CN115197875B

CN115197875B - 一种枯草芽孢杆菌fnfh_bs06及其应用

Info

Publication number: CN115197875B
Application number: CN202210619560.XA
Authority: CN
Inventors: 陈艳; 韩涛; 王骥腾; 黄淑婷; 唐云平; 杨最素; 郑家浪; 余方苗
Original assignee: Zhejiang Ocean University ZJOU
Current assignee: Zhejiang Ocean University ZJOU
Priority date: 2022-06-02
Filing date: 2022-06-02
Publication date: 2023-05-09
Anticipated expiration: 2042-06-02
Also published as: CN115197875A; WO2023231853A1

Abstract

一种枯草芽孢杆菌FNFH_BS06及其应用，属于微生物技术领域。本发明一方面提供了一种枯草芽孢杆菌FNFH_BS06，其保藏编号为：CGMCC No.24836，本发明另一方面提供了该枯草芽孢杆菌的应用。将该菌株接种于豆粕进行发酵，豆粕中的抗原蛋白能够基本完全降解，其中，大豆球蛋白的降解率达到95％，β‑伴球蛋白的降解率达到90％，水溶性蛋白含量提高652％，能够显著提高发酵豆粕的总蛋白含量和蛋白质溶解度，显著提高豆粕蛋白利用率，从而改善豆粕营养价值，在利用微生物发酵豆粕领域达到领先水平。

Description

一种枯草芽孢杆菌FNFH_BS06及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌FNFH_BS06及其应用。

背景技术

我国蛋白质饲料资源生产已达到瓶颈，饲料资源长期依赖于进口且缺口逐年增大，“人-畜禽-水产-粮”相争现象严重威胁国家粮食战略安全。在蛋白质资源中，大豆是其中最重要也最为紧缺的蛋白质资源，是限制我国饲料业发展的“卡脖子”原料。作为我国最大宗植物性蛋白质饲料资源，豆粕粗蛋白含量高、氨基酸组成合理、价格低廉。但是豆粕中含有多种抗营养因子，包括大量蛋白质型过敏源、非淀粉多糖、胰蛋白酶抑制因子、凝集素和脲酶等，大大降低了豆粕的营养价值和蛋白质消化率，加重了饲料原料资源紧缺。因此，提高豆粕蛋白质饲料原料利用率是饲料行业亟待解决的重大关键问题。

在这些抗营养因子中，抗原蛋白具有抗原性和致敏性，且热稳定性强，其含量约占豆粕总质量的30%，是限制豆粕蛋白质饲用效率的主要因素。其中，大豆球蛋白和β-伴球蛋白的免疫原性最强，含量占到豆粕总蛋白的70%，是最主要的两种抗原蛋白。大豆球蛋白会直接造成肠上皮细胞损伤并破坏其完整性，引发超敏反应和腹泻，降低仔猪的生长性能。β-伴球蛋白同样会降低仔猪的生长性能，诱导仔猪过敏反应，破坏十二指肠和空肠黏膜免疫屏障，促进炎症因子分泌。这些抗原蛋白的存在不仅降低了饲料的营养价值，而且会对畜禽、水产动物的生长发育造成严重危害。因此，应重点关注豆粕抗原蛋白的去除。

微生物发酵利用微生物对原料豆粕进行发酵处理，可以有效分解和破坏豆粕中的抗营养因子，在饲料行业中有广泛的发展和应用前景。Zhang等人从腌制榨菜中筛选出一株高效降解豆粕抗原蛋白的枯草芽孢杆菌BS12，该菌发酵豆粕24 h可降解84.8%大豆球蛋白和87.1% β-伴球蛋白，同时酸溶蛋白和粗蛋白含量分别达到11.8%和52.6%（Zhang et al.,2018）。Li等人采用类似方法筛选出一株高效降解豆粕抗原蛋白的解淀粉芽孢杆菌GYL，该菌发酵豆粕24h可降解92.3%大豆球蛋白和85.1% β-伴球蛋白，同时酸溶蛋白和粗蛋白含量分别提高997%和17.5%，有效改善了豆粕营养价值（Li et al., 2020）。因此，筛选优质的发酵菌种实现抗原蛋白的有效去除以及提升发酵豆粕质量而言至关重要。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种枯草芽孢杆菌FNFH_BS06及其应用的技术方案。

