CN113736765B

CN113736765B - 一种蛋白质在胰蛋白酶抑制剂降解中的应用

Info

Publication number: CN113736765B
Application number: CN202111028646.7A
Authority: CN
Inventors: 梁志宏; 黄昆仑; 花蕴
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2021-09-02
Filing date: 2021-09-02
Publication date: 2023-05-23
Anticipated expiration: 2041-09-02
Also published as: CN113736765A

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种蛋白质在胰蛋白酶抑制剂降解中的应用。所述蛋白质包括如SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。本发明发现，短小芽孢杆菌来源的功能蛋白肽酶S8和肽酶M84具备较高的胰蛋白酶抑制剂降解能力，进一步利用毕赤酵母表达系统实现了这两种对于胰蛋白酶抑制剂有降解作用的肽酶的大量表达，利用本发明提供的方法制备得到的重组酶能够高效稳定降解胰蛋白酶抑制剂，且能够应用于豆粕中胰蛋白酶抑制剂的降解。

Description

一种蛋白质在胰蛋白酶抑制剂降解中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种蛋白质在胰蛋白酶抑制剂降解中的应用。

背景技术

胰蛋白酶抑制剂(KTI)属于丝氨酸蛋白酶抑制剂家族，是大豆中的主要抗营养因子之一，约占豆粕总量的2％。研究表明，过多食用胰蛋白酶抑制剂含量丰富的食物会降低生物体对营养物质的消化吸收水平，甚至出现胰腺肥大或增生的情况。目前，对胰蛋白酶抑制剂的灭活方法除了物理法、化学法外，利用微生物对豆类原料进行发酵，来降解胰蛋白酶抑制剂也已经成为较为常用的方法。

芽孢杆菌属可能是细菌纲中最古老和最多样化的属，由于其生长速度快、发酵周期短、可以分泌蛋白质到细胞外培养基的特性，被广泛用于不同的行业。其产生的蛋白酶大多数是胞外蛋白酶，如丝氨酸蛋白酶，半胱氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。芽孢杆菌来源的蛋白水解酶以碱性为主，最适pH值通常在7.0以上，其分子量跨度范围较大，一般在27-71kDa之间，最优温度在37℃到60℃之间。因芽孢杆菌蛋白酶这些显著的特点，它被应用于在许多行业，如在洗涤工业中，用于去除织物的污渍；在食品行业中，用来获得生物活性肽，加工不同的食品等。食品工业中的许多蛋白都可以用重组的毕赤酵母菌株生产，由于其在重组蛋白分泌方面的优异性能，且宿主细胞自身蛋白的分泌水平较低，因此可以很容易地从上清中获取重组蛋白，来制备具有特殊功能的高质量重组酶。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种蛋白质在胰蛋白酶抑制剂降解中的应用。

第一方面，本发明提供一种蛋白质在胰蛋白酶抑制剂降解中的应用；

所述蛋白质包括如SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。

进一步地，所述蛋白质由SEQ ID NO.2和/或如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列编码得到。

进一步地，所述蛋白质为通过在微生物中表达得到。

进一步地，通过将如SEQ ID NO.2和/或如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列构建至表达载体上，转化至所述微生物中诱导表达得到所述蛋白质。

进一步地，将所述蛋白质在微生物中表达包括如下流程：

(1)将如SEQ ID NO.2和/或如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列构建至表达载体上，转化至毕赤酵母中；

