CN117448222A - 一种暹罗芽孢杆菌h-1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种暹罗芽孢杆菌H‑1及其应用，属于微生物技术领域，所述暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)H‑1于2023年04月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.27070。本发明还提供了暹罗芽孢杆菌H‑1在制备海产品加工副产物的酶解剂中的应用。本发明验证了暹罗芽孢杆菌H‑1可产蛋白酶，且培养和发酵条件简单、发酵周期短、产酶效率高，所产蛋白酶的酶活稳定。利用暹罗芽孢杆菌H‑1可以酶解海产品加工副产物，促进充分合理的利用海产品加工副产物，提高了海产品加工副产物的综合应用价值。

Description

一种暹罗芽孢杆菌H-1及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种暹罗芽孢杆菌H-1及其应用。

背景技术

海产品加工副产物是指在海产品加工过程中，无法作为食品销售的剩余物质。这些副产品通常包括鱼骨、鱼头、鱼皮、鱼鳞、贝壳、虾壳、蟹壳、海带与紫菜等海藻的残余以及海胆与海参等海产品的残余。

通常情况下，海产品加工副产品被视为废弃物或污染源，但实际上，海产品加工副产品具有很高的综合利用价值。通过对这些副产品的回收和利用，可以实现资源的循环利用，减少环境污染，同时也可以创造更多的经济价值。针对目前现状，利用微生物酶解法对海产品加工副产物进行加工可提高其附加值。微生物酶解法水解相较传统酸碱法水解蛋白质条件温和，不会破坏氨基酸，与商业酶相比更便宜、更容易获得且能够酶解得到更加丰富的肽段、氨基酸和多糖，目前已有多项研究报道表明海产品加工副产物水解肽具有延缓衰老、抗氧化、抗肿瘤、抗菌、抗凝和降血压等多种生物活性功能。

暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)又称为西姆芽孢杆菌，属芽孢杆菌科芽孢杆菌属，是一类产芽孢的革兰氏阳性菌。暹罗芽孢杆菌因其具有易分离培养、抗菌谱广、抑菌效果稳定且生物安全性高的特点，所以在农业、林业、环保和工业等领域中应用广泛。

目前，关于暹罗芽孢杆菌产蛋白酶的应用研究较少，然而，为充分开发海洋资源，促进海产品加工副产物资源合理化利用。本发明筛选得到一株高产蛋白酶的暹罗芽孢杆菌H-1，利用菌株H-1产生的蛋白酶来酶解海产品加工副产物，研究水解产物生物活性功能，提高海产品加工副产物的综合应用价值，具有可行性和实际意义。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提出了一种暹罗芽孢杆菌H-1及其应用，将暹罗芽孢杆菌H-1菌液或发酵酶液应用于酶解海产品加工副产物，充分合理利用海产品加工副产物，提高海产品加工副产物的综合应用价值。

为实现上述目的，本发明提供了一种暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)H-1，所述暹罗芽孢杆菌H-1于2023年04月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.27070。

本发明还提供了所述的暹罗芽孢杆菌H-1在制备海产品加工副产物的酶解剂中的应用。

本发明还提供了一种暹罗芽孢杆菌H-1菌液的制备方法，包括以下步骤：

暹罗芽孢杆菌H-1接种于暹罗芽孢杆菌H-1培养基中，160～200rpm、35℃培养12h，重复培养1次，得暹罗芽孢杆菌H-1菌液；

所述暹罗芽孢杆菌H-1的接种量为暹罗芽孢杆菌H-1培养基体积的2％。

优选的，所述暹罗芽孢杆菌H-1培养基的配方为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，以陈海水配制，所述暹罗芽孢杆菌H-1培养基的pH为7.5，所述陈海水中NaCl的质量浓度为3％。

本发明还提供了一种暹罗芽孢杆菌H-1发酵酶液的生产方法，包括以下步骤：将所述制备方法制备所得暹罗芽孢杆菌H-1菌液接种于发酵培养基中发酵培养，离心，得暹罗芽孢杆菌H-1发酵酶液。

优选的，所述暹罗芽孢杆菌H-1菌液的接种量为发酵培养基总体积的5～10％；所述发酵培养基的配方为：酵母粉10g/L、鱼粉蛋白胨10g/L，NaCl 30g/L，以陈海水配制，所述发酵培养基的pH为8.0，所述陈海水中NaCl的质量浓度为3％；所述发酵培养的转速为180rpm，所述发酵培养的温度为35～37℃，所述发酵培养的时间为48h；所述离心的转速为4500rpm，所述离心的温度为4℃，所述离心的时间为30min。