本发明具体通过以下技术方案实现：

本发明第一方面提供了一种枯草芽孢杆菌（ Bacillus subtilis）FNFH_BS06，该菌株已于2022年05月06日保藏于中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），其保藏编号为：CGMCC No.24836。

本发明第二方面提供了一种含有枯草芽孢杆菌FNFH_BS06的菌剂。

本发明第三方面提供了一种由枯草芽孢杆菌FNFH_BS06发酵培养得到的发酵物。

本发明第四方面提供了上述枯草芽孢杆菌FNFH_BS06或菌剂或发酵物在高效降解大豆球蛋白和/或β-伴球蛋白中的应用。

本发明第五方面提供了上述枯草芽孢杆菌FNFH_BS06或菌剂或发酵物在豆粕发酵中的应用。

本发明第六方面提供了上述枯草芽孢杆菌FNFH_BS06或菌剂或发酵物在豆粕发酵降解抗原蛋白的应用。

进一步，所述抗原蛋白为大豆球蛋白和β-伴球蛋白。

本发明的枯草芽孢杆菌菌株能够通过分泌蛋白酶高效水解大豆球蛋白和β-伴球蛋白，将该菌株接种于豆粕中进行发酵，37℃发酵24 h，豆粕中的抗原蛋白基本完全降解，其中，大豆球蛋白的降解率达到95％，β-伴球蛋白的降解率达到90％，水溶性蛋白含量提高652%，能够显著提高发酵豆粕的总蛋白含量和蛋白质溶解度，显著提高豆粕蛋白利用率，从而改善豆粕营养价值，在利用微生物发酵豆粕领域达到领先水平。

序列表

<110> 浙江海洋大学

<120> 一种枯草芽孢杆菌FNFH_BS06及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1444

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400> 1

catggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc ggacagatgg 60

gagcttgctc cctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcctgta 120

agactgggat aactccggga aaccggggct aataccggat ggttgtttga accgcatggt 180

tcagacataa aaggtggctt cggctaccac ttacagatgg acccgcggcg cattagctag 240

ttggtgaggt aacggctcac caaggcgacg atgcgtagcc gacctgagag ggtgatcggc 300

cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttccg 360

caatggacga aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt cggatcgtaa 420

agctctgttg ttagggaaga acaagtgccg ttcaaatagg gcggcacctt gacggtacct 480

aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg 540

ttgtccggaa ttattgggcg taaagggctc gcaggcggtt tcttaagtct gatgtgaaag 600

cccccggctc aaccggggag ggtcattgga aactggggaa cttgagtgca gaagaggaga 660

gtggaattcc acgtgtagcg gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc agtggcgaag 720

gcgactctct ggtctgtaac tgacgctgag gagcgaaagc gtggggagcg aacaggatta 780

gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaag tgttaggggg tttccgcccc 840

ttagtgctgc agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc aagactgaaa 900

ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa 960

cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatcc tctgacaatc ctagagatag gacgtcccct 1020

tcgggggcag agtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg 1080

ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgat cttagttgcc agcattcagt tgggcactct 1140

aaggtgactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc 1200

ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat ggacagaaca aagggcagcg aaaccgcgag 1260