(2)将所述毕赤酵母接种于种子培养基中进行种子培养；

(3)将在种子培养基中培养成熟的毕赤酵母至于诱导培养基中进行诱导表达；

(4)分离诱导表达后的培养基上清液，纯化。

进一步地，步骤(2)中种子培养基为含有3％～5％甘油的BMGY培养基；培养条件为在29～31℃、225～275r/min的条件下培养；

进一步，步骤(3)中诱导培养基为含有0.5～1.5％甲醇的BMMY培养基；培养条件为在29～31℃、225～275r/min的条件下培养；

进一步地，在步骤(3)的诱导表达的过程中，添加甲醇维持其浓度为体积百分比为0.5％～1.5％。

进一步地，步骤(3)中诱导表达的时间为4～7天，优选为4～5天。

进一步地，步骤(4)中的纯化包括硫酸铵沉淀、透析、超滤和蛋白纯化柱纯化中的一种或多种，优选为超滤。

进一步地，为了延长成熟肽酶S8和肽酶M84的保存时间，还包括步骤(5)在-80℃真空冷冻干燥将纯化后的蛋白制备为蛋白粉末。

进一步地，所述微生物为短小芽孢杆菌、大肠杆菌或毕赤酵母中的一种或多种。

所述短小芽孢杆菌为短小芽孢杆菌LZ013-2。

第二方面，本发明提供一种重组微生物，所述重组微生物中编码肽酶S8和肽酶M84的核苷酸序列的信号肽序列缺失；

所述肽酶S8包含如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；所述肽酶M84包括如SEQ IDNO.3所示的氨基酸序列。

进一步地，所述重组微生物的出发菌株为短小芽孢杆菌、大肠杆菌或毕赤酵母中的一种或多种。

所述短小芽孢杆菌为短小芽孢杆菌LZ013-2。

第三方面，本发明提供一种核酸，所述核酸包括如SEQ ID NO.2和/或如SEQ IDNO.4所示的核苷酸序列。

本发明进一步提供包括所述核酸的生物材料，所述生物材料为表达盒、载体或转基因细胞。

本发明具备如下有益效果：

本发明发现短小芽孢杆菌来源的功能蛋白肽酶S8和肽酶M84具备较高的降解胰蛋白酶抑制剂的能力，并进一步对肽酶S8以及肽酶M84的编码基因进行密码子优化，通过毕赤酵母表达系统实现了这两种肽酶的大量表达，获得了能够高效稳定降解KTI的重组酶。

本发明通过对重组毕赤酵母的诱导时间、甘油及甲醇添加量等培养和诱导条件进行优化，进一步提高了肽酶S8以及肽酶M84的表达量。本发明进一步在豆粕体系中进行验证，为重组肽酶的应用提供了有效依据和基础。

附图说明

图1为本发明试验例1提供的不同诱导时间对于重组酶的表达量的影响示意图。

图2为本发明试验例1提供的不同甘油浓度对于重组酶的表达量的影响示意图。

图3位本发明试验例1提供的不同甲醇添加浓度对于重组酶的表达量的影响示意图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。其中，巴斯德毕赤酵母GS115(Pichia pastoris GS115)购自Invitrogen公司；限制性内切酶SacⅠ、DNA Marker DL2000、DL15000购自TaKaRa宝日医生物技术(北京)有限公司；所用培养基均购自于北京索莱宝有限公司。紫外96孔板(96Well Microplate,

Chimney Well)购自Greiner bio-one公司。酶标仪购自芬兰Thermo Multiscan Ascent。

实施例1

本实施例提供一种制备具有降解胰蛋白酶抑制剂的能力的蛋白质的方法，包括如下流程：

1、肽酶S8和肽酶M84编码基因的密码子优化

首先利用生物信息学软件对肽酶S8和肽酶M84的信号肽区域进行分析，确定去除C端信号肽的肽酶S8和肽酶M84成熟肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3所示，根据毕赤酵母的密码子偏好性，结合密码子优化软件和人工筛选，得到如SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.4所示的经密码子优化的肽酶S8和肽酶M84的编码基因，随后合成该编码基因。

2、表达肽酶S8和肽酶M84的载体和重组酵母的构建

将步骤1获得的肽酶S8和肽酶M84的编码基因(如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4所示)连接至pPIC9K质粒的EcoR I和Not I两个酶切位点之间，构建毕赤酵母表达载体pPIC9K/S8和pPIC9K/M84。将表达载体转化至巴斯德毕赤酵母GS115(Pichia pastorisGS115)，经筛选获得阳性重组菌，经传代获得pPIC9K/S8和pPIC9K/M84载体稳定整合至染色体的重组毕赤酵母菌株。

3、重组毕赤酵母的培养和肽酶S8和肽酶M84的制备

通过如下方法进行制备肽酶S8和肽酶M84的重组毕赤酵母的培养和诱导表达方法，：

(1)固体平板活化培养：将步骤2构建的重组毕赤酵母菌株接种于新鲜的YPD平板，30℃酵母培养箱中倒置培养2d。

(2)种子培养：挑取重组菌株的单菌落，接种于25mL BMGY培养基(含有4％的甘油)中，用250mL三角瓶进行培养，直至细胞浓度达到OD₆₀₀＝2～3。培养条件为：30℃、250r/min摇床培养。

