KR100876662B1 - 알지네이트 가수분해 활성을 갖는 스트렙토마이세스 속균주 및 알지네이트 분해효소 - Google Patents

Abstract

본 발명은 알지네이트(alginate)를 포화 알지네이트 올리고머(saturate alginate oligomer)와 불포화 알지네이트 올리고머(unsaturate alginate oligomer)로 분해하는 알지네이트 분해활성을 갖는 스트렙토마이세스 속 균주(Streptomyces sp.), 상기 스트렙토마이세스 속 균주가 생산하는 알지네이트 분해효소(alginate lyase) 및 상기 알지네이트 분해 효소 유전자를 클로닝하여 대장균에 발현한 재조합 효소에 관한 것이다.

알지네이트 올리고머, 알지네이트 분해효소

Description

알지네이트 가수분해 활성을 갖는 스트렙토마이세스 속 균주 및 알지네이트 분해효소{STREPTOMYCES SP. STRAIN HAVING AN ALGINATE HYDROLYSIS ACTIVITY AND ALGINATE LYASE}

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 속. ALG-5 의 16S rDNA의 염기서열이며,

도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른, 스트렙토마이세스 속. ALG-5의 16S rRNA의 염기서열을 기초로 한 다른 세균과의 계통발생학적 관계를 나타내는 표이고,

도 3는 본 발명의 일 실시예에 따른, 스트렙토마이세스 속. ALG-5의 16S rRNA의 염기서열을 기초로 한 다른 세균과의 염기서열 다양성 관계를 나타내는 표로, 상기 도 3의 수치는 스트렙토마이세스 파르부스의 16S rRNA 유전자의 염기위치를 나타내는 것이고,

도 4은 본 발명의 일 실시예에 따른, 알지네이트 분해효소 활성을 가진 스트렙토마이세스 속. ALG-5의 고체배지에 배양하였을 때의 균주를 촬영한 사진이며,

도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른, 알지네이트 분해효소 활성을 가진 스트렙토마이세스 속. ALG-5의 액체배지상에 형성된 집락의 사진이고,

도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른, 배양배지의 온도에 따른 스트렙토마이 세스 속. ALG-5의 생육도를 보여주는 그래프이며,

도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른, 배양배지의 초기 pH에 따른 스트렙토마이세스 속. ALG-5 균주의 생육도를 보여주는 그래프이고,

도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른, 배양시간에 따른 스트렙토마이세스 속. ALG-5 균주의 생육도 및 스트렙토마이세스 속. ALG-5균주가 생산하는 알지네이트 분해효소의 활성을 보여주는 그래프이며,

도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른, 스트렙토마이세스 속. ALG-5 균주가 생산하는 알지네이트 분해효소의 pH에 따른 알지네이트에 대한 분해 활성을 보여주는 그래프이고,

도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른, 스트렙토마이세스 속. ALG-5 균주가 생산하는 알지네이트 분해효소의 온도에 따른 알지네이트에 대한 분해 활성을 보여주는 그래프이며,

삭제

도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른, 스트렙토마이세스 속. ALG-5 균주가 생산하는 알지네이트 분해효소의 기질특이성을 나타내는 그래프이며,

도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른, 스트렙토마이세스 속. ALG-5 균주가 생산하는 알지네이트 분해효소의 유전자 서열 및 단백질 서열을 나타내는 그래프이고,

도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른, 스트렙토마이세스 속. ALG-5의 알지네이트 분해효소를 암호화하는 서열을 포함한 벡터를 대장균에서 발현시켜 제조한 재조합 알지네이트 분해효소의 발현 양상을 나타내는 SDS-PAGE 및 면역 검증의 결과이며,

도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른, 스트렙토마이세스 속. ALG-5의 알지네이트 분해효소를 암호화하는 서열을 포함한 벡터를 대장균에서 발현시켜 제조한 재조합 알지네이트 분해효소의 분해활성을 나타내는 그래프이고,

도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른, 스트렙토마이세스 속. ALG-5의 알지네이트 분해효소를 암호화하는 서열을 포함하는 재조합 알지네이트 분해효소의 발현 벡터인 pColdI-ALG5의 개열지도를 나타내는 것이며,

도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른, 스트렙토마이세스 속. ALG-5의 알지네이트 분해효소를 암호화하는 서열을 포함하는 재조합 알지네이트 분해효소의 발현 벡터인 pGEM-T-ALG5의 개열지도를 나타내는 것이고,

도 18은 본 발명의 일 실시예에 따른, 스트렙토마이세스 속. ALG-5의 알지네이트 분해효소를 암호화하는 서열을 클로닝하기 위해 사용된 벡터인 pColdI vector의 개열지도를 나타내는 것이며,

도 19는 본 발명의 일 실시예에 따른, 스트렙토마이세스 속. ALG-5의 알지네이트 분해효소를 암호화하는 서열을 클로닝하기 위해 사용된 벡터인 pGEM-T easy vector의 개열지도를 나타내는 것이고,

도 20은 본 발명의 일 실시예에 따른, 스트렙토마이세스 속. ALG-5의 알지 네이트 분해효소를 암호화하는 서열을 pGEM-T easy vector 및, pColdI vector에 클로닝하는 과정을 나타내는 모식도이다.

[발명이 속하는 기술분야]

본 발명은 알지네이트(alginate)를 포화 알지네이트 올리고머(saturate alginate oligomer)와 불포화 알지네이트 올리고머(unsaturate alginate oligomer)로 분해하는 알지네이트 분해활성을 갖는 스트렙토마이세스 속 균주(Streptomyces sp.), 상기 스트렙토마이세스 속 균주가 생산하는 알지네이트 분해효소(alginate lyase), 상기 알지네이트 분해 효소 유전자를 클로닝하여 대장균에 발현하여 제조한 재조합 효소 및 상기 알지네이트 분해 효소 또는 재조합 효소를 이용하여 고효율로 알지네이트 올리고머를 제조하는 방법에 관한 것이다.

[종래기술]

갈조류로부터 추출한 알지네이트는 α-L-글루론산(guluronate)과 C5 에피머(epimer)인 β-D-만뉴론산(1,4'-β-D-mannuronate)이 pG block, pM block 및 pM/G stretch 형식으로 결합된 복잡한 당중합체로, 독특한 물리적 성질 때문에 예로부터 광범위하게 사용되어 왔다. 예를 들어, 안정제, 점질제, 식품이나 음료, 종이나 인쇄, 제약산업 등에서 겔화제, 미립구, 비드, 마이크로캡슐, 정제 등으로 약물전달시스템 또는 조직공학에서 매트릭스 담체 등으로 사용되어 왔다(Sanford, P. A. and Baird, J. The Polysaccarides, Aspinall G. O. ed., Vol. 2. New York, academic pp. 411-490(1983), Gacesa, P. Alginate, Carbohydr. Polym. 8: 161-182(1988)).

또한, 상기의 알지네이트를 분해하는 알지네이트 분해효소(alginate lyase)는 알지네이즈(alginase) 또는 알지네이트 디폴리머레이즈(alginate depolymerase)라고 알려져 있는 효소를 의미하며, 그 분해에 대한 완전한 기전은 아직까지 밝혀지지 않았으나 β-elimination 반응에 의한 알지네이트 분해반응을 촉매하는 효소이다(Wong, T. Y., Preston, L. A. and Schiller, N. L. Alginate lyase: Review of major sources and enzyme characteristics, structure-function analysis, biological roles, and applications, Annu. Rev. Microbiol. 54: 289-340(2000); Gacesa, P. Alginate modifying enzymes, FEBS Microbiol. Lett. 126: 19-24(1987); Gacesa, P. Enzymic degradation of alginates, Int. J. Biochem. 24: 545-552(1992)). 알지네이트 분해효소는 pM-block(polymannuronate block) 또는 pG-block(polyguluronate block)에 작용하여 주로 어떤 위치를 분해하느냐에 따라 분류되며, 한 종류는 만뉴로네이트(mannuronate)와 만뉴로네이트(mannuronate) 사이의 β(1-4) 당결합을 분해하는 알지네이트 분해효소(EC 4.2.2.3, (1→4)-β-D-mannuronan lyase)이고 다른 한 종류는 글루로네이트(guluronate)와 글루로네이트(guluronate) 사이의 α(1-4) 당결합을 분해하는 알지네이트 분해효소(EC 4.2.2.11, (1→4)-α-D-guluronan lyase)이다(Gacesa, P. Enzymic degradation of alginates, Int. J. Biochem. 24: 545-552(1992); Sutherland, I. W. Polysaccharide lyase, FEMS Microbiol. Rev. 16: 323-347(1995)). 대부분의 미생물들은 기질특이성에 기초한 한 종류의 알지네이트 분해효소를 내지만 어떤 해양 동물이나 박테리아균주에 따라 한 종류 이상의 알지네이트 분해효소 또는 다양한 기질에 특이성을 가진 알지네이트 분해효소를 생산하기도 한다.