gttaagccaa tcccacaaat ctgttctcag ttcggatcgc agtctgcaac tcgactgcgt 1320

gaagctggaa tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct 1380

tgtacacacc gcccgtcaca ccacgagagt ttgtaacacc cgaagtcggt gaggtaacct 1440

ttta 1444

<210> 2

<211> 1004

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400> 2

accgccaaac ttataaacgc ggagttccgg ttacagacct tgaaatcatt ggcgaaacgg 60

atcatacagg aacgacgaca cattttgtcc cggaccctga aattttctca gaaacaaccg 120

agtatgatta tgatctgctt gccaaccgcg tacgtgaatt agccttttta acaaagggcg 180

taaacatcac gattgaggat aaacgtgaag gacaagagcg caaaaatgaa taccattacg 240

aaggcggaat taaaagttat gtagagtatt taaaccgttc taaagaggtt gtccatgaag 300

agccgattta cattgaaggc gaaaaggacg gcataacggt tgaagtagct ttgcaataca 360

atgacagcta cacaagcaac atttactcgt ttacaaacaa cattaacacg tacgaaggcg 420

gtacccatga agctggcttt aaaacgggcc tgactcgtgt tatcaacgat tacgccagaa 480

aaaaagggct tattaaagaa aatgatccaa acctaagcgg agatgacgta agggaagggc 540

tgacagcgat tatttcaatc aaacaccctg atccgcagtt tgagggccaa acgaaaacaa 600

agctgggcaa ctcagaagca cggacgatca ccgatacgtt attttctgcg gcgatggaaa 660

catttatgct ggaaaatcca gatgcggcca aaaaaattgt cgataaaggc ttaatggcgg 720

caagagcaag aatggctgcg aaaaaagcgc gtgaactaac acgccgtaag agtgctttgg 780

aaatttcaaa cctgcccggt aagttagcgg actgctcttc aaaagatccg agcatctccg 840

agttatatat cgtagagggt gactctgccg gaggatctgc taaacaagga cgcgacagac 900

atttccaagc cattttgccg cttagaggta agatcctaaa cgttgaaaag gccagactgg 960

ataaaatcct ttctaacaac gaagttcgct ctatgatcac agcg 1004

附图说明

图1为枯草芽孢杆菌FNFH_BS06的筛选过程；

图2为枯草芽孢杆菌FNFH_BS06的菌落形态；

图3为枯草芽孢杆菌FNFH_BS06革兰氏染色镜检图；

图4为枯草芽孢杆菌FNFH_BS06发酵过程豆粕蛋白降解程度时序表征结果。

实施方式

为了充分公开本发明的一株枯草芽孢杆菌菌株及其应用，结合实施例加以说明，但并不表示对本发明的限制。

实施例1：枯草芽孢杆菌（ Bacillus subtilis）FNFH_BS06的分离、筛选及鉴定

试验材料：

培养基：

LB培养基：10g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物、5g/L氯化钠；

大豆球蛋白筛选平板：0.5 g/L大豆球蛋白、2.5g/L 葡萄糖、0.2g/L NaCl、0.5g/LK₂HPO₄、0.2g/L MgSO₄·7H₂O，pH 7.0；

β-伴球蛋白筛选平板：0.5 g/L β-伴球蛋白、2.5g/L 葡萄糖、0.2g/L NaCl、0.5g/L K₂HPO₄、0.2g/L MgSO₄·7H₂O，pH 7.0。

试验方法：

芽孢杆菌的分离与筛选

取5g豆豉样品至盛有40 mL无菌生理盐水的50 mL离心管中，37℃摇床震荡培养30min后置于80℃水浴处理20 min，然后将样品液用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释，取适宜稀释度的菌悬液涂布于LB固体培养基平板，每个稀释度做3个重复，37℃恒温倒置培养24h。待菌落长出后，挑取具有芽孢杆菌菌落形态特征的菌株，进行划线纯化。

将分离纯化后的菌株分别点种于大豆球蛋白筛选平板和β-伴球蛋白筛选平板，37℃倒置培养24 h，观察抗原平板培养基上菌落周围的透明圈，分别测量菌落直径（d）和透明圈直径（D），并计算D/d比值，以该比值作为菌种对抗原蛋白降解能力的评价指标。从划线平板上挑取D/d值最大的单菌落进行LB液体培养后，制成甘油菌，保存于-80℃冰箱。

其中，大豆球蛋白和β-伴球蛋白的制备方法：称取5g豆粕粉碎过60目筛，加入75mL 0.03M pH 8.5的Tris-HCl缓冲液，于30-50℃ 200 rpm震荡浸提1 h，9000 rpm离心10min后取上清液，加入0.01M Na₂SO₃，用HCl调pH至6.4，置于4℃沉淀过夜，9000 rpm离心10min，沉淀即为大豆球蛋白。向分离的上清液中加入NaCl至0.25 M，用HCl调pH至4-6.0，振荡30 min，9000 rpm离心10 min后分离得到上清液，调pH至4.8，9000 rpm离心10 min得到β-伴球蛋白沉淀。最后将大豆球蛋白沉淀和β-伴球蛋白沉淀进行真空冷冻干燥，得到大豆球蛋白和β-伴球蛋白冻干粉末。

