CN110452833B - 一株降解大豆胰蛋白酶抑制剂的短小芽孢杆菌lz013-2及其应用 - Google Patents

一株降解大豆胰蛋白酶抑制剂的短小芽孢杆菌lz013-2及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一株降解大豆胰蛋白酶抑制剂的短小芽孢杆菌LZ013‑2及其应用。本发明提供短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)LZ013‑2，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18050。该菌株具有高效降解大豆胰蛋白酶抑制剂的活性。利用该菌株降解大豆或大豆衍生制品中的大豆胰蛋白酶抑制剂具有降解效率高、简单易行、成本低等优势，适于大范围推广应用。

Description

一株降解大豆胰蛋白酶抑制剂的短小芽孢杆菌LZ013-2及其 应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一株降解大豆胰蛋白酶抑制剂的短小芽孢杆菌LZ013-2及其应用。
背景技术
大豆(学名：Glycine max(Linn.)Merr.)通称黄豆，原产于中国。大豆中含有丰富营养成分，包括优质蛋白质、脂肪、无机盐、亚油酸、维生素E和卵磷脂等多种有效生理活性成分。大豆作为食品及食品原料，具有非常多样化的商业产品，包括：大豆粉、大豆蛋白分离物和蛋白质浓缩物、豆油和膳食、豆浆、豆腐、豆渣、豆豉、酱油、营养补充剂、非乳制甜点、大豆酸奶和变形肉类替代品等。大豆在榨油后制成的豆粕中含有大量优质蛋白质，可以用作动物饲料。大豆和豆粕中同样存在许多对蛋白质的营养质量产生负面影响的组分，这些降低大豆营养价值的组分统称为抗营养因子。
大豆中的胰蛋白酶抑制剂(soybean trypsin inhibitor，STI)是大豆中的主要抗营养因子，大豆是蛋白酶抑制剂含量最高的豆类之一，蛋白酶抑制剂约占豆粕的2％或大豆蛋白的2％-6％。由于STI可以引发体内多种负面效果，对STI失活的研究是提高大豆蛋白质质量、改善大豆营养价值的重要方面，也是在大豆产品制造的关键阶段要考虑的最重要因素。目前，STI失活的方法主要包括物理失活，化学失活以及生物降解这三类方法。其中，生物法主要通过具有降解STI功能的酶或微生物，通过对豆类原料进行发酵，使得大豆中的STI降解为小分子肽链，失去原有的生物学活性。生物法降解STI，具有绿色环保，安全高效，操作简单等优点，同时也对大豆中的其他抗营养因子同样具有不同程度的降解作用，对营养吸收率及消化率也有提高作用。因此，开发具有对大豆胰蛋白酶抑制剂具有高效降解活性的微生物对于提高大豆及其制品的营养质量和营养利用率具有重要意义。
发明内容
为解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供一株具有高效降解大豆胰蛋白酶抑制剂活性的短小芽孢杆菌LZ013-2及其应用。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
本发明提供一株短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)LZ013-2，该菌株于2019年6月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为Bacilluspumilus，保藏编号为CGMCC No.18050。
本发明提供的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)LZ013-2的16S rDNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供包含所述短小芽孢杆菌LZ013-2的菌剂。
所述包含所述短小芽孢杆菌LZ013-2的菌剂可以为液体菌剂或固体菌剂。
所述包含所述短小芽孢杆菌LZ013-2的菌剂可以采用常规技术手段、加入微生物制剂领域允许的辅料制备得到。
本发明通过实验验证证明，短小芽孢杆菌LZ013-2或其发酵培养物上清或其代谢物能够高效降解胰蛋白酶抑制剂。
进一步地，本发明提供所述短小芽孢杆菌LZ013-2或包含所述短小芽孢杆菌LZ013-2的菌剂在降解植物的胰蛋白酶抑制剂中的应用。
本发明还提供所述短小芽孢杆菌LZ013-2或包含所述短小芽孢杆菌LZ013-2的菌剂在提高植物的营养物质消化吸收率或提高植物的营养质量中的应用。
作为优选，所述植物为大豆。
作为优选，所述应用为采用短小芽孢杆菌LZ013-2的发酵培养物上清或短小芽孢杆菌LZ013-2的代谢物处理待处理样品，或者，在待处理样品中接种短小芽孢杆菌LZ013-2，进行发酵培养。
进一步优选地，所述待处理样品为大豆或大豆衍生制品。
所述大豆衍生制品包括但不限于大豆粉、大豆蛋白分离物、大豆蛋白质浓缩物、豆油、豆浆、豆腐、豆渣、豆粕、酱油。
本发明中，所述短小芽孢杆菌LZ013-2的培养可以采用短小芽孢杆菌培养的常规培养基，如常规的含有碳源、氮源及无机离子的天然或合成培养基，包括但不限于LB培养基等。