本发明还提供了所述的生产方法制备所得暹罗芽孢杆菌H-1发酵酶液。

本发明还提供了所述暹罗芽孢杆菌H-1发酵酶液在酶解海产品加工副产物中的应用。

本发明还提供了所述暹罗芽孢杆菌H-1发酵酶液酶解鲬鱼骨的方法，包括将鲬鱼骨与暹罗芽孢杆菌H-1发酵酶液按照1g：20mL的比例混合酶解的步骤。

优选的，所述酶解的温度为55℃，所述酶解的pH为8，所述酶解的时间为5h。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和技术效果：

本发明公开了暹罗芽孢杆菌H-1，验证了所述暹罗芽孢杆菌H-1可产蛋白酶，且培养和发酵条件简单、发酵周期短、产酶效率高，所产蛋白酶的酶活稳定。利用暹罗芽孢杆菌H-1可以酶解海产品加工副产物，促进充分合理利用海产品加工副产物，提高了海产品加工副产物的综合应用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为菌株H-1菌落形态图；

图2为菌株H-1的革兰氏染色图(×1000)；

图3为菌株H-1扫描电镜图(标尺为4μm)；

图4为菌株H-1的系统进化树图；

图5为温度对菌株H-1生长的影响图；

图6为pH对菌株H-1生长的影响图；

图7为NaCl浓度对菌株H-1生长的影响图；

图8为初始碳源种类对菌株H-1生长的影响图(a、b、c和d表示显著性差异)；

图9为初始氮源种类对菌株H-1生长的影响图(a、b、和c表示显著性差异)；

图10为发酵温度对菌株H-1产蛋白酶的影响图；

图11为发酵pH对菌株H-1产蛋白酶的影响图；

图12为发酵NaCl浓度对菌株H-1产蛋白酶的影响图；

图13为发酵碳源种类对菌株H-1产蛋白酶活性的影响图(a、b、和c表示显著性差异)；

图14为发酵氮源种类对菌株H-1产蛋白酶活性的影响图(a、b、c、d和e表示显著性差异)；

图15为温度对菌株H-1所产蛋白酶活性影响图；

图16为菌株H-1所产蛋白酶的温度稳定性图；

图17为pH对菌株H-1所产蛋白酶活性影响图；

图18为菌株H-1所产蛋白酶的pH稳定性图；

图19为底物种类对菌株H-1所产蛋白酶活性的影响图(a、b、c和d表示显著性差异)；

图20为菌株H-1所产蛋白酶的酶解产物抗氧化性的研究图，其中A为酶解产物的DPPH自由基清除率，B为酶解产物的羟基自由基清除率，C为酶解产物的超氧阴离子自由基清除率，D为酶解产物还原力的测定(R-1为酶解产物组，Vc为Vc对照组)。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

本发明实施例所用材料的来源：福林(Folin)试剂、三氯乙酸、无水碳酸钠、干酪素、酵母粉、NaOH和HCl均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；革兰氏染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，生理生化试剂管购自杭州滨河微生物试剂有限公司，细菌DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司，引物27F和1492R购自上海生工生物工程股份有限公司。

本发明中所述陈海水：是把从不被陆上污物污染的或很少混有淡水的地方取来的海水装入玻璃瓶储放在暗处形成的海水；所述陈海水中NaCl的质量浓度为3％。

本发明中所述的NaCl质量分数0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10％的陈海水，为以每100mL陈海水计算，向其中添加NaCl的质量为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10g。

本发明中所述暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)H-1，于2023年04月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.27070。

本发明实施例中所述筛选培养基的配方为：酵母粉10g/L，干酪素10g/L，琼脂20g/L，用陈海水配制，pH7.5。

本发明实施例中所述LB培养基的配方为：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，陈海水配制，pH7.5。

本发明实施例中所述酪蛋白培养基的配方为：酪蛋白10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠30g/L，pH7.5。

实施例1

菌株的筛选

初筛：称取1g来自连云港附近的海泥A2样，用无菌水梯度稀释至10⁰，10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5和10^-6，用移液枪吸取200μL至于筛选培养基上，用涂布棒涂布均匀后，放置于37℃的恒温培养箱内培养36h后再进行观察。根据菌株产生透明圈的大小，选取几株透明圈较大的菌株对其进行分离纯化，并保存。