한편, 알지네이트 분해효소는 갈조류 또는 홍조류의 원형질체를 제조하는데 사용되고 있으며, 이렇게 얻은 원형질체를 기능성식품에 첨가하는 등 특별한 용도로 사용하기 위하여 알지네이트를 개선하는데 사용되고 있다(Akiyama, H., Endo, T., Nakakita, R., Murata, K., Yonemoto, Y., and Okayama, K. Effect of depolymerized alginates on the growth of bifidobacteria, Biosci. Biotech. Biochem., 56: 355-356(1992)). 예를 들어, Photobacterium sp.로부터 얻은 polyM lyase는 병원성균인 P. aeruginosa의 점질물인 alginate를 분해하는 연구에 사용되고 있으며 (Heyraud, F., colin-Morel, P., Gey, C., Chavagnat, F., Guinand, M., and Wallach, An enzymatic method for preparation of homopolymannuronate blocks and strictly alternating sequences of mannuronic and guluronic units, J. Carbohydr. Res. 308: 417-422(1988)), Flavobacterium multivolum으로부터 얻은 G-specific lyase 등은 poly(G) 또는 poly(M/G)등을 분해함으로써 sodium alginate로부터 pM block을 얻는데 사용되고 있다(Ochi, Y., Takeuchi, T., Murata, K., Kawabata, Y., and Kusakabe, I. A simple method for preparation of poly-mannuronate using poly-guluronate lyase, Biosci. Biotechnol. Biochem., 59: 1960-1961(1995)).

알지네이트 분해효소들은 특정한 목적을 위해 사용되는 개선된 형태로 알지네이트를 개선하는데 사용될 수도 있고, 알지네이트를 생산하는 Pseudomonas aeruginosa에 감염된 cystic fibrosis(CF) 환자들을 치료하는데 화학요법과 함께 사용될 수도 있는 등(Kawada, A., Hiura, N., Shiraiwa, M., Tajima, S., Hiruma, M., et al. Stimulation of human keratinocyte growth by alginate oligosaccharides, a possible co-factor for epidermal growth factor in cell culture, FEBS Lett. 408: 43-46(1997), Soothill, J. S. Bacteriophage prevents destruction of skin grafts by Pseudomonas aeruginosa, Burns, 20: 209-211(1994)), 다양한 목적으로 사용될 수 있으므로, 상기 알지네이트 분해효소를 생산하는 미생물 및 알지네이트 분해효소 자체에 대한 연구가 요구되고 있다.

본 발명은 알지네이트 분해활성을 가진 스트렙토마이세스 속 균주(Streptomyces sp.)를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 스트렙토마이세스 속 균주가 생산하는 알지네이트 분해효소(alginate lyase)를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 효소 생촉매 개발을 위한 분리 및 정제 과정에 의한 비용의 증가 및 활성 손실 문제점을 해결하기 위하여, 스트렙토마이세스 속 균주 유래의 알지네이트 분해효소를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환시킨 미생물인 형질전환체 및 상기 형질전환체를 이용하여 재조합 알지네이트 분해효소를 생산하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 벡터로 형질전환시킨 미생물인 형질전환체에서 발현시켜 제조한 재조합 알지네이트 분해효소를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 스트렙토마이세스 속 균주, 알지네이트 분해 효소 또는 재조합 효소를 이용하여 고효율로 알지네이트 올리고머를 제조하는 방법에 관한 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 알지네이트 분해활성을 가진 스트렙토마이세스 속 균주 KCTC 11091BP(Streptomyces sp. KCTC 11091BP)를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 스트렙토마이세스 속 균주 KCTC 11091BP가 생산하는 알지네이트 분해효소(alginate lyase)를 제공한다. 상기 알지네이트 분해효소는 바람직하게는 서열번호 4에 기재된 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 아미노산 서열인 것이다.

또한, 본 발명은 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로 이루어지는, 스트렙토마이세스 속 균주 KCTC 11091BP의 알지네이트 분해효소를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 바람직하게는 상기 유전자서열은 서열번호 4에 기재된 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드이다.

또한, 본 발명은 상기 스트렙토마이세스 속 KCTC 11091BP의 알지네이트 분해효소를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 추가적으로 본 발명은 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체에 관한 것이며, 상기 형질전환체는 대장균(E.coli), 스트렙토마이세스 속 균주 또는 효모일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 스트렙토마이세스 속 KCTC 11091BP의 알지네이트 분해효소를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터로 형질전환된 형질전환체를 이용하여 알지네이트 분해효소를 생산하는 방법에 관한 것이다.

이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

본 발명은 알지네이트 분해활성을 가진 스트렙토마이세스 속 균주(Streptomyces sp.)에 관한 발명이다.

본 발명의 균주는 스트렙토마이세스 속 ALG-5로 명명하였다. 본 발명의 균주 스트렙토마이세스 속 ALG-5를 대한민국 대전광역시 유성구 어은동 52번지에 위치한 한국생명공학연구원에 기탁하였으며, 기탁번호 KCTC 11091BP를 부여받았다.

본 발명의 일예에서, 본 발명에 따른 우수한 알지네이트 분해활성을 가지는 스트렙토마이세스 속 균주는 대한민국 경상남도 기장 바닷가에서 채취한 해조류를 시료로 이용하여 분리하였으며, 상기 분리된 균주 중에서 가장 알지네이트 분해활성이 높은 균주인 ALG-5 균주를 분리하였다.

상기 분리된 ALG-5 균주의 동정을 위하여 16S rDNA 염기서열의 상동성 분석을 실시한 결과, 본 발명의 분리된 ALG-5 균주는 도 2에 나타낸 바와 같이 스트렙토마이세스 속의 균주와 높은 유사도를 나타내었고, 변이 부분이 많은 500번까지의 염기서열로 상동성 분석을 실시한 결과, 스트렙토마이세스 속 상기 ALG-5 균주를 스트렙토마이세스 속 균주 ALG-5라 명명하였다.

상기 스트렙토마이세스 속 균주 ALG-5는 다양한 범위의 알지네이트 분해활성 및 우수한 알지네이트 분해활성을 가지는 것으로 확인되었고, 20℃ 내지 30℃에서 잘 생육하였으며, 생육최적온도가 30℃이었고, pH 8 내지 pH 9에서 잘 생육하였으며, 생육최적pH는 pH 8인 것으로 확인되었다. 상기 스트렙토마이세스 속 균주 ALG-5는 육상미생물의 최적 생육온도 보다 낮은 20℃ 내지 30℃에서 잘 생육하므로, 특별한 추가공정 없이 알지네이트 분해에 사용될 수 있고, 다양한 알지네이트 즉, 알지네이트의 폴리글루론산 블록(polyguluronate block, pG block), 알지네이트의 폴리만뉴론산 블록(polymannuronate block, pM block), 알지네이트의 폴리글루론산-폴리만뉴론산 블록(poly mannuronate- guluronate block, poly M-G block / poly G-M block) 및 알긴산나트륨(Sodium Alginate)에 대하여 모두 분해활성이 뛰어나 기능성 식품 재료 또는 의약품 재료 등에 사용될 수 있는 알지네이트 올리고머(alginate oligomer)를 제조하는데 효율적으로 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 스트렙토마이세스 속 균주 ALG-5가 생산하는 알지네이트 분해효소(alginate lyase)에 관한 발명이다.

상기 알지네이트 분해효소는 최초로 스트렙토마이세스 속 균주, 바람직하게는 스트렙토마이세스 속 균주 KCTC 11091BP로부터 PCR기법을 이용하여 클로닝된 것이고, 상기 클로닝된 알지네이트 분해효소는 기존의 알지네이트 분해효소에 비하여 기질특이성이 넓고 효소특성이 상이한 것으로, 상기 알지네이트 분해효소 유전자는 777개의 염기로 구성되어 있으며, 258개의 아미노산으로 번역되고, 약 27.5kDa의 분자량을 가지고 있다.

