，证明具有运动性。
（2）生理生化特征
可在有氧及无氧条件下利用葡萄糖产酸但不产气，氧化酶、苯丙氨酸脱氨酶、硫化氢、L-阿拉伯糖、山梨醇、鸟氨酸、甲基红、棉籽糖、木糖、侧金盏花醇、尿素、吲哚、酪氨酸试验结果为阴性；DNA酶、海藻糖、接触酶、柠檬酸盐、酪素试验结果为阳性。
（3）分子鉴定结果
进行16S rDNA序列测定，结果表明16S rDNA序列长度1455bp，BLAST结果表明其与沙雷氏菌属的粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens AU1209）相似度最高，达到99%以上，与嗜线虫致病杆菌（Serratia nematodiphila DZ0503SBS1）以及气味沙雷氏菌（Serratia odorifera DSM4582）亲缘关系较为接近。菌株DLW-22的16S rDNA序列具体可见序列表。
根据菌株的筛选、细胞形态特征和生理生化特征分析，结合16S rDNA基因序列相似性，鉴定本发明的菌株属于沙雷氏菌属（Serratia），命名为嗜虫沙雷氏菌（Serratia entomophila）DLW-22。
本发明还公开了嗜虫沙雷氏菌（Serratia entomophila）DLW-22在水解胶原蛋白中的应用。鱼皮液化实验表明，本发明菌株的培养液（含有菌株产生的胶原蛋白酶）对块状鱼皮的降解率达到95%以上。另外，本发明菌株传代培养8-12代，其培养液对块状鱼皮的降解率均达到90％以上，说明本发明菌株产胶原蛋白酶的稳定性良好。
本发明的菌株DLW-22，其培养液对胶原蛋白的水解条件优选为：水解液pH7.5～8.5，水解温度为38～42℃，水解时间为24～48h。
本发明的嗜虫沙雷氏菌（Serratia entomophila）DLW-22在使用胶原蛋白的功能性产品中的应用也属于本发明的保护范围。
上述应用中，所述利用胶原蛋白的功能性产品可为使用胶原蛋白的药物组合物、使用胶原蛋白的化妆品、使用胶原蛋白的食品、使用骨胶原蛋白的动物饲料。
本发明的另一目的是提供一种利用权利要求1所述的菌株DLW-22制备胶原蛋白酶的方法，包括如下步骤：
（1）将菌株DLW-22接种至种子培养基中，30～45℃、培养5～12h；
（2）将步骤（1）培养的菌培养液接入发酵培养基中，30～45℃、培养12～48h；
（3）将步骤（2）的培养液经离心，上清液用硫酸铵饱和溶液沉淀，沉淀经冷冻干燥后，即得胶原蛋白酶；
其中所述种子培养基包括如下成分：每升蒸馏水中含有酵母膏10g，蛋白胨10g，NaCl 5g，pH为6.5～9.5；发酵培养基包括如下成分：每升蒸馏水中含有葡萄糖20g，酵母膏1.5g，蛋白胨10g，CaC12 0.05g，NaH2PO4.2H2O 0.5g，K2HPO4.3H2O2.5g，pH为6.5～9.5。
在上述方法中，步骤（2）所述菌培养液与发酵培养基的体积比为1:10～20；步骤（3）所述离心速度为8000rpm。
本发明还提供嗜虫沙雷氏菌（Serratia entomophila）DLW-22的优化发酵条件，根据培养液中的活菌数和培养液离心上清液中胶原蛋白酶酶活力为指标，优化DLW-22的发酵条件，确定最适培养基为发酵培养基，培养基的pH为6.5～9.5，优选pH为7.5；培养基体积为容器总体积的30～70%，优选为40%；培养温度为30～45℃，优选为35℃；培养时间为24～48h，优选为24～36h。
本发明的嗜虫沙雷氏菌（Serratia entomophila）DLW-22是一株高产胶原蛋白酶、所产胶原蛋白酶对胶原蛋白的水解效率高、产胶原蛋白的稳定性极高的菌株。该菌株培养要求简单，不需要特殊药品及设备。该菌株适应性强，兼性厌氧，生长条件易控制。在一般的细菌培养基上，温度30～45℃、pH 6.5～9.5范围内均可生长。DLW-22菌在传代8～12后，仍高产胶原蛋白酶，在对鱼皮等大分子的胶原蛋白具有很好的降解作用。该菌株在胶原蛋白的水解以及利用胶原蛋白的产品的制备方面具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明菌株的初筛步骤中，在单菌落周围滴加酸性汞试剂时观察到的透明圈形成情况。
图2为本发明菌株的形态扫描电镜图。