本发明中，所述短小芽孢杆菌LZ013-2的培养温度为30～37℃，pH为7.0-7.4。最适宜的培养温度为37℃。
本发明还提供一种降解大豆胰蛋白酶抑制剂的方法，其为利用所述短小芽孢杆菌LZ013-2或包含所述短小芽孢杆菌LZ013-2的菌剂处理待处理样品。
上述待处理样品可以为大豆或大豆衍生制品。
所述待处理样品可为未灭菌或灭菌的样品。
作为优选，上述方法为采用所述短小芽孢杆菌LZ013-2的发酵培养物上清或所述短小芽孢杆菌LZ013-2的代谢物处理待处理样品，或者，在待处理样品中接种所述短小芽孢杆菌LZ013-2进行发酵培养。
进一步优选地，所述短小芽孢杆菌LZ013-2的发酵培养物上清或所述短小芽孢杆菌LZ013-2的代谢物可通过发酵培养短小芽孢杆菌LZ013-2制备得到。
作为本发明的一种优选实施方式，所述短小芽孢杆菌LZ013-2的发酵培养物上清或所述短小芽孢杆菌LZ013-2的代谢物为将短小芽孢杆菌LZ013-2在37℃、pH为7.0、振荡或搅拌的条件下，发酵培养48h后，分离发酵培养物的上清液制备得到。
进一步优选地，当采用所述短小芽孢杆菌LZ013-2的培养物上清或所述短小芽孢杆菌LZ013-2的代谢物处理待处理样品时，所述处理为在30～37℃，pH7.0-7.4条件下振荡孵育。
作为本发明的一种优选实施方式，在所述待处理样品中加入所述短小芽孢杆菌LZ013-2的发酵培养物上清，于37℃，pH7.0-7.4条件下振荡孵育4h。
进一步优选地，当在待处理样品中接种所述短小芽孢杆菌LZ013-2进行发酵培养时，所述发酵培养为在30～37℃，pH7.0-7.4条件下培养。
所述发酵培养可以为固体发酵或液体发酵。
所述发酵培养中，短小芽孢杆菌LZ013-2的接种量为1～5％；所述发酵培养的时间为48～60h。
作为本发明的一种优选实施方式，在待处理样品中以2％的接种量接种所述短小芽孢杆菌LZ013-2进行发酵培养，所述发酵培养为在37℃，pH7.0-7.4，发酵培养48h。
本发明的有益效果在于：本发明通过分离筛选获得短小芽孢杆菌LZ013-2，该菌株具有高效降解大豆胰蛋白酶抑制剂的活性。利用该菌株发酵处理大豆或大豆衍生制品，大豆胰蛋白酶抑制剂的降解率最高达到73.6％。利用该菌株降解大豆或大豆衍生制品中的大豆胰蛋白酶抑制剂具有降解效率高、简单易行、成本低等优势，适于大范围推广应用。
附图说明
图1为本发明实施例1中7株筛选菌株的LB-KTI发酵液中KTI降解情况检测的蛋白凝胶电泳图；其中，M为蛋白marker，泳道1为KTI标准品；泳道2,3,4,5,6,7,8分别为7株筛选菌株的发酵液上清样品。
图2为本发明实施例1中LZ013-1、LZ013-2和LZ013-3的发酵上清液降解KTI的活性测定；其中，M为蛋白marker，泳道1为LZ013-1的发酵上清液降解KTI；2：LZ013-2的发酵上清液降解KTI；3：LZ013-3的发酵上清液降解KTI。
图3为本发明实施例1中LZ013-2的发酵上清液降解KTI处理后的KTI残留抑制率测定。
图4为本发明实施例1中LZ013-1、LZ013-2和LZ013-3的基因组与16S rDNA的PCR产物的电泳检测结果；其中，A为基因组电泳检测，M为DNA marker，泳道1为LZ013-1的全基因组；泳道2为LZ013-2的全基因组；泳道3为LZ013-3的全基因组；B为16S rDNA的PCR产物的电泳检测，M为DNAmarker，泳道1为LZ013-1的16S rDNA的PCR产物；泳道1为LZ013-2的16SrDNA的PCR产物；泳道3为LZ013-3的16S rDNA的PCR产物。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中，大豆胰蛋白酶抑制剂的活性检测方法参考国家标准《大豆制品中胰蛋白酶抑制剂活性的测定》(GB5009.224-2016)。
实施例1具有降解大豆胰蛋白酶抑制剂功能的菌株的筛选
本发明采用以胰蛋白酶抑制剂标准品(KTI)作为唯一碳源的无机培养基对赤小豆内生菌株进行筛选，经过48h培养，得到7株形态不同的菌株。将这7株菌分别接种到LB-KTI培养基(LB培养基添加KTI，使KTI终浓度达到0.5mg/mL)中进行KTI降解功能的筛选验证。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析培养48小时的发酵培养基中KTI的残留量，发现3株菌株具有降解KTI的活性(结果如图1所示)，将这3株菌分别命名为LZ013-1、LZ013-2和LZ013-3。
将LZ013-1、LZ013-2和LZ013-3菌株接种于LB液体培养基中(pH＝7.0)，于37℃发酵48h，收集发酵上清液，分别与2mg/mL的KTI以1:1的体积比混合，于37℃孵育2h。通过SDS-PAGE观察KTI的降解情况，结果如图2所示。结果表明，菌株LZ013-2的发酵上清液具有高效降解KTI的活性，20kDa处的KTI蛋白印记完全消失，并产生了13kDa左右及某些更小分子量的降解产物。使用L-BAPA比色法进行胰蛋白酶抑制剂活性测定，发现经过2h的孵育处理，KTI抑制率降低73.6％(如图3所示)，表明经过2h的孵育处理，菌株LZ013-2的KTI降解率可达73.6％左右。