본 발명에 따른 알지네이트 분해효소는 바람직하게는 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 4에 기재 된 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 가진 것일 수 있다.

상기 본 발명에 따른 알지네이트 분해효소를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열을 암호화하는 서열을 포함하는 것일 수 있고, 바람직하게는 서열번호 4에 기재된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있으며, 상기 효소의 활성을 유지하는 한, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 알려진 방법으로 뉴클레오타이드를 결실, 치환 또는 삽입 등으로 변형한 것일 수 있다.

상기 알지네이트 분해효소는 알지네이트의 폴리글루로네이트 블록(polyguluronate block, pG block), 알지네이트의 폴리만뉴로네이트 블록(polymannuronate block, pM block), 알지네이트의 폴리글루로네이트-폴리만뉴로네이트 블록(poly mannuronate- guluronate block, poly M-G block / poly G-M block), 알긴산나트륨(Sodium Alginate) 및 알지네이트에 대하여 모두 분해활성이 뛰어난 것으로 나타나 기질특이성이 넓은 것으로 확인되었고, 특히, 알지네이트의 폴리글루로네이트 블록(polyguluronate block, pG block)에 대하여 가장 기질특이성이 높은 것으로 확인되었다. 즉, 상기 알지네이트 분해효소는 그 기질이 폴리글루로네이트(polyguluronate), 폴리만뉴로네이트(polymannuronate), 글루로네이트-만뉴로네이트 랜덤 폴리머(mannuronate-guluronate random polymer), 알긴산나트륨 및 알지네이트으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상인 것일 수 있다. 본 발명의 알지네이트 분해효소는 기존에 보고된 알지네이트 분해효소와 달리 폴리글루로네이트, 폴리만뉴로네이트 및 글루로네이트-만뉴로네이트 랜덤 폴리머 모두에 대하여 분해활성이 있어, 알지네이트 올리고머의 생산에 이용하는 경우, 생산 효율이 높아 산업적으로 매우 유용하다.

상기 알지네이트 분해효소는 20℃ 내지 43℃에서 높은 활성을 나타내었으며, 최적반응온도는 40℃이었고, 육상미생물의 평균적인 배양온도보다 낮은 20℃에서도 최적활성의 80%가 넘는 활성을 나타내었다.

또한, 상기 알지네이트 분해효소는 pH 5 내지 pH 7에서 높은 활성을 나타내었고, 최적반응 pH는 pH 6으로 약산성에서 높은 활성을 나타내었다. 상기 알지네이트 분해효소는 약산성 즉, pH 5 내지 pH 7에서 높은 활성을 나타내어 실제 알지네이트 올리고머의 제조를 위해 사용되는 기질인 알긴산 나트륨을 사용하는 경우, pH 조절을 위한 추가적인 공정없이 알긴산 또는 알긴산 나트륨으로부터 알지네이트 올리고머를 생산할 수 있어 산업적으로 매우 유용하다.

삭제

또한, 본 발명의 알지네이트 분해효소는 해조류를 기질로 하는 경우, 기질인 해조류에 포함되어 있는 다양한 결합을 분해할 수 있으므로, 즉 알지네이트의 폴리글루로네이트 블록(polyguluronate block, pG block), 알지네이트의 폴리만뉴로네이트 블록(polymannuronate block, pM block), 알지네이트의 글루로네이트-만뉴로네이트 랜덤 블록(mannuronate-guluronate random polymer), 알긴산나트륨(Sodium Alginate) 또는 알지네이트를 분해할 수 있어 기능성 식품 재료 또는 의약품 재료 등에 사용될 수 있는 알지네이트 올리고머(alginate oligomer)를 제조하는데 효율적으로 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 효소 생촉매 개발을 위한 분리 및 정제 과정에 의한 비용의 증가 및 활성 손실 문제점을 해결하기 위하여, 스트렙토마이세스 속 균주 유래의 알지네이트 분해효소를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환시킨 미생물인 형질전환체 및 상기 형질전환체를 이용하여 재조합 알지네이트 분해효소를 생산하는 방법에 관한 발명이다. 상기 벡터의 제조 및 형질전환체의 제조는 통상의 유전공학적 방법에 따라 제조된다.

상기 벡터는 사용하는 숙주에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 일 예로 대장균의 경우에는 도입된 외래 유전자를 형질전환체에서 수용성 형태로 고효율로 발현시킬 수 있는 pColdI 벡터(Takara, Japan)을 사용할 수 있고, 효모의 경우에는 갈락토스를 암호화하는 유전자인 GAL1의 프로모터를 외래 유전자의 발현에 이용할 수 있는 pYES2(Invitrogen Co., USA) 등을 사용할 수 있다. 바람직하게는 상기 벡터는 pColdI 벡터에 서열번호 4의 알지네이트 분해효소를 암호화하는 유전자 서열을 가진 폴리뉴클레오타이드를 삽입시킨 것이고, 상기 숙주는 바람직하게는 대장균이다. 상기 pColdI 벡터에 서열번호 4의 알지네이트 분해효소를 암호화하는 유전자 서열을 가진 폴리뉴클레오타이드를 삽입시킨 것 벡터의 유전자 지도를 도 16에 나타내었다.

상기 형질전환체는 상기 벡터를 이용하여 제조한 것으로 상기 형질전환체의 제조에 사용되는 미생물은 대장균, 바실러스 속 균주 및 슈도모나스 속 균주와 같은 원핵세포 또는 효모, 곰팡이 등의 진핵세포 등을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 형질전환체를 이용하여 알지네이트 분해효소를 생산하는 방법은 상기 형질전환체를 배양액을 이용하여 배양하고, 상기 배양액에 포함된 알지네이트 분해효소 또는 상기 형질전환체 내에 존재하는 알지네이트 분해효소를 수득하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 배양액, 배양조건 및 배양방법은 형질전환체의 종류에 따라 적절하게 선택될 수 있으며, 상기 형질전환체에 의해 발현되는 방법으로 제조된 알지네이트 분해효소는 종래 알려진 통상의 방법으로 정제할 수 있지만, 정제하지 않고 전세포 또는 이의 배양물 형태로 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 벡터로 형질전환시킨 미생물인 형질전환체에서 발현시켜 제조한 재조합 알지네이트 분해효소에 관한 발명이다.

상기 형질전환체는 바람직하게는 대장균일 수 있고, 상기 벡터는 pColdI 벡터일 수 있으며, 일 예로, 상기 pColdI 벡터를 대장균에 도입시켜 제조한 형질전환체에 의해 제조된 재조합 알지네이트 분해효소는 pColdI 벡터가 가지는 His-Tag을 포함한 융합 단백질일 수 있으며, 상기 융합단백질의 크기는 29.5 kDa일 수 있다.

또한, 본 발명은 생촉매를 이용하여 고효율로 알지네이트 올리고머를 제조하는 방법에 관한 발명이다.

상기 생촉매는 스트렙토마이세스 속 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 배양액의 농축액, 알지네이트 분해효소, 형질전환체 또는 재조합 알지네이트 분해효소일 수 있다.

상기 스트렙토마이세스 속 균주는 바람직하게는 스트렙토마이세스 속 균주 KCTC 11091BP(Streptomyces sp. KCTC 11091BP)일 수 있고, 상기 알지네이트 분해효소(alginate lyase)는 바람직하게는 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열을 가진 알지네이트 분해효소, 더욱 바람직하게는 서열번호 4에 기재된 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 가진 알지네이트 분해효소일 수 있으며, 상기 형질전환체는 상기 서열번호 4에 기재된 알지네이트 분해효소를 암호화하는 유전자 서열을 가진 폴리뉴클레오타이드를 pColdI 벡터에 삽입시킨 벡터를 대장균에 형질전환시킨 형질전환체일 수 있고, 상기 재조합 알지네이트 분해효소는 바람직하게는 상기 서열번호 4에 기재된 폴리뉴클레오타이드 서열을 pColdI 벡터에 도입시켜 제조한 재조합 벡터를 대장균에 형질전환시켜 제조한 형질전환체에 의해 제조된 재조합 알지네이트 분해효소일 수 있으며, 상기 재조합 알지네이트 분해효소의 크기는 29.5 kDa일 수 있다. 상기 제조합 벡터는 바람직하게는 도 16에 기재된 유전자 지도를 갖는 벡터일 수 있다.