(3)诱导表达：收集上述培养物，4000rpm室温下离心5min，倒掉上清液，获得的菌体细胞用20mL BMMY(含有1％的甲醇(v/v))培养基进行重悬浮，于30℃、250rpm/min摇床培养开始诱导表达，总共表达7d。在培养过程中，间隔24h取样一次，每次取样0.5mL，并在每次取样的同时补加100％甲醇至终浓度为1％(v/v)。甲醇的补加按照表1所示的程序进行。

表1诱导表达过程中甲醇的添加量

/>

上述取样获得的0.5mL发酵液样品于4℃、10000rpm离心5min，小心地将上清液转移到另一新离心管中，-20℃保存，备检。

(4)收集上述诱导培养物的上清液，分别采用30kDa和10kDa孔径的超滤膜，离心超滤，获得两种重组酶的酶液。

试验例1

本试验例提供实施例1所得的重组毕赤酵母的培养和诱导表达的关键条件的优化方法：

1、诱导时间对重组酶表达量的影响

与实施例1中提供的重组毕赤酵母的培养和诱导表达方法相同。具体在诱导表达阶段，对于每24h的取样，将其冷冻离心后，收集上清液，于-20℃冻存，采用Bradford法测量不同诱导培养时间的发酵液样品中的蛋白含量，即反映重组酶的表达量。蛋白含量检测结果如图1所示，重组蛋白的表达量随诱导时间的增加缓慢增加，诱导培养的第4天达到峰值。

2、甘油浓度对重组M-CPA表达量的影响

与实施例1中提供的重组毕赤酵母的培养和诱导表达方法相同。具体在种子培养阶段分别添加1％(v/v)、2％(v/v)、3％(v/v)、4％(v/v)的甘油，诱导4d，测定表达量，筛选诱导培养基中最佳的甘油含量。结果如图2所示。

3、甲醇添加浓度对重组M-CPA表达量的影响

与实施例1中提供的重组毕赤酵母的培养和诱导表达方法相同。具体在诱导表达阶段，在于在诱导阶段每隔24h分别添加甲醇使其浓度维持在0.5％(v/v)、1％(v/v)、1.5％(v/v)进行诱导表达，诱导4d，测定表达量。结果如图3所示。

试验例2

本试验例对实施例1制备的重组酶进行KTI降解效率分析，具体以豆粕为例，提供B.pumilus LZ013-2的发酵上清液在降解豆粕中大豆胰蛋白酶抑制剂中的应用，具体应用方法如下：

1、豆粕的制备

(1)使用粉碎机将大豆粉碎，过40目筛除去为粉碎杂质，取100g豆粉置于烧杯中，加入200mL正己烷脱脂，搅拌均匀；

(2)倒出上清液，在通风橱内烘干；

(3)加入正己烷脱脂3次，得到豆粕。

2、重组粗酶对大豆豆粕的降解效果

2.1称取0.5g豆粕，分别加入到50mL 0.05mol/L，pH＝8.2的Tris-HCl、50mL重组S8粗酶液(0.5mg/mL)、50mL重组M84粗酶液(0.5mg/mL)中，在60℃摇床180rpm振荡孵育4h，

2.2取步骤2.1得到的豆粕降解液(实验组)及Tris-HCl处理溶液(对照组)，通过SDS-PAGE分析大豆胰蛋白酶抑制剂的降解情况。

2.3豆粕中胰蛋白酶抑制剂的活性测定

取步骤2.2得到的豆粕降解液样品(实验组)及Tris-HCl处理溶液(对照组)，参考国家标准《大豆制品中胰蛋白酶抑制剂活性的测定》(GB5009.224-2016)对其中的胰蛋白酶抑制剂的活性进行测定，具体方法如下：

(1)将待测上清液稀释为三个不同的稀释浓度，确保在三个不同的稀释浓度的抑制率的中至少有一个测定结果在40％～60％之间。如果三个测定结果均没有在此范围内，则需要改变稀释度重新测定。将稀释后的样品于90℃水浴10min，使上清液蛋白失活。