利用分子生物学方法鉴定菌株LZ013-2，具体方法如下：
使用全式金细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株LZ013-2的全基因组，根据16SrDNA保守区域序列设计16S rDNA的扩增引物，引物序列如下：
F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；
R：5’-TACGGTTACCTTGTTACGACT T-3’。
以菌株LZ013-2的基因组为模板，使用上述引物进行PCR，PCR的条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s；55℃退火1min；72℃延伸30s，35个循环；然后72℃完全延伸7min。采用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图4所示，基因组DNA在15000bp左右，16S rDNA条带处在1400bp左右。菌株LZ013-2的16S rDNA的测序结果如SEQID NO.3所示。
将菌株LZ013-2的16S rDNA的测序结果与NCBI Genbank数据库的已有数据比对，并上传至Genbank数据库。经过比对发现LZ013-2为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。
短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)LZ013-2于2019年6月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为Bacillus pumilus，保藏编号为CGMCCNo.18050。
实施例2 B.pumilus LZ013-2的发酵上清液在降解大豆胰蛋白酶抑制剂中的应用
本实施例以豆粕为例，提供B.pumilus LZ013-2的发酵上清液在降解豆粕中大豆胰蛋白酶抑制剂中的应用，具体应用方法如下：
1、豆粕的制备
(1)使用粉碎机将大豆粉碎，过40目筛除去为粉碎杂质，取100g豆粉置于烧杯中，加入200mL正己烷脱脂，搅拌均匀；
(2)倒出上清液，在通风橱内烘干；
(3)加入正己烷脱脂3次，得到豆粕。
2、利用B.pumilus LZ013-2的发酵上清液降解豆粕中大豆胰蛋白酶抑制剂
(1)挑取固体培养基上的B.pumilus LZ013-2接种到LB液体培养基中，在37℃，180rpm振荡培养48h；
(2)取培养物于4℃，8000g离心10min，保留上清液，即得B.pumilus LZ013-2的发酵上清液；
(3)取1g豆粕，分别加入到100mL的Tris-HCl(0.05mol/L，pH＝8.2，作为对照组)和100mL的B.pumilus LZ013-2发酵上清液(实验组)中，在37℃、180rpm振荡孵育4h；
(4)取步骤(3)得到的豆粕降解液(实验组)及Tris-HCl处理溶液(对照组)，通过SDS-PAGE分析大豆胰蛋白酶抑制剂的降解情况。
(5)豆粕中胰蛋白酶抑制剂的活性测定
取步骤(3)得到的豆粕降解液样品(实验组)及Tris-HCl处理溶液(对照组)，参考国家标准《大豆制品中胰蛋白酶抑制剂活性的测定》(GB5009.224-2016)对其中的胰蛋白酶抑制剂的活性进行测定，具体方法如下：
①样品稀释
将待测上清液稀释为三个不同的稀释浓度，确保在三个不同的稀释浓度的抑制率的中至少有一个测定结果在40％～60％之间。如果三个测定结果均没有在此范围内，则需要改变稀释度重新测定。将稀释后的样品于90℃水浴10min，使上清液蛋白失活。
②设置标准组(不含样品稀释液的组分)、样品组(添加样品组分)以及标准组和样品组均做的空白组。标准组：向标准组试管中加入2mL BAPNA溶液，1.2mL蒸馏水；样品组：向样品组试管中向标准组试管中加入2mL BAPNA溶液，0.8mL蒸馏水，0.4mL样品稀释液；空白组：在标准组及样品组添加相同组分的基础上，添加0.4mL 30％乙酸。
③用涡旋振荡器混匀各组离心管中的溶液，并置于37℃恒温水浴锅中，保温10min。
④在每个离心管中加入0.4mL的0.1mg/mL胰蛋白酶溶液，用涡旋振荡器将管内溶液混匀后,将试管放回到恒温水浴锅中，37℃水浴中保温10min。
⑤在标准组和样品组中加入1mL乙酸溶液，混匀。
⑥将离心管置于离心机中,以4000r/min速度离心10min。
⑦采用可见分光光度计，于410nm波长，用10mm比色皿，以水调零，测定上清液的吸光度。
样品提取液的抑制率计算公式如下:
Figure BDA0002120013500000081
式中:
i：抑制率；
Ar：标准溶液的吸光度；
Abr：标准空白溶液的吸光度；
As：样品溶液的吸光度；
Abs：样品空白溶液的吸光度；
⑧胰蛋白酶抑制剂活性分析
计算抑制率后，将抑制百分率代入胰蛋白酶抑制剂活性计算公式中。
胰蛋白酶抑制剂活性计算公式如下：