본원 발명에서 배양물이란 동물세포나 식물세포 또는 세균 따위를 기르는데 필요한 영양소가 포함되어 있는 고체 배양배지 또는 액체 배양배지 및 상기 고체 배양배지 또는 액체 배양배지에 접종되어 배양된 동물세포나 식물세포 또는 세균을 포함하는 것을 의미하며, 상기 배양물은 바람직하게는 배양액을 의미한다. 상기 배양액은 상기 액체 배양배지 및 상기 액체 배양배지에 동물세포나 식물세포 또는 세균를 접종하여 배양한 것을 의미한다. 또한, 본원 발명에서 배양액의 농축액이란 상기 배양액을 농축한 것을 의미한다.

상기 알지네이트 올리고머 제조방법은 해조류, 해조류 추출물, 알지네이트, 알긴산나트륨, 폴리글루로네이트, 폴리만뉴로네이트 또는 글루로네이트-만뉴로네이트 랜덤 블록(mannuronate-guluronate random polymer)에 생촉매를 첨가하여 반응시키는 단계, 및 상기 반응에 의해 생산된 알지네이트 올리고머를 수득하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

상기 해조류의 예는 갈조류 또는 홍조류가 있으며, 바람직하게는 갈조류일 수 있고 더욱 바람직하게는 톳, 미역, 다시마, 대황 또는 모자반일 수 있다.

상기 생촉매를 첨가하여 반응시키는 단계는 바람직하게는 기질의 pH가 pH 5 내지 pH 7일 수 있으며, 상기 반응 온도는 바람직하게는 20℃ 내지 43℃일 수 있으며, 상기 알지네이트 올리고머를 수득하는 단계는 이온교환수지법 또는 겔여과법을 이용하거나 산침전 또는 알콜침전법을 이용하여 수행할 수 있다.

상기 제조방법에 의해 제조되는 알지네이트 올리고머는 안정제, 점질제, 식품이나 음료, 종이나 인쇄, 제약산업 등에서 겔화제, 미립구, 비드, 마이크로캡슐, 정제 등으로 약물전달시스템 또는 조직공학에서 매트릭스 담체 등으로 사용될 수 있다.

일 예로, 상기 알지네이트 올리고머가 항암용 조성물 또는 정장효과를 나타내는 정장용 조성물 등의 의약품 또는 식품에 사용 또는 포함되는 경우에는 상기 알지네이트는 글루로네이트 또는 만뉴로네이트가 3 내지 15개가 결합된 올리고머, 바람직하게는 글루로네이트 또는 만뉴로네이트가 3 내지 10개가 결합된 올리고머, 더욱 바람직하게는 글루로네이트 또는 만뉴로네이트가 3 내지 7개가 결합된 올리고머일 수 있으며, 상기 의약품 또는 식품에 사용 또는 포함되는 알지네이트 올리고머는 분자량이 2,500 이하 또는 2,000 이하인 것일 수 있다(Yamamoto, Y., Kurachi, M., Yamaguchi, K. and Oda T. Induction of mutiple cytokine secretion from RAW264.7 cells by alginate oligosaccharides, Biosci. Biotechnol. Biochem., 71, 238-241(2007); Iwamoto, M, Kurachi, M, Nakashima, T, Kim, D., Yamaguchi, K., Oda, T., Iwamoto, Y., and Muramatsu, T. Structure-activity relationship of alginate loigosaccharides in the induction of cytokine production from RAW264.7 cells, FEBS Letters, 579, 4423-4429 (2005)).

또한, 본 발명은 상기 생촉매를 이용하는 알지네이트 추출방법에 관한 것이다.

상기 알지네이트는 다양한 산업분야에 사용될 수 있어, 산업적 유용성이 매우 높음에도 불구하고, 알지네이트가 다량 포함되어 있는 해조류, 바람직하게는 갈조류로부터 추출하는 경우 추출 효율이 매우 낮아 그 산업적 이용에 한계가 있는 것으로 보고 되고 있다.

상기 해조류로부터 알지네이트를 추출함에 있어 기존의 추출법을 이용하는 경우 추출 효율이 낮은 문제점이 발생한 것은 알지네이트 등으로 이루어진 해조류의 세포벽이 해조류 내의 알지네이트가 추출용매에 의해 추출되는 것을 차단하기 때문인 것으로 보고 되고 있다. 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 기존에 보고된 추출방법은 강산 등을 이용하여 해조류의 세포벽을 파괴하는 방법을 제시하고 있으나, 이러한 추출방법은 강산으로 반응시킨 후, pH를 조절하는 단계를 추가로 포함하는 등 단계가 복잡하고 비용이 많이 든다는 단점이 있다.

본 발명의 알지네이트 추출방법의 경우, 본 발명의 생촉매가 알지네이트 분해활성이 뛰어나다는 것, 특히 알지네이트에 다양하게 분포되어 있는 알지네이트의 폴리글루로네이트 블록(polyguluronate block, pG block), 알지네이트의 폴리만뉴로네이트 블록(polymannuronate block, pM block) 및 알지네이트의 글루로네이트-만뉴로네이트 랜덤 블록(mannuronate-guluronate random polymer) 모두에 대하여 분해활성을 가지고 있다는 점을 확인하여 완성한 것이다.

상기 알지네이트 추출방법은 a) 해조류를 건조 및 분쇄하여 분말을 제조하는 단계; b) 상기 분말 해조류에 상기 생촉매를 첨가하여 반응시키는 단계 및 c) 상기 생촉매 반응물에 추출용매를 가하여 알지네이트 추출물을 제조하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

상기 해조류의 예는 갈조류 또는 홍조류가 있으며, 바람직하게는 갈조류일 수 있고 더욱 바람직하게는 톳, 미역, 다시마, 대황 또는 모자반일 수 있다.

상기 생촉매를 첨가하여 반응시키는 단계는 바람직하게는 pH 5 내지 pH 7에서 반응시킬 수 있고, 상기 반응 온도는 바람직하게는 20℃ 내지 43℃일 수 있다.

상기 알지네이트 추출물을 제조하는 단계는 해조류로부터 알지네이트를 추출하는 통상의 추출법에 의할 수 있으며, 상기 추출용매는 바람직하게는 물일 수 있으며, 상기 추출방법은 바람직하게는 열수추출법일 수 있다.

상기 알지네이트 추출방법은 상기 c) 단계 이후, 상기 추출물에 분획용매를 가하여 분획물을 제조하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 추출물 또는 분획물에 대하여 감압여과 또는 건조를 통해 농축 또는 용매를 완전히 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

이하 본 발명의 실시예를 기재한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

<실시예 1> 알지네이트 분해활성을 가진 미생물의 탐색 및 분리

실시예 1-1 알지네이트 분해활성을 가진 미생물의 탐색

알지네이트 분해활성을 가진 미생물을 탐색 및 분리하기 위하여, 대한민국 경상남도 기장 바닷가에 서식하는 해조류들을 채취한 후 상기 채취된 해조류의 표면을 칼로 긁어 증류수로 10배 희석한 후 0.2% 알긴산 나트륨(sodium alginate)이 포함된 M9 Agar 배지에 도말하였다. 상기 희석액을 도말한 배지를 30℃에서 4일 동안 배양한 후, 자란 콜로니(colony)를 알지네이트(aglinate)가 들어있지 않은 M9 Agar 배지와 0.2% 알긴산 나트륨이 포함된 M9 Agar 배지에 접종하고 30℃에서 5일 동안 배양한 다음 콜로니의 크기를 비교하여 알지네이트 함유배지에서 잘 자라는 콜로니 6개를 알지네이트 분해활성을 가진 미생물로 선택하였다. 상기에서 분리선택된 균주는 상기 균주와 관련된 실험에 사용되기까지 0.2% 알긴산 나트륨이 함유된 marine broth agar 배지에 접종하여 4℃에서 보관하였다.

상기 M9 Agar 배지는 증류수에 Na₂HPO₄(300g/l), KH₂PO₄(25g/l), NH₄Cl(5g/l), NaCl(2.5g/l) 및 CaCl₂(15㎎/l)이 포함되어 있는 M9 혼합액 5L를 멸균시켜놓고 사용시 증류수와 1:1로 희석하여 제조하였고, M9 agar 배지는 상기 M9 혼합액에 2% agar를 첨가하여 제조하였으며, M9 알지네이트 agar(M9 alginate agar) 배지는 상기 M9 혼합액에 0.2% 알긴산 나트륨 및 2% agar를 첨가하여 제조하였다.

