CN106167782B - 高效降解豆粕抗原蛋白的芽孢杆菌及其发酵豆粕的方法 - Google Patents

高效降解豆粕抗原蛋白的芽孢杆菌及其发酵豆粕的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高效降解豆粕抗原蛋白的芽孢杆菌及其发酵豆粕的方法。所述芽孢杆菌，属于枯草芽孢杆菌枯草亚种Bacillus subtilis subsp.subtilis，命名为ZJUFA‑3，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。一种采用所述的枯草芽孢杆菌株ZJUFA‑3发酵豆粕的方法，1）豆粕原料中加水至含水质量百分比为40%~55%；2）加入OD600值为1.2菌株培养液至终浓度质量百分比为3%~8%，混匀，于30~40℃好氧发酵12~48小时。本发明提供的枯草芽孢杆菌ZJUFA‑3能在24h内，降解绝大多数抗原蛋白，还能显著提高酸溶蛋白含量，发酵豆粕品质提高明显，应用于生产可大大缩短发酵时间提高生产效率。

Description

高效降解豆粕抗原蛋白的芽孢杆菌及其发酵豆粕的方法
技术领域
本发明涉及生物发酵领域，具体涉及一种高效降解豆粕抗营养因子的芽孢杆菌及其发酵豆粕的方法。
背景技术
豆粕中存在着诸多抗营养因子如抗原蛋白、胰蛋白酶抑制因子、植酸等，这些抗营养因子的存在影响畜禽对饲料中营养物质的吸收，导致肠道中有害微生物的滋生，进而造成食源性疾病如呕吐、腹泻。通过微生物发酵来降解饲料中的抗营养因子，提高动物吸收饲料中的营养物质，成为“营养解抗”的重要途径。
我国发酵饲料主要以固态发酵为主，包括好氧发酵和厌氧发酵两大类。好氧发酵发酵周期短，发酵程度及效率较高，但直接发酵易受杂菌污染。常用的菌株包括芽孢杆菌、酵母菌、小型丝状真菌（如米曲霉、黑曲霉等）。而厌氧发酵饲料养分损耗低，能提供大量的益生菌及代谢产物，但厌氧发酵对豆粕抗原蛋白降解不明显。厌氧发酵菌株主要以乳酸菌、酵母菌为主。
除了抗营养因子降解程度，发酵豆粕中酸溶蛋白（可溶性小肽含量）也是业内评判饲料品质的重要指标。低抗营养因子，同时高可溶性小肽的饲料更符合生产需求。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种高效降解豆粕抗原蛋白的芽孢杆菌及其发酵豆粕的方法。
一种高效降解豆粕抗原蛋白的芽孢杆菌，属于枯草芽孢杆菌枯草亚种Bacillussubtilis subsp.subtilis ，命名为ZJUFA-3，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心( 地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编:100101)，保藏日期为2016年8月8号，保藏编号为CGMCC NO：12825，用于发酵。
一种采用所述的枯草芽孢杆菌株ZJUFA-3发酵豆粕的方法，
1）豆粕原料中加水至含水质量百分比为40%~55%；
2）加入OD600值为1.2菌株培养液至终浓度质量百分比为3%~8%，混匀，于30~40℃好氧发酵12~48小时。
所述的菌株培养液采用LB液体培养基。
本发明的有益效果
本发明提供的枯草芽孢杆菌ZJUFA-3 能在24h 内，降解绝大多数抗原蛋白，还能显著提高酸溶蛋白含量，发酵豆粕品质提高明显，应用于生产可大大缩短发酵时间提高生产效率。
本发明提供的发酵豆粕，可替换饲料中的生料豆粕，应用于生产水产、畜禽等多种动物饲料中，由于抗原蛋白降解充分、酸溶蛋白含量显著提高，更利于动物吸收利用，促进动物生长，提高消化利用率及转化率。
附图说明
图1是SDS-PAGE检测发酵豆粕抗原蛋白含量比较图；