Figure BDA0002120013500000091
式中：
TIA：胰蛋白酶抑制剂活性，单位为毫克每克(mg/g)；
i：抑制百分率；
100％：换算系数；
ρ：胰蛋白酶使用液的质量浓度，单位为毫克每毫升(mg/mL)；
f＝5.6×103，该数值是满足本实验胰蛋白酶活性条件下的胰蛋白酶纯度折算系数；
m：样品的质量，单位为克(g)；
F：待测上清液的稀释度(mL/100mL)。
经B.pumilus LZ013-2的发酵上清液处理后，大豆胰蛋白酶抑制剂活性的检测结果如表1所示，结果表明，经B.pumilus LZ013-2的发酵上清液处理后，豆粕中大豆胰蛋白酶抑制剂的活性显著降低。
实施例3B.pumilus LZ013-2在降解大豆胰蛋白酶抑制剂中的应用
本实施例以豆粕为例，分别利用B.pumilus LZ013-2进行固体发酵和液体发酵处理豆粕以降解豆粕中大豆胰蛋白酶抑制剂，具体方法如下：
1、豆粕的制备方法同实施例2。
2、豆粕的液态发酵
(1)挑取固体培养基上的B.pumilus LZ013-2接种到LB液体培养基中，在37℃，180rpm振荡培养10h；
(2)取10g上述步骤1中制备的豆粕置于锥形瓶中，添加100mL蒸馏水，100℃灭菌30min；
(3)待步骤(2)的灭菌待处理样品冷却后，以2％的接种量接种B.pumilus LZ013-2，在37℃，160rpm摇床培养48h；
(4)取培养后的发酵液在4℃，10000g条件下离心10min，保留上清液进行豆粕中胰蛋白酶抑制剂的降解情况检测实验。
3、豆粕的固态发酵
(1)取30g上述步骤1中制备的豆粕置于锥形瓶中，添加300mL蒸馏水，100℃灭菌30min；
(2)待步骤(2)的灭菌待处理样品冷却后，以10％接种量接种B.pumilus LZ013-2，在37℃，160rpm摇床培养48h；
(3)取培养后的1.00g豆粕加入100mL的Tris-HCl(pH＝8.2)，震荡均匀，4℃静置12h，在4℃，8000g条件下离心10min，保留上清液进行豆粕中胰蛋白酶抑制剂的降解情况检测实验。
4、未灭菌豆粕的液态发酵
(1)取10g上述步骤1中制备的豆粕置于锥形瓶中，添加100mL蒸馏水，以2％的接种量接种B.pumilus LZ013-2，在37℃，160rpm摇床培养48h；
(2)取培养后的发酵液在4℃，10000g条件下离心10min，保留上清液进行豆粕中胰蛋白酶抑制剂的降解情况检测实验。
5、豆粕中胰蛋白酶抑制剂的活性测定
对上述2、3、4中经B.pumilus LZ013-2发酵处理48h后的豆粕中的胰蛋白酶抑制剂的活性(TIA)进行检测，活性测定方法同实施例2的(5)，以未经发酵的豆粕作为对照，结果如表1所示，结果表明，经B.pumilus LZ013-2的液态发酵或固态发酵处理后，豆粕中的胰蛋白酶抑制剂的活性均显著降低。
表1实施例2和实施例3中胰蛋白酶抑制剂活性测定结果
Figure BDA0002120013500000111
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 一株降解大豆胰蛋白酶抑制剂的短小芽孢杆菌LZ013-2及其应用
<130> KHP191113419.0
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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<210> 3
<211> 1429
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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taccggatag ttccttgaac cgcatggttc aaggatgaaa gacggtttcg gctgtcactt 180
acagatggac ccgcggcgca ttagctagtt ggtggggtaa tggctcacca aggcgacgat 240
gcgtagccga cctgagaggg tgatcggcca cactgggact gagacacggc ccagactcct 300
acgggaggca gcagtaggga atcttccgca atggacgaaa gtctgacgga gcaacgccgc 360
gtgagtgatg aaggttttcg gatcgtaaag ctctgttgtt agggaagaac aagtgcgaga 420
gtaactgctc gcaccttgac ggtacctaac cagaaagcca cggctaacta cgtgccagca 480
gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgttg tccggaatta ttgggcgtaa agggctcgca 540
ggcggtttct taagtctgat gtgaaagccc ccggctcaac cggggagggt cattggaaac 600