한편, 상기 marine broth agar 배지는 marine broth 2216 배지(Difco Co., USA)에 2% agar를 첨가하여 고체배지로 제조하였다.

실시예 1-2 알지네이트 분해활성을 가진 미생물의 분해활성 측정

상기 실시예 1-1에서 1차적으로 선별된 균주의 알지네이트 가수분해능을 평가하기 위하여, 2차 평가를 수행하였다. 상기 실시예 1-1에서 선별된 미생물 균주들의 알지네이트 분해활성을 측정하기 위하여, 상기 marine broth agar 배지에서 배양하여 보관한 균주를 marine broth 액체배지에 배양한 후, 세포외 활성측정과 세포내 활성측정을 위한 시료를 하기와 같은 방법으로 제조하였다.

상기 세포외 활성측정을 위한 시료는 세포 배양액의 상층액을 분리한 후, 아 세톤을 첨가하고 원심분리를 수행하여 획득한 아세톤 침전물을 사용하였고(M.-H., Joo, D.-S., Cho, S.-Y., and Min, T.-S. Purification and characterization of the extracellular alginase produced by Bacillus licheniformis AL-577, J Korean Soc, Food Sci, Nutr, 35, 231-237(2006)), 상기 세포내 활성측정을 위한 시료는 세포 배양액을 원심분리하여 수득한 세포를 초음파 파쇄하여 얻은 초음파 파쇄액을 사용하였다. 상기 수득한 세포의 초음파 파쇄는 상기 방선균의 특성상 세포가 잘 파쇄되지 아니하므로, 초음파 파쇄기 Vibra Cell 즉, VCX400(Sonics & Materials Inc, USA)을 사용하였으며, 얼음 수조(bath)에서 pulse on 1초, pulse off 9초를 반복하는 방식으로 3분간 수행하였다.

상기 활성측정은 0.4% 알긴산 나트륨과 1% NaCl을 함유한 10 mM 인산 완충용액(pH 7.0)인 기질용액에 상기에서 제조한 시료를 각각 부피를 기준으로 1:1로 혼합하고, 37℃에서 16시간 저장한 후, 소모기-넬슨법(Somogyi-Nelson 법)을 이용하여 환원당을 측정하는 방법으로 수행하였다(Somolgyi, M. and Nelson, N. Notes on sugar determination, J Biol Chem 195, 19-23(1952)).

상기 실시예 1-1녹조류에서 분리한 6종의 균주에서 생장율이 좋고 환원당을 가장 많이 생산하는 균주를 알지네이트 분해활성이 가장 뛰어난 균주로 선택하고 ALG-5로 명명하였다.

상기 ALG-5 균주를 marine broth agar 배지에 배양하였을 때의 균주를 촬영한 사진을 도 4에 나타내었고, 상기 ALG-5 균주를 marine broth 액체배지에 4일간 배양하였을 때의 균주를 촬영한 사진을 도 5에 나타내었다.

<실시예 2> 분리한 알지네이트 분해활성을 가진 균주의 동정

실시예 1-2에서 가장 우수한 알지네이트 분해 활성을 나타내어 최종 선택된 ALG-5 균주를 동정하기 위하여 genomic DNA를 추출하여 하기 표2와 같은 조건으로 PCR을 수행하고 16S rDNA 유전자의 염기서열을 분석을 통하여 동정하였다. 추출한 genomic DNA로부터 16S rDNA 염기서열 분석을 위해 사용한 박테리아 프라이머 쌍에 대하여 표 1에 나타내었다.

Primers	서열 (5'→3')	서열번호
27F	5'-AGA GTT TGA TCM* TGG CTC AG-3'	1
1518R	5'-AAG GAG GTG ATC CAN CCR CA-3'	2

* M=C+A, N=A+C+G+T, R=A+G

PCR 산물의 염기서열을 분석하고자 BigDye terminator cycle sequencing kit와 ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer를 사용하였다. 정열간극(alignment gap)및 염기 위치는 계산에 고려하지 않았다. 16S rDNA 염기서열분석과 관련하여 총 1,520bp 염기서열을 결정하였고, 그 결과로 얻은 염기서열을 도 1 및 서열번호 3에 타나내었다.

결정된 ALG-5 균주의 16S rDNA의 서열분석은 GenBank에 등록된 정보를 대상으로 Blast program(http://www. ncbi.nlm. nih.gov/BLAST/Blast.cgi)에 의해 상동성 검색을 실시하여 실행하였다. 상동성 검색 방법은 상세하게는, Clustal X를 이용하여 multiple sequence와 profile을 배열하고, PHYDIT를 이용하여 2차 구조를 조사하였으며, 계통발생론적 관계를 나타낸 계통도는 Fitch-Margoliash, maximum-likelihood, maximum-parsimony, neighbor-joining algorithms를 이용하여 구성하여 그 결과를 도 2에 나타내었다.

상기 도 2에 나타낸 바와 같이, 분리균주 ALG-5의 16S rRNA 염기서열은 스트렙토마이세스 파르부스(EF063462), 스트렙토마이세스 그리세우스(AB184821), 스트렙토마이세스 칼리포니쿠스(AB184755) 및 스트렙토마이세스 메디올라니(AB184674)의 16S rRNA와 99.7% 상동성을 나타내었고, 스트렙토마이세스 올리바세우스(AB184736) 및 스트렙토마이세스 시아노푸스카투스(AB184860)의 염기서열과는 99.4% 상동성을 나타내었다.

상기 결과로부터는 분리균주 ALG-5가 어느 종에 속하는지 여부를 결정할 수 없어, 상기 균주의 변이부분이 많은 500번 까지의 염기서열로 상동성 검색을 재수행하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.

상기 도 3에 나타낸 바와 같이, 분리균주 ALG-5는 16S rRNA의 일부염기서열만 보고된 해양미생물 스트렙토마이세스 속. BAMI 13 균주의 염기서열(AB181515)과 가장 높은 99.0% (495/500)의 상동성을 나타내었고, 스트렙토마이세스 파르부스(EF063462)의 서열과는 98.4% (492/500)의 상동성을 나타내었으므로(도 3), 분리균주 ALG-5를 스트렙토마이세스 속. ALG-5(Streptomyces sp. ALG-5)로 명명하였다.

<실시예 3> 스트렙토마이세스 속. ALG-5 균주의 특성 확인

스트렙토마이세스 속. ALG-5 균주의 생육조건을 확인하고 이의 배양을 위한 배지조성 및 배양방법의 최적화를 위하여 배지의 온도 및 초기 pH에 따른 생육도 및 효소 생산량을 조사하였다.

상기 생육도 조사를 위한 스트렙토마이세스 속. ALG-5 균주 시료는 상기 marine broth 액체배지에 배양한 상기 실시예 2의 스트렙토마이세스 속. ALG-5 균주를 종배양배지 10ml에 접종하여 30℃에서 72시간동안 종배양(seed culture)을 수행한 다음, 기본배지 150ml에 상기 종배양액 5ml를 접종하여 제조하였다.

상기 종배양배지는 YEME 배지(Yeast extract-Malt extract medium)로, Difco yeast extract 3.0 g, Difco Bacto-peptone 5.0 g, Oxoid malt extract 3.0 g, Glucose 10.0 g, Sucrose 340.0 g을 Distilled water 973.0 ml에 녹여 멸균하여 식힌 후 2.5 M MgCl₂ 용액 2.0 ml를 가하여 제조하여 사용하였으며, 상기 기본배지는 Difco Marine broth 2216을 구입하여 사용하였다.

3-1. 배지의 온도에 따른 생육도

배지의 최적배양온도 범위를 조사하기 위하여, temperature gradient incubator(TVS126MA, Advantec)를 사용하여 스트렙토마이세스 속. ALG-5 균주를 상기 기본배지에 6일 동안 배양하고 생육정도를 측정하였다. 상기 균주의 생육정도의 측정은 동글동글하게 자라는 균주의 특성 때문에, 상기 배양배지를 여과지 위에서 감압여과한 후에, 균의 무게를 측정하는 방법으로 수행하였으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다. 상기 도 6에 나타낸 바와 같이, 20℃ 내지 30℃에서 잘 생육하였으며, 생육최적온도는 30℃이었다.