复筛：将初筛得到的几株菌培养至二级种子液，以10％接种量接种至发酵培养基(酵母粉10g/L、鱼粉蛋白胨10g/L，以NaCl质量分数3％的陈海水配制)，于37℃，180rpm的摇床内培养24h，离心，得到上清液，蛋白酶活力测定方法参照国标GB/T 23527-2009中蛋白酶制剂酶活测定方法，选用福林法测定蛋白酶活力。酶活力最高的菌株命名为H-1，并对菌株H-1进行下一步的研究。

实施例2

菌株H-1生理生化研究

1、菌落形态特征

将菌种接种至LB培养基于37℃培养12h，用接种环接至酪蛋白培养基，37℃培养36h，观察菌株形态特征。

菌株H-1的形态特征如图1所示，H-1菌落颜色呈白色，微微泛黄，菌落较大，其菌落边缘不规则，表面粗糙、不圆滑，有褶皱，且菌落周围有明显的透明圈产生。

2、菌株H-1革兰氏染色

根据革兰氏染色试剂盒使用说明书进行操作，包括涂片、初染、媒染、脱色、复染等步骤，在电子显微镜油镜下观察菌株革兰氏染色情况。

如图2所示，菌株H-1在显微镜油镜下观察为杆、棒状形态，染色为紫色，根据革兰氏染色试剂盒说明书表明这是一株革兰氏阳性杆菌。图3为菌株H-1的扫描电镜图。

3、菌株H-1生理生化实验

选取生理生化试剂管，用移液枪吸取100μL菌株H-1种子液加入到各试剂管中，于37℃培养箱内培养24h，观察试剂管颜色变化，根据使用说明书判断阳性阴性，并与暹罗芽孢杆菌JFL15(史璐欣.暹罗芽孢杆菌YJ15挥发性有机物抑菌成分解析及对灰葡萄孢的抑菌作用[D]；山西农业大学,2022.)进行比较。

结果如表1所示，菌株H-1与已知JFL15测得的生理生化特性完全一致，具有大量暹罗芽孢杆菌基本特征，如甲基红、V-P、吲哚实验、H₂S产气、尿素等实验的结果均与暹罗芽孢杆菌特征相同。并且其可在NaCl浓度7％的条件下生长，产酸不产气，可利用多种糖类，分泌尿素酶和淀粉酶，结合参照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰氏细菌鉴定手册》，初步鉴定菌株H-1为暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)。

表1菌株H-1与JFL15的生理生化特性

注：表中“+”代表阳性，“-”代表阴性。

4、菌株H-1分子生物学鉴定

吸取2mL培养18h的菌株H-1菌液加入到2mL EP管中，8000rpm离心2min，根据细菌DNA提取试剂盒操作提取菌株H-1的基因，利用PCR技术对其进行扩增。

(1)基因组：通过细菌DNA提取试剂盒提取菌株H-1的基因组。

(2)引物：为27F(SEQ ID NO.2：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和1492R(SEQ ID NO.3：GGTTACCTTGTTACGACTT)购自上海生工生物工程股份有限公司。

(3)PCR反应体系(50μL)：Taq PCR Master Mix 25μL，DNAtemplate 1μL，27F 2μL，1492R2μL，ddH₂O 20μL。

(4)反应程序：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，30循环；72℃延伸10min；4℃保存。

(5)琼脂糖凝胶电泳：将PCR扩增得到的产物用1％的琼脂糖凝胶电泳，至显现单一明亮条带，送至上海生工生物工程股份有限公司测序。

(6)系统进化树：将测序结果的细菌16S rDNA序列(SEQ ID NO.1)与NCBI数据库同源性进行比较，选取11个同源性最接近的菌株，利用MEGA7软件绘制菌株H-1系统进化树，如图4所示。

菌株H-1的16S rDNA序列(SEQ ID NO.1)：GAACTGGCGGCGTGCTATACATGCAG TCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCGAAGTGGACCAGAG。

实施例3

菌株H-1生长特性研究

对菌株H-1生长特性进行研究，生长培养基配方为蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，陈海水配制，pH7.0。

1、温度对菌株H-1生长的影响

测定菌株于不同温度20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃下，在生长培养基中培养18h，测定在吸光度为600的OD值，比较各培养温度条件下OD₆₀₀的大小。