(2)设置标准组(不含样品稀释液的组分)、样品组(添加样品组分)以及标准组和样品组均做的空白组。

标准组：向标准组试管中加入2mL BAPNA溶液，1.2mL蒸馏水；

样品组：向样品组试管中向标准组试管中加入2mL BAPNA溶液，0.8mL蒸馏水，0.4mL样品稀释液；

空白组：在标准组及样品组添加相同组分的基础上，添加0.4mL30％乙酸。

(3)用涡旋振荡器混匀各组离心管中的溶液，并置于37℃恒温水浴锅中，保温10min。

(4)在每个离心管中加入0.4mL的0.1mg/mL胰蛋白酶溶液，用涡旋振荡器将管内溶液混匀后,将试管放回到恒温水浴锅中，37℃水浴中保温10min。

(5)在标准组和样品组中加入1mL乙酸溶液，混匀。

(6)将离心管置于离心机中，以4000r/min速度离心10min。

(7)采用可见分光光度计，于410nm波长，用10mm比色皿，以水调零，测定上清液的吸光度。

样品提取液的抑制率计算公式如下:

式中:

i：抑制率；

Ar：标准溶液的吸光度；

Abr：标准空白溶液的吸光度；

As：样品溶液的吸光度；

Abs：样品空白溶液的吸光度；

(8)胰蛋白酶抑制剂活性分析

计算抑制率后，将抑制百分率代入胰蛋白酶抑制剂活性计算公式中，胰蛋白酶抑制剂活性计算公式如下：

式中：

TIA：胰蛋白酶抑制剂活性，单位为毫克每克(mg/g)；

i：抑制百分率；

100％：换算系数；

ρ：胰蛋白酶使用液的质量浓度，单位为毫克每毫升(mg/mL)；

f＝5.6×10³，该数值是满足本实验胰蛋白酶活性条件下的胰蛋白酶纯度折算系数；

m：样品的质量，单位为克(g)；

F：待测上清液的稀释度(mL/100mL)。

(9)经重组酶处理后，大豆胰蛋白酶抑制剂活性的检测结果如表2所示，结果表明，经两种重组酶处理后，豆粕中大豆胰蛋白酶抑制剂的活性显著降低。

表2重组酶酶解处理后豆粕TIA变化情况

注：表中数据为平均值±标准差，n＝3，p＜0.05

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 一种蛋白质在胰蛋白酶抑制剂降解中的应用

<130> KHP211118951.9

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 784

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

His His His His His His Ala Pro Ser Asn Lys Gln Val Glu Leu Glu

1 5 10 15

Lys Ala Glu Ile Phe Gly Glu Ile Asn Val Asn Ser Arg Lys His Thr

20 25 30

Thr Val Ile Val Glu Leu Lys Glu Lys Ser Leu Val Glu Ala Lys Gln

35 40 45

Glu Gly Glu Ala Gln Thr Lys Ala Ser Leu Lys Lys Ser Arg Thr Lys

50 55 60

Val Lys Asn Ala Ala Leu Lys Glu Val Asp Lys Ala Ser Ile Arg Gln

65 70 75 80

Glu Tyr Glu Lys Val Phe Ser Gly Phe Ser Met Lys Leu Pro Ala Asn

85 90 95

Glu Ile Pro Lys Leu Leu Ala Val Asp Gly Val Lys Ala Val Tyr Pro

100 105 110

Asp Val Thr Tyr Gln Thr Asp Glu Val Lys Lys Glu Ser Ile Gln Leu

115 120 125

Pro Asn Glu Asp Ile Ser Pro Leu Met Asp Lys Ser Ala Pro Phe Ile

130 135 140

Gly Ala Pro Lys Ala Trp Asp Ala Gly Tyr Ser Gly Lys Gly Val Lys

145 150 155 160

Val Ala Val Ile Asp Thr Gly Val Asp Tyr Thr His Pro Asp Leu Lys

165 170 175

Arg Asn Phe Ser Leu Tyr Lys Gly Tyr Asp Phe Val Asp Asn Asp Tyr

180 185 190

Ser Pro Gln Glu Thr Pro Gln Gly Asp Pro Arg Gly Glu Ser Thr Asp

195 200 205

His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Asn Gly Gln Ile Lys

210 215 220

Gly Val Ala Lys Asp Ala Thr Leu Leu Ala Tyr Arg Val Leu Gly Pro

225 230 235 240

Gly Gly Ser Gly Thr Thr Glu Asn Val Leu Ala Gly Ile Asp Arg Ala

245 250 255

Val Thr Asp Gly Ala Asp Val Met Asn Leu Ser Leu Gly Asn Ser Val

260 265 270

Asn Asn Pro Asp Tyr Ala Thr Ser Ile Ala Leu Asp Trp Ala Met Ser

275 280 285

Glu Gly Val Val Ala Val Thr Ser Asn Gly Asn Ser Gly Pro Asn Ser

290 295 300

Trp Thr Val Gly Ser Pro Gly Thr Ser Arg Asp Ala Ile Ser Val Gly

305 310 315 320