3-2. 배지의 초기 pH에 따른 생육도

배지의 초기 pH가 분리 균주의 성장에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 상기 기본배지에 완충액의 종류를 바꾸어가면서 배지의 pH를 변경하면서, 스트렙토마이세스 속. ALG-5를 5일동안 배양하였다. 상세하게는, 세포성장의 최적 pH 범위를 알아보기 위해 상기 기본배지에 2-Morpholinoethanesulfonic acid (MES) buffer(pH 4 내지 pH 5), Piperazine-N,N'-bis (2-ethanesulfonic acid) (PIPES) buffer(pH6), N-(2-Hydroxyethyl) piperazine-N'-(2-ethanesulfonic acid) (HEPES) buffer(pH 7), 3-(1,1dimethyl-2hydroxylethyl)-amino-2-hydroxy propanesulfonic acid (AMPSO) buffer(pH 8 내지 9)를 각각 최종농도 20 mM이 되도록 첨가한 배지에 스트렙토마이세스 속. ALG-5을 5일 동안 배양하고, 상기 배양배지를 여과지 위에서 감압여과한 후에, 균주의 무게를 측정하는 방법으로 수행하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다. 상기 도 7에 나타낸 바와 같이, pH 8 내지 pH 9에서 잘 생육하였으며, 생육최적 pH는 pH 8이었다.

3-3. 배양시간에 따른 알지네이트 분해효소의 생산량

스트렙토마이세스 속. ALG-5의 배양시간에 따른 생육도 및 균체성장에 따른 알지네이트 분해효소 생산과의 상관관계를 알아보기 위하여 스트렙토마이세스 속. ALG-5를 상기 기본배지에 접종하여 5일 동안 배양하였다.

배양시간에 따른 생육도를 측정하기 위하여 스트렙토마이세스 속. ALG-5를 상기 기본배지에 5일 동안 배양하였으며, 접종 후 매일 상기 배양배지를 여과지 위에서 감압여과한 후에, 균의 무게를 측정하는 방법으로 수행하였으며, 그 결과를 도 8에 나타내었다.

상기 도 8에 나타낸 바와 같이, 배양 후, 2일까지 대수적으로 균주의 생육도가 증가하였으나, 2일이 경과한 후에는 생육도의 증가폭이 줄어들었으며, 4일이 경과한 후에는 균주의 무게가 증가하지 아니하였다.

한편, 생육도와 효소 생산의 상관관계를 알아보기 위하여, 상기 배양시간을 달리하여 배양한 배양액을 원심 분리하여 상층액을 얻은 후, 상층액에 아세톤을 최종농도 70%가 되도록 가하여 -20℃에서 2시간 유지(incubation)한 다음, 13,000×g의 조건으로 원심분리하였다. 상기 침전물에 증류수를 첨가한 후, 회전감압증류기로 아세톤을 제거하였다. 상기 아세톤을 제거한 각각의 침전물을 각각의 배양시간에 따른 시료액으로부터 제조한 효소액으로 하고, 상기 효소액을 0.2% 소디움 알지네이트 용액을 기질로 하여 37℃ 조건에서 2 시간 동안 반응을 시킨 후 효소활성을 측정하였으며, 그 결과를 도 8에 나타내었다. 보다 상세하게는, 상기 알지네이트 분해효소에 의하여 알지네이트가 분해되면 β-elimination 반응에 의하여 비환원말단에 2중결합이 생기므로, 235 nm에서 흡광도를 측정함으로써 알지네이트 분해효소활성을 측정할 수 있다. 상기 알지네이트 분해효소의 효소활성 1 unit는 235 nm에서 1분에 흡광도를 0.100씩 증가시키는데 필요한 효소양으로 하였다(Matsubara, Y. Kawada, R., Iwasaki, K., Oda, T., and Muramatsu, T. Extracellular poly(α-L-guluronate)lyase from Corynebacterium sp. J Protein Chemistry, 17, 29-36(1998)).

상기 도 8에 나타낸 바와 같이, 배양한 후 4일째 되는 날이 알지네이트 분해효소 활성이 가장 높았으므로, 이하 효소의 활성을 측정하기 위한 실험에는 접종 후, 배양 4일째되는 균주를 효소원으로 사용하였다.

<실시예 4> 스트렙토마이세스 속. ALG-5 균주의 알지네이트 분해효소의 최적반응조건 확인

일반적으로 미생물을 이용한 생촉매에 의한 효소반응에 있어서 기질의 pH와 반응온도가 반응결과에 큰 영향을 미친다. 따라서, 스트렙토마이세스 속. ALG-5가 생성하는 알지네이트 분해효소의 효소반응에 대하여 반응 pH 및 반응온도가 미치는 영향을 확인하고 최적반응조건을 검색하기 위하여 기질의 pH 및 반응온도에 따른 분해효소 활성을 측정하였다.

4-1. 반응 pH에 따른 반응활성

스트렙토마이세스 속. ALG-5 균주가 생산하는 알지네이트 분해효소 활성에 미치는 pH의 영향을 분석하기 위하여 반응용액의 pH를 pH 4.0 내지 pH 9.0까지 변화시키면서 비대칭분할 실험을 수행하였다.

상세하게는 실시예 1의 marine broth 액체배지에 4일간 배양을 행한 배양액을 원심분리하여 얻은 균 팰렛에 10 mM 인산완충용액용액(pH 7.0) 을 가한 다음 초음파 파쇄기로 3분 동안 균을 파쇄하고 13,000×g로 원심분리하여 수득한 상층액을 효소시료로 사용하였다. 상기 효소시료와 0.4% 알지네이트를 포함하는 기질용액을 1:1로 혼합하여 2시간동안 37℃에서 반응시켰으며 pH의 영향을 보기 위하여 상기 기질용액은 알지네이트의 함량을 0.4%가 되게 pH를 pH 4에서 pH 9까지 변화시키면서 완충용액에 용해시켜 멸균시킨 것을 사용하였다. 상기 pH를 변화시킨 기질용액과 효소시료 혼합액을 37℃, 250 rpm의 진탕 배양기에서 1시간동안 반응시킨 후에, 반응 pH와 반응활성의 상관관계를 알아보기 위해 소모기-넬슨법으로 환원당의 함량을 측정하고 235 nm에서 자외선흡광도를 측정하였다. 상기 측정된 값의 최고 값을 100%로 한 상대적인 값 (%)으로 계산하여, 각각의 결과를 도 9에 나타내었다.

상기 도 9에 나타낸 바와 같이, 인산 buffer(pH 5.6 - pH 7)를 사용한 경우에는 pH 6.5에서 활성이 가장 높은 것으로 확인되었고, Tris-HCl buffer(pH 7 내지 9)에서는 pH 7에서 활성이 가장 높은 것으로 확인되었으며, 상기 결과를 종합하면 알지네이트 분해효소는 반응용액의 pH가 pH 5 내지 pH 7에서 높은 활성을 나타내었고, pH 6.5인 경우 가장 높은 분해활성을 나타내었다.

4-2. 반응온도에 따른 효소활성

스트렙토마이세스 속. ALG-5가 생산하는 알지네이트 분해효소 활성에 미치는 온도의 영향을 분석하기 위하여 반응용액의 온도를 10℃ 내지 70℃까지 변화시키면서 알지네이트 분해실험을 수행하여 그 결과를 상대활성으로 나타내었다.

상세하게는 실시예 4-1과 같은 방법으로 제조한 파쇄액을 효소시료로 사용하였고, 상기 효소시료와 0.4% 알지네이트를 포함하는 기질용액을 1:1로 혼합하여 2시간동안 pH 6.5를 유지하며, 온도를 변화시켜 각 온도에서 반응시켰으며, 상기 2시간 반응이 끝난 후 유수에서 반응액을 냉각시키고 효소활성을 측정하였다. 상세하게는, 반응온도와 반응활성의 상관관계를 알아보기 위해 상기 제조한 혼합효소반응액을 소모기-넬슨법으로 환원당의 함량을 측정하고 235 nm에서의 자외선 흡광도를 측정하였다. 상기 측정된 값의 최고 값을 100%로 한 상대적인 값 (%)으로 계산하여, 각각의 결과를 도 10에 나타내었다.