结果如图5所示，表明温度为35℃最适宜菌株H-1生长。

2、pH对菌株H-1生长的影响

测定菌株于不同pH 5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10的生长培养基中培养12h，测定OD₆₀₀，比较各pH培养条件下OD₆₀₀的大小。

结果如图6所示，表明pH为7.5时最适宜菌株H-1生长。

3、NaCl浓度对菌株H-1生长的影响

测定菌株于不同NaCl浓度0g/100mL、1g/100mL、2g/100mL、3g/100mL、4g/100mL、5g/100mL、6g/100mL、7g/100mL、8g/100mL、9g/100mL、10g/100mL的生长培养基中培养12h，测定OD₆₀₀比较各NaCl浓度条件下OD₆₀₀的大小。

结果如图7所示，表明不添加NaCl的生长培养基最适宜菌株H-1生长。

4、初始碳源对菌株H-1生长的影响

测定菌株于不同初始碳源蔗糖、葡萄糖、酵母粉、麦芽糖、马铃薯淀粉、乳糖的生长培养基中，培养12h，测定OD₆₀₀，比较各初始碳源培养条件下OD₆₀₀的大小。

结果如图8所示，表明用酵母粉作为碳源最适宜菌株H-1生长。

5、初始氮源对菌株H-1生长的影响

测定菌株于不同初始氮源鱼粉蛋白胨、胰蛋白胨、尿素、豆粕、硫酸铵的生长培养基中，培养12h的OD₆₀₀，比较各初始氮源培养条件下OD₆₀₀的大小。

结果如图9所示，表明以蛋白胨为氮源最适宜菌株H-1生长。

实施例4

菌株H-1发酵产酶特性研究

对菌株H-1发酵产酶特性进行研究，蛋白酶活力测定方法参照国标GB/T 23527-2009中蛋白酶制剂酶活测定方法，选用福林法测定蛋白酶活力。

1、培养基

种子培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，陈海水配制，pH 7.0。

发酵培养基：酵母粉10g/L，干酪素10g/L，陈海水配制，pH 7.0。

分离得到的菌株H-1在种子培养基中，160～200rpm、35℃培养12h，培养到二级种子液。

2、发酵温度对菌株H-1发酵产酶的影响

将菌液培养至二级种子液，以2％的接种量接种至发酵培养基，在不同温度(20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃)下培养48h，离心发酵所得发酵酶液，得到上清液，测定不同温度发酵条件下，上清液的相对酶活大小。

结果如图10所示，表明温度为35℃时，最适宜菌株H-1发酵产酶。

3、发酵pH对菌株H-1发酵产酶的影响

将菌液培养至二级种子液，以2％的接种量接种至发酵产酶培养基，在不同pH(5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10)下培养48h，离心发酵所得发酵酶液，得到上清液，测定不同pH发酵条件下，上清液的相对酶活大小。

结果如图11所示，表明在pH为8时，最适宜菌株H-1发酵产酶。

4、发酵NaCl浓度对菌株H-1发酵产酶的影响

将菌液培养至二级种子液，以2％的接种量接种至发酵产酶培养基，在不同NaCl浓度(0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10g/100mL)下培养48h，离心发酵所得发酵酶液，得到上清液，测定不同NaCl浓度发酵条件下，上清液的相对酶活大小。

结果如图12所示，表明NaCl浓度为3g/100mL时，最适宜菌株H-1发酵产酶。

5、发酵碳源对菌株H-1发酵产酶的影响

将菌液培养至二级种子液，以2％的接种量接种至发酵产酶培养基，替换发酵产酶培养基中的碳源为不同碳源(蔗糖、葡萄糖、酵母粉、麦芽糖、木薯淀粉、乳糖)进行培养48h，离心发酵所得发酵酶液，得到上清液，测定不同碳源发酵条件下，上清液的相对酶活大小。

结果如图13所示，表明以酵母粉为发酵碳源，最适宜菌株H-1发酵产酶。

6、发酵氮源对菌株H-1发酵产酶的影响

将菌液培养至二级种子液，以2％的接种量接种至发酵产酶培养基，替换发酵产酶培养基中的氮源为不同氮源(鱼粉蛋白胨、干酪素、胰蛋白胨、麸皮、豆粕、花生粕)进行培养48h，离心发酵所得发酵酶液，得到上清液，测定不同氮源发酵条件下，上清液的相对酶活大小。