图2是ZJUFA-3菌落形态（左部分）及菌体形态图（右部分）；
图3是16SrDNA序列进化树分析图；
图4是芽孢杆菌保守基因gryB进化树分析图；
图5是ZJUFA-3发酵豆粕中酸溶蛋白含量比较图。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
在本发明中，如果没有特别的说明，百分数（％）或者份都指相对于组合物的重量百分数或者重量份。
本发明中提供的ZJUFA-3是一株枯草芽孢杆菌，应用于豆粕的好氧发酵，通过SDS-PAGE、ELISA等检测发酵产物中抗原蛋白降解率，证明其降解豆粕抗原蛋白的效率强于普通商业菌株。为避免好氧发酵带来的杂菌污染问题，本发明中提供了不同的豆粕预处理方式，实验验证，采用105℃高压灭菌预处理的豆粕，再进行ZJUFA-3好氧发酵，饲料中无杂菌，抗原蛋白降解程度更高。经检测， ZJUFA-3降解抗营养因子速率快，小肽含量不低于传统商业发酵菌株。
本发明还提供了利用该菌株生产发酵豆粕的方法：
1、豆粕原料中加入10%的麸皮，加入水至含水量为40%~55%。
2、加入3%~8%的菌株培养液，充分混匀。
3、于30~40℃好氧发酵12~48小时。
本发明提供的发酵豆粕的方法可以在经预处理的豆粕中加入豆粕发酵菌株随即开始发酵豆粕。
在本发明中，发酵豆粕的方法采用本领域的常规方法，具体方法及方法的各参数为本领域的技术人员所熟知。
在本发明的下述实施例中，菌株生理生化检测项目及方法参照《常见细菌鉴定手册》。
革兰氏染色具体操作步骤如下：
1）涂片固定。
2）结晶紫染色1 分钟。
3）自来水冲洗。
4）加碘液媒染约1 分钟。
5）水洗，用吸水纸吸去水分。
6）加95% 酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，20 秒后水洗，吸去水分。
7）沙黄染色液（稀）染2 分钟后，自来水冲洗。干燥，镜检。
在本发明的下述实施例中，
豆粕中水分含量：采用105℃恒重法检测；
酸溶蛋白含量：采用三氯乙酸（TCA）法（GB/T 22492-2008）检测；
抗原蛋白的降解程度：采用聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝胶电泳分析、ELISA检测分析。
实施例1 ：菌株筛选
1、分离 江浙地区传统腌菜1g，溶于10ml 无菌水中，75℃水浴15min，然后用无菌水10 倍梯度稀释，取4 个稀释梯度（10-3、10-4、10-5、10-6）菌悬液在LB 平板上涂布，每个稀释度至少3个平板，37℃培养24h 左右获得单菌落。
2、初筛 挑取单菌落点在豆粕抗原蛋白平板上，37℃培养24h，挑选水解圈大的菌株，镜检，采用划线分离的方法纯化，获得初筛菌株。
3、复筛 以大豆球蛋白降解率、β-伴球蛋白降解率为依据指标进行菌株复筛，具体过程如下：将初筛获得的菌株接入LB 液体培养基中，在37℃、200rpm 条件下培养12h，将获得的发酵液以5% 接种量接种于含水量50% 的灭菌豆粕，37℃条件下发酵24h，测定发酵样品的抗原蛋白的降解程度，从而筛选获得一株抗原蛋白降解能力强的菌株，结果如表1 和图1 所示，命名为ZJUFA-3。
如表1 和图1（a部分）所示，菌株ZJUAF-3在24h 内，对豆粕中大球蛋白及β伴球蛋白降解率综合降解效果高，图1（b部分）中，显示，ZJUFA-3发酵豆粕24小时后，样本中分子量大于35kDa的蛋白质几乎完全降解，而其他发酵菌株仍然存在大量大分子蛋白尤其是75~130kda的β-伴球蛋白，35kDa左右的大豆球蛋白，两种主要的豆粕抗原蛋白。
实施例2 ：菌株的特性
1、 形态特征：
将菌株ZJUFA-3于37℃在LB 培养基上划线培养24h，观察菌株生长形态，结果如图2 所示。