상기 도 10에 나타낸 바와 같이, 상기 알지네이트 분해효소는 20℃ 내지 43℃에서 높은 활성을 나타내었으며, 최적반응온도는 40℃이었고, 육상미생물의 평균적인 배양온도보다 낮은 20℃에서도 최적활성의 80%가 넘는 활성을 나타내었다.
4-4. 알지네이트 분해효소의 기질특이성

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스트렙토마이세스 속. ALG-5 균주가 생산하는 알지네이트 분해효소의 기질특이성을 알아보기 위하여 Haug의 방법(Haug, A., Larsen, B., and Smidsrod, O. Studies on the sequence of uronic acid residues in alginic acid, Acta Chemica Scandinavica 21, 691-704(1968))에 따라 소디움 알지네이트로부터 폴리글루론산 블록(polyguluronate block, pG block), 알지네이트의 폴리만뉴론산 블록(polymannuronate block, pM block), 랜덤 블록(random block, poly mannuronate- guluronate block, poly M-G block / poly G-M block)을 수득하였다. 실시예4-1과 같은 방법으로 제조한 파쇄액을 효소시료로 사용하였고, 동결건조한 각각의 기질을 10 mM 인산완충용액(pH 7.0)에 0.2% 농도로 녹인 다음, 상기 효소시료액과 1:1로 혼합하여 37℃에서 2시간 동안 반응시킨 효소활성을 측정을 상기 235 mm에서 흡광도를 측정하고 소모기-넬슨법(Somogyi-Nelson 법)을 이용하여 수행하였으며, 그 결과를 도 12에 나타내었다.

상기 도 12에 나타낸 바와 같이, 스트렙토마이세스 속. ALG-5 균주가 생산하는 알지네이트 분해효소는 모든 알지네이트 기질에 대하여 활성을 나타내었으나 특히 폴리글루론산 블록에 대하여 효소활성이 높았다.

알지네이트 분해효소는 기질에 따라서 분류하며 폴리만뉴론산에 대한 분해효소는 polymannuronate lyase (EC 4.2.2.3)이며 폴리글루론산 블록에 대한 분해효소는 polyguluronate lyase (EC 4.2.2.11)이라고 분류한다.

스트렙토마이세스 속. ALG-5 균주가 생산하는 알지네이트 분해효소는 상기 도 12에 나타낸 바와 같이, 기질특이성이 넓은 것으로 나타났으며, 폴리글루론산 블록에 대하여 기질특이성이 높은 것으로 확인되었다.

<실시예 5> 스트렙토마이세스 속. ALG-5 균주의 알지네이트 분해효소의 아미노산서열 및 염기서열 결정

스트렙토마이세스 속. ALG-5가 생산하는 알지네이트 분해효소는 효소특성이 다른 알지네이트 분해효소들과는 달랐으며 기질특이성이 넓었으나, 정제하기가 어려웠으므로, 알지네이트 분해효소 생산의 효율성을 높이기 위하여 알지네이트 분해효소를 클로닝하기로 하였다.

스트렙토마이세스 속. ALG-5가 생산하는 알지네이트 분해효소를 클로닝하기위하여 genomic DNA를 추출(Broker, D., Arenskotter, M., Legatzki, A., Nies, D. H., and Steinbuchel A. Characterization of the 101-kilobase-pair megaplasmid pKB1, isolated from the rubber-degrading bacterium Gordonia westfalica Kb1, J. Bacteriol. 186, 212-225(2004))하고 GeneBank에 등록되어 있는 여러 polyguluronate lyase 단백질 또는 polymannuronate lyase 단백질들의 서열들 사이의 상동성을 검색을 한 다음 프라이머(primer)를 제조하여, 상기 스트렙토마이세스 속. ALG-5가 생산하는 알지네이트 분해효소를 클로닝하였다.

상기 스트렙토마이세스 속. ALG-5가 생산하는 알지네이트 분해효소 유전자를 클로닝하고 알지네이트 분해효소 단백질을 발현시키기 위하여 사용된 프라이머는 하기 표 3과 같다. 상기 알지네이트 분해효소 유전자를 얻기 위하여 genomic DNA를 주형으로 하였으며, 5strept-algF(서열번호 6)와 3strept-algR(서열번호 8) 또는 5strept-algMF(서열번호 7)와 3strept-algR(서열번호 8)을 프라이머로 사용하여 하기 표 4와 같은 조건으로 PCR을 행함으로써 유전자를 증폭시켰다. 상기 유전자를 증폭시킨 결과를 0.8% agarose 겔을 이용하여 전기영동한 결과, 800 bp 및 650 bp 정도에서 band를 확인할 수 있었으며, 상기 확인된 DNA를 pGEM-T easy vector에 클로닝한 후 BigDye terminator cycle sequencing kit(Applied Biosystems,. USA)와 ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer(Applied Biosystems,. USA)를 이용하여 염기서열을 결정하였다.

상기 결정된 염기서열로 BlastX을 행한 결과 polyguluronate 분해효소의 단백질서열과 상동성이 있었으므로, 재조합단백질을 얻기 위하여 제한효소자리를 포함한 프라이머를 제작하였다. 상기 프라이머를 하기 표 3에 나타내었으며, 하기 표 3에 표시된 밑줄 그어진 자리는 제한효소자리이다. 상기 제한효소자리를 포함한 프라이머를 사용하여 genomic DNA로부터 알지네이트 분해효소 유전자를 상기와 같은 PCR 조건으로 PCR을 수행하여 증폭시켰으며, 상기 증폭된 유전자를 pGEM-T easy vector(Promega, USA)에 클로닝하여 pGEM-T/ALG-5 #15 클론을 얻었다. 상기 수득한 클론의 염기서열을 SP6 primer와 T7 primer를 이용하여 BigDye terminator cycle sequencing kit(Applied Biosystems,. USA)와 ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer(Applied Biosystems,. USA)를 이용하여 염기서열 결정하였다.

상기 pGEM-T/ALG-5 #15 클론의 DNA를 NdeI 및 HindIII 제한효소로 처리한 다음, 처리한 반응액을 0.8% agarose 겔을 이용하여 전기영동하였고, 상기 전기영동한 결과에서 770 bp의 DNA 조각을 수득하여, 단백질발현 벡터인 pColdI vector에 결합시켜 재조합 벡터를 제조하였고 상기 재조합 벡터를 대장균 DH5α에 형질전환시켰다. 상기 재조합 벡터의 개열지도는 도 16에 나타내었다. 상기 형질전환체를 암피실린(Ampicilline)이 50 ㎍/ml 함유된 LB 고체배지에 도말한 후, 16시간 동안 배양하고, 배양시킨 고체배지 위의 콜로니로부터 플라스미드 DNA(plasmid DNA)를 추출하였다(Kim, H. S., Lee, S. J., Lee, E. J., Hwang, J. W., Park, S., Kim, S. J., and Lee, E. Y. Cloning and characterization of a fish microsomal epoxide hydrolase of Danio rerio and application to kinetic resolution of racemic styrene oxide, J Molecular Catalysis B: Enzymatic 37, 30-35(2005)).

상기 수득한 플라스미드 DNA를 NdeI 및 HindIII 제한효소를 이용하여 처리하고, 제한효소를 처리한 결과물을 전기영동하여, 그 결과를 확인하였으며, 확인된 결과로부터 4.4 kb와 0.8 kb의 band를 가진 클론인 pColdI/ALG-5 #15-26을 수득하였다.

상기 수득한 pCold/ALG5 #15-26 DNA를 발현용 숙주세포인 대장균 BL21(DE3) 균주에 상기와 같은 방법으로 형질전환시키고, 암피실린이 함유된 LB 고체배지에서 도말하여, 16 시간 동안 37℃에서 배양한 후에, positive colony를 얻을 수 있었다.

최종적으로 얻은 스트렙토마이세스 속. ALG-5가 생산하는 알지네이트 분해효소의 유전자의 염기서열 및 단백질 서열을 도 13에 나타내었다. 상기 도 13에 나타낸 바와 같이, 상기 알지네이트 분해효소의 유전자는 777개의 염기로 구성되어 있으며, 258개의 아미노산을 가진 단백질로 계산하면 27.5 kDa으로 번역되지만 pColdI vector가 가지는 His-Tag 포함한 융합단백질로 발현되면 약 29.5 kDa으로 발현된다. 상기 알지네이트 분해효소의 유전자를 서열번호 4 및 도 13에 나타내었고, 상기 알지네이트 분해효소의 아미노산 서열을 서열번호 5 및 도 13에 나타내었다.

상기 스트렙토마이세스 속. ALG-5가 생산하는 알지네이트 분해효소가 대장균에서 효율적으로 발현되었는지 여부를 확인하기 위하여, 클로닝된 상기 유전자를 발현시킨 다음 SDS-PAGE와 면역 검증 실험을 수행하였다.