结果如图14所示，表明以鱼粉蛋白胨为发酵氮源最适宜菌株H-1发酵产酶。

实施例5

温度、pH、底物种类对菌株H-1所产蛋白酶活性的影响研究

1、温度对蛋白酶活性的影响

将发酵得到的酶液放置于温度30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃水浴中，利用福林法测定蛋白酶活，比较温度对蛋白酶活性影响。

结果如图15所示，表明该蛋白酶最适反应温度为55℃。

2、温度对蛋白酶活性稳定性的影响

将发酵得到的酶液在不同温度(45℃、50℃、55℃、60℃、65℃)的水浴中放置20min、40min、60min、80min、100min，测得各条件下相对酶活，比较温度稳定性。

结果如图16所示，表明蛋白酶在45～55℃下放置100min以内较为稳定，当放置温度高于65℃，酶活力丢失较快，不利于酶的使用。

3、pH对蛋白酶活性的影响

将发酵得到的酶液于不同pH(5、6、7、8、9、10)条件下放置，利用福林法测定蛋白酶活，比较pH对蛋白酶活性影响。

结果如图17所示，表明该蛋白酶最适反应pH为8。

4、pH对蛋白酶活性稳性的影响

将发酵得到的酶液于不同pH(5、6、7、8、9、10)条件下放置20min、40min、60min、80min、100min，测得各条件下相对酶活，比较pH稳定性。

结果如图18所示，表明相对酶活在pH7～9范围内较高，pH＞10和pH＜7条件下相对酶活较低，表明该蛋白酶在酸性和碱性较高的环境下长时间反应，酶活丢失快，适宜在弱碱性条件下长时间反应。

5、底物对蛋白酶活性影响

称取酪蛋白、明胶、牛肉浸粉、脱脂牛奶、牛血清蛋白各1g溶于10mL水中，测定蛋白酶液分别于五种不同底物下的相对酶活力，比较其底物特异性。

结果如图19所示，表明酪蛋白是该酶的最适反应底物。

实施例6

对鲬鱼骨水解产物及抗氧化性测定的方法进行研究

1、鲬鱼骨水解产物制备与分离

称取一定量鲬鱼骨冻干粉，以固液比1g：20mL与发酵酶液混合，于55℃，pH 8的条件下酶解5h。将所得酶解物取出，离心得到上清液，对上清液进行过滤和抽滤除去悬浮物，采用8kDa的分子滤膜对其超滤，得到两级不同分子大小的产物。分离得到分子量小于8kDa的产物并进行冻干，所得酶解产物冻干粉于-80℃保存。

(1)酶解产物DPPH自由基清除活性

将酶解产物冻干粉按照2、4、6、8、10mg/mL浓度配置成酶解产物水溶液，用DPPH自由基清除能力试剂盒(南京建成生物工程研究所)，取0.4mL的样品与0.6mL的工作液混合并震荡均匀，置于暗环境反应30min，4000×g，测量517nm的吸光度。体积分数80％甲醇水溶液和工作液作为空白，样品和体积分数80％甲醇水溶液混合液作为对照，公式如下：

A：DPPH工作液和酶解产物水溶液的混合物的吸光度，B：酶解产物水溶液和体积分数80％甲醇水溶液混合物的吸光度，C：DPPH工作液和体积分数80％甲醇水溶液混合物的吸光度。

(2)酶解产物超氧阴离子自由基清除活性

将酶解产物冻干粉按照2、4、6、8、10mg/mL浓度配置成酶解产物水溶液，0.2mL酶解产物水溶液与1mLTris-HCl(50mM)混合，25℃温育10min，立即加入30μL邻苯三酚(6mM)，室温放置30min，测OD₃₂₀。公式如下：

A：0.2mL酶解产物水溶液+1mL Tris-HCl(50mM)+30μL邻苯三酚(6mM)；B：0.2mL酶解产物水溶液+1mLTris-HCl(50mM)+30μL质量浓度分数为37％的HCl溶液；C：0.2mL水+1mLTris-HCl(50mM)+30μL邻苯三酚(6mM)。

(3)酶解产物羟基自由基清除活性

将酶解产物冻干粉按照2、4、6、8、10mg/mL浓度配置成酶解产物水溶液，0.1mLFeSO₄·7H₂O(9mM)、0.1mL水杨酸溶液(无水乙醇溶液，9mM)、0.1mL酶解产物水溶液和0.1mLH₂O₂溶液(质量分数为0.03％)混匀，37℃下温育15min，测OD₅₁₀。公式如下：