Ala Thr Gln Leu Pro Tyr Ser Leu Tyr Asn Val Arg Phe Pro Asn Tyr

325 330 335

Ser Thr Ala Lys Ile Met Gly Tyr Asn Gln Asp Ser Asp Leu Lys Ala

340 345 350

Leu Asp Lys Lys Gln Val Thr Leu Val His Ala Gly Ile Gly Asp Glu

355 360 365

Lys Ala Phe Glu Gln Met Asp Ala Lys Gly Lys Val Ala Val Ile Glu

370 375 380

Arg Gly Ser Ile Ala Phe Val Asp Lys Val Glu Asn Ala Lys Ala Ala

385 390 395 400

Gly Ala Ile Gly Val Val Met Tyr Asn Asn Thr Asp Gly Glu Ile Pro

405 410 415

Val Asp Val Pro Gly Leu Ala Leu Pro Thr Ile Lys Leu Ser Lys Ala

420 425 430

Glu Gly Thr Ala Leu Val Lys Ala Ile Glu Ala Gly Asn Asn Thr Thr

435 440 445

Thr Phe Ser Ile Gln Phe Val Lys Glu Leu Ser Glu Gln Val Ala Asp

450 455 460

Phe Ser Ser Arg Gly Pro Val Val Asp Thr Trp Met Ile Lys Pro Asp

465 470 475 480

Leu Ser Ala Pro Gly Val Ser Ile Val Ser Thr Ile Pro Thr His Asp

485 490 495

Pro Thr Gln Pro Tyr Gly Tyr Gly Ser Lys Gln Gly Thr Ser Met Ala

500 505 510

Ser Pro His Val Ala Gly Val Ala Ala Ile Ile Lys Gln Ala Lys Pro

515 520 525

Ser Tyr Ser Thr Glu Gln Ile Lys Ala Leu Leu Met Asn Thr Ala Glu

530 535 540

Lys Leu Phe Asp Ala Ser Gly Asn Pro Phe Pro His Asn Thr Gln Gly

545 550 555 560

Thr Gly Ser Val Arg Ile Ile Glu Ser Leu Gln Ala Ser Ser Ile Val

565 570 575

Ser Asp Ala Ser His Ser Tyr Gly Thr Phe Leu Lys Glu Lys Gly Ile

580 585 590

Gln Ile Lys Thr Lys Thr Phe Lys Val Glu Asn Leu Ser Lys Ala Pro

595 600 605

Lys Thr Tyr Thr Ile Asp Tyr Lys Phe Asp Gly Asn Gly Ile Ser Thr

610 615 620

Asn Gly Thr Lys Lys Ile Thr Val Lys Gly Asn Ala Thr Gly Ser Phe

625 630 635 640

Thr Ser Ala Val Gln Val Asn Tyr Ala Lys Thr Lys Lys Gly Thr Tyr

645 650 655

Gln Gly Ser Ile Thr Ile Arg Glu Asn Gly Arg Lys Ile Thr Glu Ile

660 665 670

Pro Thr Leu Leu Ile Val Lys Glu Pro Asp Tyr Pro Arg Val Thr Ser

675 680 685

Val Ser Val Glu Pro Asp Asn Arg Ala Gly Ser Tyr Val Ile Ser Ser

690 695 700

Tyr Leu Pro Gly Gly Ala Glu Asn Leu Ala Phe Leu Val Tyr Thr Thr

705 710 715 720

Asp Gly Glu Tyr Leu Gly Glu Ala Gly Val Tyr Arg Asn Val Asp Lys

725 730 735

Gly Glu Gln Arg Leu Lys Trp Asn Gly Ser Ile Asn Gln Gly Gln Lys

740 745 750

Leu Glu Ala Gly Glu Tyr Thr Met Leu Ala Tyr Ala Ser Gln Lys Gly

755 760 765

Lys Ser Asp Thr Ile Gln Thr Lys Glu Pro Phe Asp Ile His Pro Glu

770 775 780

<210> 2

<211> 2355

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

caccatcatc atcatcatgc tccatctaac aagcaagttg aattggaaaa agctgagatc 60

tttggtgaga ttaacgttaa ttctagaaag catactaccg ttattgttga attgaaggag 120

aaatccctag ttgaagctaa acaagaaggt gaagcccaaa ctaaggcttc tttgaaaaaa 180

tctagaacta aggttaaaaa cgcagctttg aaagaggttg ataaagcatc tattagacaa 240