2. 芽孢杆菌的鉴定

（1）革兰氏染色鉴定

取FNFH_BS06单菌落涂布至载玻片，用生理盐水稀释均匀，固定后进行革兰氏染色。

（2）生理生化鉴定。参照细菌鉴定的传统方法，依据《伯杰氏细菌学鉴定手册》对FNFH_BS06的生理生化特征进行检测。

（3）16S rRNA和gyrB基因测序鉴定

采用现代分子生物学鉴定技术，进行细菌16S rRNA序列鉴定和芽孢杆菌保守基因gyrB基因鉴定。以细菌的16S rRNA通用引物27F和1492R为扩增引物，以菌株FNFH_BS06的基因组为模板，对16S rRNA序列进行PCR扩增；同时设计引物对芽孢杆菌保守基因gyrB进行扩增，进而对PCR产物进行回收后测序。

试验结果：

（1）抗原蛋白平板对分离菌株的筛选结果如表1所示，其中，芽孢杆菌FNFH_BS06在大豆球蛋白和β-伴球蛋白筛选平板上的D/d值均大于2.5，表现出较强的抗原蛋白降解特性。图1为枯草芽孢杆菌FNFH_BS06的筛选过程。

表1芽孢杆菌在抗原平板的筛选结果

（2）芽孢杆菌FNFH_BS06的菌落形态见图2，菌落呈污白色，不透明，近圆形，表面湿润，内含黏液。革兰氏染色结果见图3，FNFH_BS06为革兰氏阳性菌，菌体呈杆状，单个或成对或链状排列，芽孢中生。

（3）生理生化检测

芽孢杆菌FNFH_BS06对V-P试验呈阳性，接触酶试验呈阳性，可分解葡萄糖产酸，能够分解L-阿拉伯糖、纤维二糖、D-木糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、甘油、D-松二糖、甘露醇和山梨醇，对7%氯化钠溶液具备耐受能力。

（4）芽孢杆菌FNFH_BS06的16S rRNA测序结果见序列表SEQ ID No.1。在NCBI上进行BLAST同源性比对，结果显示FNFH_BS06与 Bacillus subtilis和 Bacillus amyloliquefaciens和 Bacillus cereus等菌株的16S rDNA的序列同源性均达到100％。FNFH_BS06的芽孢杆菌保守基因gyrB测序结果见序列表SEQ ID No.2，BLAST同源性比对结果显示，FNFH_BS06与 Bacillus subtilis 种的3株菌株的同源性达到99.4%。综上所述，FNFH_BS06鉴定为枯草芽孢杆菌 ( Bacillus subtilis)。

同时对FNFH_BS06菌株进行保藏，保藏时间为2022年05月06日，保藏地址为中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），保藏编号为：CGMCC No. 24836。

实施例2：枯草芽孢杆菌（ Bacillus subtilis）FNFH_BS06的豆粕发酵应用

试验材料：

菌株：枯草芽孢杆菌FNFH_BS06。

培养基：

LB培养基：10g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物、5g/L氯化钠；

GYP培养基：10g/L葡萄糖、8g/L酵母提取物、2g/L大豆蛋白胨，pH 7.0。

试验方法：

1. 豆粕预处理：称取20 g豆粕装于250 mL已灭菌的摇瓶，用纱布和封口膜封住瓶口，100℃高压灭菌30 min，然后冷却至室温。

2. 种子制备：将枯草芽孢杆菌FNFH_BS06接种于6 mL LB培养基，于37℃、250 rpm条件下进行过夜活化培养。然后以OD=0.5转接于新鲜的30 mL GYP培养基，于37℃、250 rpm条件下培养至对数生长期。

3. 发酵接种：按3% (v./m.)接种量将培养至对数生长期的枯草芽孢杆菌FNFH_BS06种子液与一定体积的无菌水混合（混合种子液总体积20 mL，即使豆粕发酵初始含水量为50%），将20 mL混合种子液均匀洒入预处理后的豆粕中，充分混合均匀后将摇瓶放入恒湿摇床中，于37℃、150 rpm条件下发酵24 h。