根据图2 结果，菌落乳黄色，近圆形，表面湿润，半透明。
挑取其中的单菌落，进行革兰氏染色，染色后呈紫色，革兰氏阳性菌，椭圆形，短杆状，芽孢中生。
2、生理生化特征：
挑取其中的单菌落，参照《常见细菌鉴定手册》，进行生理生化特征检测，检测项目及结果如表2 所示。
3、基因型鉴定
将ZJUFA-3 的16SrDNA序列和保守基因gryB序列进行BLAST比对，进行基因进化树分析，结果如图3、图4，显示ZJUFA-3与枯草芽孢杆菌枯草亚种同源率达到100%。
根据上述结果，可知菌株ZJUFA-3 为枯草芽孢杆菌枯草亚种（Bacillus subtilis subsp. subtilis）。
菌株ZJUFA-3 已于2016年8月8日 保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）”( 北京市朝阳区北辰西路1 号院3 号中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号是CGMCC No.12825。
实施例3 ：豆粕几种前处理工艺发酵效果对比
3.1 豆粕预处理
方式1. 豆粕（含水量11.13%）加水混匀，调节含水量至50%，不做灭菌处理，获得预处理豆粕1；
方式2. 豆粕（含水量11.13%）加水混匀，调节含水量至50%，于105℃灭菌15 min，获得预处理豆粕2；
方式3. 豆粕（含水量11.13%），于115℃灭菌15min，再调节水分至50wt%，搅拌均匀，获得预处理豆粕3。
3.2 预处理豆粕发酵
取枯草芽孢杆菌ZJUFA-3，接于LB 液体培养基中，在37℃ 200rpm，培养12h，获得枯草芽孢杆菌ZJUFA-3种子液；
以物料重量5%，分别向预处理豆粕-1、豆粕-2、豆粕-3 和豆粕-4 中加入枯草芽孢杆菌ZJUFA-3 种子液，并混合均匀；
将混合接种好的物料转至恒温恒湿箱中，发酵温度控制在37℃，整批物料发酵24h后停止发酵，分别获得发酵豆粕1、发酵豆粕2、发酵豆粕3 和发酵豆粕4。
3.3、发酵豆粕样品的制备及检测
对发酵前后豆粕品质进行抗原蛋白降解率检测分析，结果如表3 所示。
如表3 所示，为避免发酵过程中豆粕染菌，同时比较抗原蛋白降解效率，就不同程度热处理做了对比，发现105℃时，发酵24h 未染菌，发酵豆粕抗原蛋白降解较为充分，当处理温度为115℃时，β-伴球蛋白降解率进一步提高，但发酵后色泽较深。
对发酵豆粕-3进行酸溶蛋白检测分析，结果如图3 所示。
如图5所示，ZJUFA-3发酵豆粕发酵24小时所得酸溶蛋白含量不低于传统发酵菌株48小时发酵效果。

Claims (4)

1.一种降解豆粕抗原蛋白的芽孢杆菌，其特征在于，属于枯草芽孢杆菌枯草亚种Bacillus subtilis subsp.subtilis ，命名为ZJUFA-3，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2016年8月8号，保藏编号为CGMCC NO：12825，用于发酵。
2.一种采用如权利要求1所述的降解豆粕抗原蛋白的芽孢杆菌发酵豆粕的方法，其特征在于，
1）豆粕中加水至含水质量百分比为40%~55%；
2）加入OD600值为1.2菌株培养液至终浓度质量百分比为3%~8%，混匀，于30~40℃好氧发酵12~48小时。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的菌株培养液采用LB液体培养基。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的豆粕经过105℃高压灭菌预处理。
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