gaatacgaaa aggtctttag tggtttttct atgaagttgc cagctaatga gattcctaaa 300

ttgttagctg tggatggtgt taaggctgtt tacccagacg ttacttacca aactgatgag 360

gttaagaagg agtctattca attgcctaat gaagatattt ctcctttgat ggataaatct 420

gctcctttta ttggtgcccc taaggcttgg gatgctggtt actctggtaa aggagttaaa 480

gtcgccgtta ttgatactgg tgttgactac actcaccctg atttgaagag aaatttttca 540

ctttacaagg gttatgattt tgttgataac gattactctc ctcaagagac tccacaaggt 600

gaccctagag gtgagtccac tgatcatggt acccatgtcg ctggtactat tgccgcaaac 660

ggacagatta agggtgttgc taaggatgct accttgttgg cctacagagt tttaggtcca 720

ggaggatctg gtactactga aaatgttttg gccggaatcg atagagccgt gaccgatggt 780

gcagacgtta tgaatttgtc tcttggtaac tctgttaaca accctgacta cgctacttct 840

attgctttgg attgggctat gtctgaaggt gtagttgctg ttacttctaa tggtaattct 900

ggtccaaata gttggacagt aggttctcca ggaacctctc gtgacgctat ttctgttggt 960

gctactcaat taccttattc tctttataat gttagatttc ctaactactc tacagctaaa 1020

atcatgggat acaatcaaga ttcagatttg aaagccttag ataagaagca agtgactttg 1080

gtccatgctg gaattggaga tgagaaagct tttgaacaaa tggacgcaaa aggtaaagtt 1140

gctgtaatcg aaagaggaag cattgctttt gttgataagg ttgagaatgc taaggctgct 1200

ggtgctatcg gagttgttat gtataacaat actgatggtg aaatcccagt tgacgttcca 1260

ggtttggctt tgccaactat taagttgtct aaagctgaag gaacagcttt ggttaaggcc 1320

attgaagccg gtaataatac tactaccttc tctattcaat ttgttaaaga gttgtctgag 1380

caagttgctg atttttcttc tagaggtcct gttgtcgata catggatgat caagccagat 1440

ttgtctgctc caggagtttc tattgtttcc acaattccta ctcatgatcc aactcaacct 1500

tacggttatg gatccaaaca gggaacttct atggctagtc ctcatgttgc tggtgttgct 1560

gctattatta agcaggccaa accatcctac tctactgaac agattaaggc tttgttgatg 1620

aacaccgctg aaaaattgtt cgatgcttcc ggtaatccat tccctcataa tacccaaggt 1680

accggttctg ttaggattat tgaatctttg caagcttctt caattgtttc tgatgcctcc 1740

cactcctacg gaactttctt gaaggaaaaa ggaatccaaa ttaagaccaa gactttcaag 1800

gttgaaaact tgagtaaagc cccaaagact tacactatcg attataaatt tgatggtaac 1860

ggtatttcta caaacggtac caagaaaatt acagttaagg gaaatgctac tggttccttt 1920

acatctgctg ttcaagttaa ttacgccaag actaagaaag gtacttatca aggatctatt 1980

actattcgtg agaatggtag aaaaattacc gagattccca ctttgttgat cgtgaaggaa 2040

ccagactatc ctagagtcac ttctgtttct gttgaaccag acaacagagc tggttcttat 2100

gttatttcat cttatttgcc tggtggtgct gaaaatttgg ctttccttgt ttacactact 2160

gatggtgaat acttgggtga ggctggtgtt tatagaaacg ttgataaggg tgaacaaaga 2220

ttgaagtgga atggatctat taaccaaggt caaaaattgg aggctggtga atacactatg 2280

ttggcttacg cttctcaaaa gggaaagtct gatactatcc aaactaagga accatttgac 2340

attcaccctg aataa 2355

<210> 3

<211> 253

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

His His His His His His Ser Ala Pro Val Ala Ser Ala Gly His Gly

1 5 10 15