图3为利用本发明的菌株水解鱼皮前的鱼皮和溶液的状态，其中左瓶为鱼皮中加入100mL无菌水的对照组；右瓶为鱼皮中加入100mL本发明菌株的发酵上清液的实验组。
图4为利用本发明的菌株水解鱼皮后的鱼皮和溶液的状态，其中左瓶为鱼皮中加入100mL无菌水的对照组，右瓶为鱼皮中加入100mL本发明菌株的发酵上清液的实验组。
具体实施方式
以下的实施例便于更好的理解本发明，但并不限定本发明。另外，下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学试剂公司购买。其中“pH自然”是指培养基配制时不调pH值。
1.培养基
①基础培养基：每升蒸馏水中含有酵母膏5g，NaCl 10g,蛋白胨10g,pH自然；121℃灭菌15min。
②初筛培养基：每升蒸馏水中明胶20g，葡萄糖30g，蛋白胨5g，KH2PO40.5g，MgSO4.7H2O 0.2g，NaCl 0.1g，pH为自然，121℃灭菌15min；
③种子培养基：每升蒸馏水中含有酵母膏10g，蛋白胨10g，NaCl 5g，pH 7.5,121℃灭菌15min。
④发酵培养基：每升蒸馏水中含有葡萄糖20g，酵母膏1.5g，蛋白胨10g，CaC12 0.05g，NaH2PO4.2H2O 0.5g，K2HPO4.3H2O 2.5g，pH 7.5,121℃灭菌15min。
⑤肉汤培养基：每升蒸馏水中含有牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，pH7.5，121℃灭菌15min。
⑥PGY培养基：每升蒸馏水中含有蛋白胨10g,酵母膏5g,葡萄糖1g,pH7.5,121℃灭菌15min。
2.活菌数的计算方法
取200μL菌培养悬浮液于装有800μL无菌水的EP管中，充分混匀，依次稀释6，7次，然后吸取不同稀释度的菌悬液各200μL至已凝固的菌计数用培养基培养皿中，用三角耙涂布均匀，在30℃条件下培养12h后统计其菌落数，计算菌液中微生物的数量。
计算公式：活菌数(原菌液/mL)＝每一稀释度平皿菌落数×稀释倍数×5
菌计数用培养基：每升蒸馏水中含有葡萄糖3g，酵母浸粉9g，氯化钠5g，琼脂2%，121℃灭菌15min。
3.胶原蛋白酶酶活力的测定
采用Folin-酚法，即酪蛋白为底物，以酪氨酸为标准物。
样品的准备：取1mL用蒸馏水稀释10倍的酶液放入试管中，加入1mL 2%酪蛋白溶液，混合均匀，40℃水浴中准确加热10min后，立即加入2mL、0.4mol/L三氯乙酸溶液终止反应，继续保温20min使残余的蛋白质沉淀，过滤，取1mL滤液，用Folin-酚法测定滤液中的酪氨酸含量（μg/mL）。每一样品设3次重复，结果取平均数。
对照品的准备：与样品的准备方法相同，区别在于试管中的酶液先加入三氯醋酸溶液使酶失活后，再加入酪蛋白溶液。
其中，酶液和酪蛋白溶液混合之前，两种溶液均在40℃水浴中预热2min以上；所述酶液为菌种培养液的离心上清液。
胶原蛋白酶酶活力计算公式：酶活力＝g/t×v×n
式中，g为样品中的酪氨酸重量（μg）；t为反应时间（min）；n为酶液稀释倍数；v为反应液体积（mL）。
酶活力定义：在40℃条件下每毫升酶液在每min内水解酪蛋白产生1μg酪氨酸的酶量（U/mL)
相对酶活力：（对照品酶活力-样品酶活力）/对照品酶活力×100%。
实施例1菌株DLW-22的筛选、分离与鉴定
一、菌株DLW-22的分离、筛选
本发明从海参肠道菌群中分离、筛选菌株。所述海参为大连产刺参（Apostichopus japonicus）,活体，购自大连长兴水产品批发市场。
①海参肠道混合菌液的制备
用无菌水将海参活体洗净，于无菌室中解剖取肠。取部分肠段混合于一定体积的无菌水中，充分震荡，离心后吸取上清液接种于10倍的基础培养基中，在35℃、170rpm摇瓶培养48h，获得海参肠道混合菌液，4℃保存，备用。
②初筛
将步骤(1)制备的海参肠道混合菌液，梯度稀释后涂布于含有明胶的初筛培养基平板，30℃倒置培养至形成单菌落，观察并选取具有透明圈的单菌落，转至另一明胶平板上，35℃培养24h。在菌落周围滴加酸性汞试剂，观察透明圈形成情况。
酸性汞试剂:HgCl2 15g，浓盐酸20g，溶于蒸馏水，定容至100mL。