A：不加酶解产物水溶液样品的吸光度；B：加酶解产物水溶液样品后的吸光度；C：空白试剂的吸光度。

(4)酶解产物还原力的测定

将酶解产物冻干粉按照2、4、6、8、10mg/mL浓度与超纯水混合配置成酶解产物水溶液，吸取0.20mL的酶解产物水溶液、0.20mL的0.2M PBS溶液(pH 6.6)、0.20mL的K₃Fe(CN)₆溶液(1％(w/v))混匀，50℃下温育20min。加入0.20mL三氯乙酸溶液(质量分数10％)，5000×g离心10min。取0.5mL上清、2.5mL超纯水和0.1mLFeCl₃(质量分数0.2％)混匀，室温10min后，测OD₇₀₀。

酶解产物的DPPH自由基清除活性、羟基自由基清除活性、超氧阴离子自由基清除活性和还原力的测定结果如图20中A～D所示。DPPH是一种含有自由基的化合物，其性质稳定、价格低廉。如图20中A所示，DPPH自由基清除率随着加样浓度升高而升高，Vc表现出最高的DPPH自由基清除率，在1mg/mL浓度下清除率达96.9％。当加样浓度2mg/mL时，产物R-1的DPPH自由基清除率达80％，R-1对DPPH自由基的清除的IC₅₀为1mg/mL。

如图20中B所示，Vc表现出最强的羟基自由基清除活性，在1mg/mL浓度下清除率达99.2％。在加样浓度2mg/mL时，产物R-1的羟基由基清除率达80％。

如图20中C所示，Vc的超氧阴离子自由基清除率最高，在1mg/mL浓度下清除率达93.9％。产物R-1表现出较好的超氧阴离子自由基活性，在浓度10mg/mL时其清除率达52.7％。

抗氧化剂能够将三价铁离子还原成二价铁离子，氧化铁与氯化铁反应可生成普鲁士蓝，利用普鲁士蓝在OD700处有最大吸收峰的原理，用测得OD700表示还原力，研究酶解产物R-1浓度与总还原力的关系如图20中D所示，总还原力随着加样浓度升高明显增大。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)H-1，其特征在于，所述暹罗芽孢杆菌H-1于2023年04月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.27070。

2.如权利要求1所述的暹罗芽孢杆菌H-1在制备海产品加工副产物的酶解剂中的应用。

3.一种暹罗芽孢杆菌H-1菌液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

暹罗芽孢杆菌H-1接种于暹罗芽孢杆菌H-1培养基中，160～200rpm、35℃培养12h，重复培养1次，得暹罗芽孢杆菌H-1菌液；

所述暹罗芽孢杆菌H-1的接种量为暹罗芽孢杆菌H-1培养基体积的2％。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述暹罗芽孢杆菌H-1培养基的配方为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，以陈海水配制，所述暹罗芽孢杆菌H-1培养基的pH为7.5，所述陈海水中NaCl的质量浓度为3％。

5.一种暹罗芽孢杆菌H-1发酵酶液的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求3或4所述的制备方法制备所得暹罗芽孢杆菌H-1菌液接种于发酵培养基中发酵培养，离心，得暹罗芽孢杆菌H-1发酵酶液。

6.根据权利要求5所述的生产方法，其特征在于，所述暹罗芽孢杆菌H-1菌液的接种量为发酵培养基总体积的5～10％；所述发酵培养基的配方为：酵母粉10g/L、鱼粉蛋白胨10g/L，NaCl 30g/L，以陈海水配制，所述发酵培养基的pH为8.0，所述陈海水中NaCl的质量浓度为3％；所述发酵培养的转速为180rpm，所述发酵培养的温度为35～37℃，所述发酵培养的时间为48h；所述离心的转速为4500rpm，所述离心的温度为4℃，所述离心的时间为30min。

7.如权利要求5或6所述的生产方法制备所得暹罗芽孢杆菌H-1发酵酶液。

8.如权利要求7所述暹罗芽孢杆菌H-1发酵酶液在酶解海产品加工副产物中的应用。

9.如权利要求7所述暹罗芽孢杆菌H-1发酵酶液酶解鲬鱼骨的方法，其特征在于，包括将鲬鱼骨与暹罗芽孢杆菌H-1发酵酶液按照1g：20mL的比例混合酶解的步骤。

10.根据权利要求9所述的酶解鲬鱼骨的方法，其特征在于，所述酶解的温度为55℃，所述酶解的pH为8，所述酶解的时间为5h。