His Asp His Gly His Met Pro Phe Glu Thr His Ile Ser Glu Gly Leu

20 25 30

Pro Lys Ala Asn Asp Phe Lys Asp Leu Thr Lys Ala Pro Pro Ile Glu

35 40 45

Arg Asp Val Thr Thr Lys Val Leu Asp Glu Ser Gly Lys Gln Val Gly

50 55 60

Ser Arg Thr Phe Lys Ala Asn Thr Gly Asp Ser Ile Ser Thr Lys Ala

65 70 75 80

Ser Thr Gly Ser Gln Lys Val Thr Val Tyr Ala Val Ala Asp Ala Gln

85 90 95

Tyr Arg Ala Lys Tyr Ser Asp Trp Gln Thr Arg Ile Val Ser Ile Ile

100 105 110

Glu Gln Ala Asp Val Thr Phe Asn Arg Asp His Asp Val Asp Phe Val

115 120 125

Val Gln Ala Val Gly Ser Trp Thr Ser Ser Gly Ser Asn Ala Glu Gln

130 135 140

Ile Leu Ser Asn Leu Ser Arg Ser Phe Asp Gly Arg Gly Tyr Asp Phe

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Val Thr Gly Phe Thr Ala Asn Pro Asn Phe Asp Ala Gly Gly Ile Ala

165 170 175

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180 185 190

Asp Gln Gly Thr Ala Asn Thr Ala Lys Ala Ala Thr His Glu Tyr Gly

195 200 205

His Asn Phe Gly Leu Pro His Asp Pro Gln Gly Ser Gly Ile Val Cys

210 215 220

Leu Met Asn Tyr Asp Tyr Ser Tyr Thr Val Asp Phe Phe Asp Ala Ala

225 230 235 240

His Lys Asn Gln Val Asn Arg Asn Lys Ala Trp Tyr Arg

245 250

<210> 4

<211> 762

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

caccatcatc atcatcattc tgctccagtt gcttctgctg gtcatggtca tgatcatggt 60

catatgccat ttgaaactca tatttccgaa ggattgccaa aggctaacga ttttaaggat 120

ttgactaagg ctccacctat tgaaagagat gttactacta aggttttgga tgaatctggt 180

aaacaagttg gttctagaac ttttaaggct aatactggtg actctatttc tactaaagct 240

tctactggtt ctcaaaaggt tactgtttac gctgttgctg atgctcaata cagagctaag 300

tactctgatt ggcaaactag aattgtttcc attattgaac aagctgatgt tacttttaat 360

agagatcatg atgttgattt cgttgttcaa gctgttggtt cttggacttc ctctggttct 420

aacgctgaac aaattttgtc taacttgtct agatcttttg atggtagagg ttacgatttt 480

gttactggtt tcactgctaa tcctaatttt gatgctggtg gtattgctta cgtttacaat 540

tctgctccaa gaggatccgc ttttgctgtt aacttggatc aaggtactgc taacactgct 600

aaggctgcta ctcatgagta cggtcataac tttggtttgc cacatgatcc acaaggttct 660

ggtattgttt gtttgatgaa ttacgattac tcttacactg ttgatttctt tgatgctgct 720

cataagaacc aagttaacag aaacaaggct tggtacagat aa 762

Claims

1.一种蛋白质在胰蛋白酶抑制剂降解中的应用；

所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述蛋白质由SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列编码得到。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述蛋白质为通过在微生物中表达得到。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，通过将如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列构建至表达载体上，转化至所述微生物中诱导表达得到所述蛋白质。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，在所述诱导表达的过程中，添加甲醇维持其浓度为体积百分比为0.5%~1.5%。

6.根据权利要求1-5任一项所述的应用，其特征在于，所述微生物为短小芽孢杆菌、大肠杆菌或毕赤酵母中的一种或多种。