tgggaaactt gagtgcagaa gaggagagtg gaattccacg tgtagcggtg aaatgcgtag 660
agatgtggag gaacaccagt ggcgaaggcg actctctggt ctgtaactga cgctgaggag 720
cgaaagcgtg gggagcgaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgag 780
tgctaagtgt tagggggttt ccgcccctta gtgctgcagc taacgcatta agcactccgc 840
ctggggagta cggtcgcaag actgaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg 900
tggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt accaggtctt gacatcctct 960
gacaacccta gagatagggc tttcccttcg gggacagagt gacaggtggt gcatggttgt 1020
cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttgatctt 1080
agttgccagc attcagttgg gcactctaag gtgactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt 1140
ggggatgacg tcaaatcatc atgcccctta tgacctgggc tacacacgtg ctacaatgga 1200
cagaacaaag ggctgcnaga ccgcaaggtt tagccaatcc cataaatctg ttctcagttc 1260
ggatcgcagt ctgcaactcg actgcgtgaa gctggaatcg ctagtaatcg cggatcagca 1320
tgccgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca cgagagtttg 1380
caacacccga agtcggtgag gtaaccttta tggagccagc cgccgaagg 1429

Claims (11)

1.短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LZ013-2，其特征在于，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 18050。
2.包含权利要求1所述的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LZ013-2的菌剂。
3.权利要求1所述短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LZ013-2或权利要求2所述菌剂在降解植物的胰蛋白酶抑制剂中的应用。
4.权利要求1所述短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LZ013-2或权利要求2所述菌剂在提高植物的营养物质消化吸收率或提高植物的营养质量中的应用。
5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述植物为大豆。
6.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述应用为在待处理样品中接种短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LZ013-2或权利要求2所述菌剂，进行发酵培养。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述待处理样品为大豆或大豆衍生制品。
8.一种降解大豆胰蛋白酶抑制剂的方法，其特征在于，利用权利要求1所述短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LZ013-2或权利要求2所述菌剂处理待处理样品。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在待处理样品中接种所述短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LZ013-2或权利要求2所述菌剂进行发酵培养。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述发酵培养为在30~37℃，pH7.0-7.4条件下培养。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其特征在于，所述发酵培养为固体发酵或液体发酵。
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