4. 烘干检测：发酵结束，将豆粕取出60℃烘干，然后粉碎过60目筛，分别检测发酵所得产品发酵豆粕和原料豆粕的大豆球蛋白、β-伴球蛋白的含量，粗蛋白和水溶性蛋白的含量，以及豆粕蛋白降解程度，并按照公式计算大豆球蛋白、β-伴球蛋白的降解率，按照公式计算蛋白质溶解度=水溶性蛋白含量/粗蛋白含量，结果如表2所示。

其中，大豆球蛋白含量：采用酶联免疫法进行测定，采用购自北京龙科方舟生物工程技术有限公司的大豆球蛋白定量检测试剂盒，按照其产品说明书进行检测；

β-伴球蛋白含量：采用酶联免疫法测定，采用购自北京龙科方舟生物工程技术有限公司的β-伴球蛋白定量检测试剂盒，按照其产品说明书进行检测；

粗蛋白含量：采用凯氏定氮法（GB/T 6432-2018）检测；

水溶性蛋白含量：称取1 g样品溶于加人40 mL双蒸水，涡旋震荡2 h，然后1500rpm离心10 min收集上清液，将上清液按粗蛋白含量的测定方法，即凯氏定氮法（GB/T6432-2018）进行定量。

豆粕蛋白降解程度：称取1g样品溶于5 mL 8 M尿素溶液中，涡旋30 min，然后4℃、8000 rpm离心5 min分离上清液，用BCA蛋白定量试剂盒对上清液进行定量，按20 µg蛋白含量计算样品点样量，然后加载到聚丙烯酰胺凝胶上进行SDS-PAGE分析。

试验结果：

应用枯草芽孢杆菌FNFH_BS06对豆粕进行发酵后，所得产品发酵豆粕的干物质、粗蛋白、水溶性蛋白含量均得到大幅提高，而抗原蛋白含量明显下降（表2）。其中，粗蛋白含量提高了13.9%，水溶性蛋白含量提高了652.5%，相应蛋白质溶解度提高了558.3%，而抗原蛋白中大豆球蛋白和β-伴球蛋白含量分别下调了95.1%和90.2%。由此证明，枯草芽孢杆菌FNFH_BS06对豆粕中大豆球蛋白、β-伴球蛋白等的降解效果甚好，能够显著提高粗蛋白和水溶性蛋白等的含量，提高蛋白质消化利用率。

表2枯草芽孢杆菌FNFH_BS06发酵前后豆粕关键组分分析

分别采集0 h、8 h、12 h、16 h、18 h、20 h和24 h的枯草芽孢杆菌FNFH_BS06发酵豆粕样本，对豆粕总蛋白降解程度进行SDS-PAGE分析，结果见图4。与原料豆粕相比，经枯草芽孢杆菌FNFH_BS06发酵所得产品发酵豆粕在>25 kDa的蛋白亚基在8-24 h中逐渐降解，而分子量<25 kDa的蛋白丰度逐渐升高。在发酵24 h时，大豆球蛋白（30-45 kDa）和β-伴球蛋白（50-100 kDa）基本被完全降解，由此证明，枯草芽孢杆菌FNFH_BS06对豆粕中抗原蛋白的降解效果甚佳，并且能够在24 h内将豆粕中的大分子难溶性蛋白质降解成小分子可溶性蛋白质和肽，从而提高蛋白质的生物利用度。

同样，将本实施例中的枯草芽孢杆菌（ Bacillus subtilis）FNFH_BS06制备成相应的菌剂也能得到如本实施例相同的效果。

Claims

1.一种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）FNFH_BS06，其保藏编号为：CGMCC No.24836。

2.一种含有权利要求1所述枯草芽孢杆菌FNFH_BS06的菌剂。

3.如权利要求1所述枯草芽孢杆菌FNFH_BS06或权利要求2所述菌剂在高效降解大豆球蛋白和/或β-伴球蛋白中的应用。

4.如权利要求1所述枯草芽孢杆菌FNFH_BS06或权利要求2所述菌剂在豆粕发酵中的应用。

5.如权利要求1所述枯草芽孢杆菌FNFH_BS06或权利要求2所述菌剂在豆粕发酵降解抗原蛋白中的应用，所述抗原蛋白为大豆球蛋白和β-伴球蛋白。