③复筛
挑取滴加酸性汞试剂时有明显透明圈的菌落（图1），接种于种子培养基中，在30℃、170rpm摇瓶培养16h,按5%（v/v）接种量接种于发酵培养基中，35℃、170rpm摇瓶培养48h，得到菌培养液，菌培养液离心分离，收集离心上清液。
按上述方法测定培养液中的活菌数和菌培养液离心上清液中的胶原蛋白酶酶活力，筛选出一株活菌数和胶原蛋白酶活力良好的菌株，命名为DLW-22。
④菌种保存
将步骤③得到的菌株DLW-22在种子培养基中培养，并将培养物制成30％甘油管，在-80℃冰箱保存，备用。
二、菌株DLW-22的鉴定
（1）形态特征
如图2所示，菌落形态小于0.5mm的圆形白色小菌落，边缘整齐，不透明，有臭味，菌落表面光滑，中央微隆起，细胞卵圆形或不规则，直径约0.5～0.7μm，常二联；半固体培养基穿刺接种，生长物向四周呈云雾状扩散，其边缘呈云雾状，证明具有运动性。
（2）生理生化特征
可在有氧或无氧条件下利用葡萄糖产酸，但不产气，氧化酶、苯丙氨酸脱氨酶、硫化氢、L-阿拉伯糖、山梨醇、鸟氨酸、甲基红、棉籽糖、木糖、侧金盏花醇、尿素、吲哚、酪氨酸试验结果为阴性；DNA酶、海藻糖、接触酶、柠檬酸盐、酪素试验结果为阳性。
（3）分子鉴定结果
进行16S rDNA序列测定，结果表明16S rDNA序列长度1455bp，BLAST结果表明其与沙雷氏菌属的粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens AU1209）相似度最高，达到99%以上，与嗜线虫致病杆菌(Serratia nematodiphila DZ0503SBS1）以及气味沙雷氏菌(Serratia odorifera DSM4582）亲缘关系较为接近，因此该菌株属于沙雷氏菌属（Serratia）。
16S rDNA序列见序列表。
三、菌株DLW-22的保藏
通过以上分离、筛选与菌株鉴定结果，确认菌株DLW-22为来自于沙雷氏菌属（Serratia)的新菌，将其命名为DLW-22，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.6488。
实施例2菌株DLW-22的发酵条件优化
（1）培养基的确定
将菌株DLW-22以2×106个/mL培养基的接菌浓度分别接种于营养肉汤培养基、PGY培养基、发酵培养基中，30℃、pH 7.5，好氧培养24h，按上述方法测定菌培养液中的活菌数和菌培养液离心上清液中的胶原蛋白酶活力，结果见表1。
表1不同培养基对活菌数和相对酶活力的影响
由表1可知，本发明所述的菌株DLW-22在发酵培养基中发酵产生胶原蛋白酶的相对酶活力最高，说明菌株DLW-22的最适培养基为发酵培养基。
（2）培养基最适pH的确定
将菌株DWL-22以2×106个/mL培养基的接种量接种于初始pH分别为5.5、6.5、7.5、8.5、9.5的发酵培养基中，在30℃、170rpm摇瓶培养24h后，比较测定培养液中的活菌数和离心上清液中的胶原蛋白酶活力，结果见表2。
表2培养基初始pH值对活菌数和相对酶活力的影响
由表2可知，pH为6.5～8.5时，随pH增大，培养液中的活菌数和胶原蛋白酶活力均缓慢上升，在pH为8～9时，该菌株产胶原蛋白酶活性和活菌数开始下降，尤其pH 9.5时活菌数下降明显，综上以上特点初始pH应控制在6.5～9.5，优选为pH 7.5。
（3）最适装瓶量的确定
用250mL三角瓶进行培养时，分别取80、110、140、170、200mL装瓶量的发酵培养基，将菌株DLW-22以2×106个/mL培养基的浓度接种，35℃、170rpm摇瓶培养24h后，比较测定菌培养液中的活菌数和离心上清液中的胶原蛋白酶活力。
由于氧气在液体中的低溶解度，当摇床转数一定时，装瓶量决定溶氧量。该菌株明显为好氧菌，装瓶量在100mL以下时，酶活力虽然是随装瓶量降低而升高，但是其变化不明显；同时当装瓶量为100mL时，活菌数最大，其它装瓶量条件下活菌数下降不明显，当装瓶量为200mL时开始下降，可能是上层空气不足导致。综上可以确定，当用250mL三角瓶培养菌株DLW-22时，最适装瓶量为80～100mL。
同样的方法确定用500mL，1000mL三角瓶培养菌株DLW-22时,最适装瓶量分别为150～350mL，300～700mL。
（4）最适培养温度的确定
将菌株DWL-22以2×106个/mL培养基的浓度分别接种于发酵培养基中，分别在25℃、30℃、35℃、40℃、45℃条件下，170rpm摇瓶培养24h，比较测定菌培养液中的活菌数和离心上清液中的胶原蛋白酶活力，结果见表3。
表3培养温度对活菌数和相对酶活力的影响
从表3可知，25℃到30℃之间，酶活变化不大，30℃之后酶活开始上升，45℃时达到最高，45℃时的酶活相比30℃时提高了32%，但活菌数在35℃时最高，40℃开始下降，从这一结果确定菌株DLW-22的最适培养温度为30～45℃，优选为35℃。
（5）最适培养时间的确定
将菌株DWL-22以2×106个/mL培养基的浓度接种于发酵培养基中，35℃条件下摇瓶培养，分别于12、24、36、48、72h后，比较测定菌培养液中的活菌数和离心上清液中的胶原蛋白酶活力，结果见表4。
表4培养时间对活菌数和相对酶活力的影响
从表4可知，12～36h之间，培养液活菌数和酶活力均提高，36h时达到最高，但36h后胶原蛋白酶活力开始下降，从以上结果确定菌株DWL-22的最适培养时间为24～48h，优选24～36h。
实施例3菌株DLW-22在水解胶原蛋白中的应用
一、鱼皮液化试验（1）
将菌株DLW-22以2×106个/mL培养基的浓度接种于发酵培养基中，30℃、pH7.5，好氧培养24h。将发酵液于4℃、8000rpm离心10min，弃沉淀，得到发酵上清液。
取1g鱼皮置于玻璃瓶中，加入100mL菌株DLW-22的发酵上清液，在40℃、pH 8.5条件下，摇床反应6h，观察块状鱼皮水解情况。100mL无菌水为空白对照。结果见图3和图4。
从图3和图4可知，对鱼皮进行水解后，片状鱼皮被水解为浆状，仅余少量碎片，上清液由澄清变浑浊；以无菌水为对照水解的片状鱼皮无明显变化，说明该菌在其发酵中有效产生胞外胶原蛋白酶。
二、鱼皮液化试验（2）
将菌株DLW-22在种子培养基中，传代培养8～12代，按鱼皮液化试验（1）的方法进行鱼皮液化试验，结果表明传代8～12代的菌株DLW-22对鱼皮的降解率仍保持90％，说明菌株DWL-22产胶原蛋白酶的稳定性很好。
实施例4利用菌株DLW-22制备胶原蛋白酶的方法
（1）将-80℃保存的DLW-22，在室温放置2h后，接入至100mL种子培养基中，在30℃、170rpm摇床培养8h；
（2）将步骤（1）培养的菌培养液50mL，接入至1L发酵培养基中，30℃、170rpm摇床培养24h；
（3）将步骤（2）的发酵培养液在8000rpm、4℃、离心15min，收集离心上清液，加入固体硫酸铵至其饱和度达到70%，在4℃放置12h后，8000rpm、4℃条件下离心15min，弃上清，取沉淀，沉淀进行冷冻干燥，即可获得胶原蛋白酶粉。

Claims (2)

1.一种产胶原蛋白酶的菌株，该菌株为嗜虫沙雷氏菌（Serratiaentomophila）DLW-22，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.6488。
2.如权利要求1所述的菌株DLW-22在水解胶原蛋白中的应用。
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M. Eugenia Nunez-Valdez，等.Identification of a Putative Mexican Strain of Serratia entomophila Pathogenic against Root-Damaging Larvae ofScarabaeidae (Coleoptera).《Applied and Environmental Microbiology》.2008,第74卷(第3期),802－810. *
潘映红,等.几种微生物杀虫蛋白基因研究进展.《生物技术通报》.1999,(第2期),1-4. *
王红英，等.一株产胶原蛋白酶嗜虫沙雷氏菌的分离与鉴定.《食品工业科技》.2013,第33卷(第13期),143－145. *

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