상세하게는, pColdI vector plasmid 또는 pColdI/ALG-5 #15-26 plasmid가 들어있는 BL21 재조합균주를 각각 암피실린이 함유된 LB배지에 접종하고 37℃ 및 250 rpm의 조건에서 OD₆₀₀ 값이 0.4 내지 0.6이 될 때까지 배양하였다. 상기 배양을 수행한 LB 배지를 반씩 나누어 1군에서는 IPTG를 첨가하지 아니하였고, 다른 군의 경우에는 최종농도가 1mM 되도록 IPTG를 첨가하였다.

상기 IPTG 첨가여부에 따라 구분한 균주를 15℃에서 24시간 배양하여, 단백질발현을 유도하였다. 상기 배양을 수행한 배양액에 대해 원심분리를 수행하여 수득한 세포에 Laemmli buffer를 가하고 95℃에서 5분간 끓인 후에, 12% SDS-polyacrylamide gel에 로딩(loading)하고 전기영동을 수행한 다음, 상기 전기영동을 수행한 gel에 대해 Coomassiee 염색약으로 염색을 수행하고, 면역검증(Western blotting)을 수행하였다(Kim, H. S., Lee, S. J., Lee, E. J., Hwang, J. W., Park, S., Kim, S. J., and Lee, E. Y. Cloning and characterization of a fish microsomal epoxide hydrolase of Danio rerio and application to kinetic resolution of racemic styrene oxide, J Molecular Catalysis B: Enzymatic 37, 30-35(2005)). 상기 면역검증에 사용된 1차 항체는 polyclonal anti-hexahistidine antibody(H-15, Santa Cruz Biotechnology Inc., USA)를 사용하였고, 2차항체는 peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG(Jackson Immunoresearch, USA)를 사용하였으며, 발색시약은 CN/DAB(4-chloronaphthol/3,3'- diaminobenzidine) solution (Pierce, USA)을 사용하였으며, 그 결과를 도 14에 나타내었다. 상기 도 14의 Lane 1번은 ALG-5 균주의 알지네이트 분해효소 유전자가 삽입된 재조합 플라스미드를 IPTG를 첨가하지 아니한 배양액으로부터 배양하여 얻은 시료이고, Lane 2번은 ALG-5 균주의 알지네이트 분해효소 유전자가 삽입된 재조합 플라스미드를 IPTG가 첨가된 배양액으로부터 배양하여 얻은 시료이며, Lane 3번은 발현벡터만을 대장균에 형질전환 시킨 대조군을 IPTG를 첨가하지 아니한 배양액으로부터 배양하여 얻은 시료이고, Lane 4번은 발현벡터만을 대장균에 형질전환 시킨 대조군을 IPTG가 첨가된 배양액으로부터 배양하여 얻은 시료이다.

상기 도 14에 나타낸 바와 같이, 스트렙토마이세스 속. ALG-5가 생산하는 알지네이트 분해효소 유전자를 클로닝하여 발현시킨 다음 SDS-PAGE 및 면역검증을 수행한 결과, 약 29 kDa에서 밴드를 확인할 수 있어, 알지네이트 분해효소가 잘 발현되었음을 확인할 수 있었다.

한편, 상기 pCold/ALG5 #15-26 DNA를 발현용 숙주세포인 대장균 BL21(DE3) 균주에 상기와 같은 방법으로 형질전환시킨 균주를 LB 배지에 접종하고 37℃ 및 250rpm 조건에서 OD₆₀₀ 값이 0.4 내지 0.6이 될 때까지 배양한 후, 상기 배양액에 최종농도가 1mM이 되도록 IPTG를 첨가하고 15℃에서 24시간 배양하여 단백질이 발현되도록 유도하였다. 상기 IPTG를 첨가하여 단백질 발현을 유도시킨 배양액에 대하여 원심분리를 수행하였다. 상기 원심분리에 의하여 분리된 균 팰렛에 10 mM 인산완충용액용액(pH 7.0) 을 가하고 초음파 파쇄기로 2분 동안 균을 파쇄한 후, 13,000×g의 조건으로 원심분리를 수행하였다. 상기 원심분리에 의하여 분리된 상층액을 수득한 후, 상기 수득한 상층액을 효소시료로 사용하여 알지네이트 분해활성을 측정하였다.

상기 효소시료와 0.4% 알지네이트를 포함하는 기질용액(pH 6.5)을 1:1로 혼합하여 37℃, 250 rpm의 진탕 배양기에서 1시간동안 반응시킨 후에, 소모기-넬슨법으로 환원당의 함량을 측정하고 235 nm에서 자외선흡광도를 측정하였다. 상기 측정된 값의 최고 값을 100%로 한 상대적인 값 (%)으로 계산하여, 그 결과를 도 15에 나타내었다.

상기 도 15에 나타낸 바와 같이, 스트렙토마이세스 속. ALG-5가 생산하는 알지네이트 분해효소 유전자를 클로닝하여 발현시킨 다음 알지네이트 분해활성의 측정을 수행한 결과, 발현벡터만을 대장균에 형질전환시킨 경우와 달리, 알지네이트 분해효소 유전자를 함께 클로닝하여 발현시킨 경우는 알지네이트 분해활성이 월등히 높은 것으로 확인되어 재조합 알지네이트 분해효소는 그 활성을 그대로 유지하는 것으로 확인되었다.

프라이머 명명	서열	서열번호
5strept-algF	ATGASYCKCACCCGMAAGCGCRSW	6
5strept-algMF	CMCAGCAGCTCRACCTGACCRACTGGAAGGT	7
3strept-algR	TCAGGAGTGKKTSACCWGCAGCTTGTA	8
5G5-algF(NdeI)	CATATGATGACTCGCACCCGCAAGCGCAC	9
3G5-algR(HindIII)	AAGCTTCAGGAGTGTGTGACCTGCAGCTTG	10

* S=G+C, Y=C+T, K=G+T, M=A+C, R=A+G, W=A+T

본 발명의 알지네이트 분해능을 가진 스트렙토마이세스 속 균주 KCTC 11091BP(Streptomyces sp. KCTC 11091BP)는 육상미생물의 최적 생육온도 보다 낮은 20℃ 내지 30℃에서 잘 생육하므로, 특별한 추가공정 없이 알지네이트 분해에 사용될 수 있고, 본 발명의 균주 즉, 상기 균주 유래 알지네이트 분해효소는 약산성 즉, pH 5 내지 pH 7에서 높은 활성을 나타내어 실제 알지네이트 올리고머의 제조를 위해 사용되는 기질인 알긴산 나트륨을 사용하는 경우, pH 조절을 위한 추가적인 공정없이 알지네이트 올리고머를 생산할 수 있을 뿐만 아니라, 알지네이트의 폴리글루론산 블록(pG block), 알지네이트의 폴리만뉴론산 블록(pM block), 알지네이트의 폴리글루론산-폴리만뉴론산 블록(poly M-G block / poly G-M block) 및 알긴산나트륨(Sodium Alginate)에 대하여 모두 분해활성이 뛰어난 것으로 나타나 기능성 식품재료 또는 의약품재료 등에 쓰일 수 있는 알지네이트 올리고머를 제조하는데 더욱 효율적이어서, 산업적으로 그 가치가 매우 크다 할 것이다.

<110> Silla University Industry-Academic Cooperation foundation KYUNGSUNG UNIVERSITY OFFICE OF INDUSTRY-ACADEMY COOPERATION <120> STREPTOMYCES SP. STRAIN HAVING AN ALGINATE HYDROLYSIS ACTIVITY AND ALGINATE LYASE <130> DPP-2007-0559-KR <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 27F Primer <400> 1 agagtttgat cmtggctcag 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1518R Primer <400> 2 aaggaggtga tccanccrca 20 <210> 3 <211> 1520 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Streptomyces sp. ALG-5 16S rDNA <400> 3 agagtttgat catggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ttaacacatg caagtcgaac 60 gatgaaatca cttcggtggt ggattagtgg cgaacgggtg agtaacacgt gggcaatctg 120 cccttcactc tgggacaagc cctggaaacg gggtctaata ccggatacca ccctgtcccg 180 catgggacgg ggttgaaagc tccggcggtg aaggatgagc ccgcggccta tcagcttgtt 240 ggtggggtaa tggcctacca aggcgacgac gggtagccgg cctgagaggg cgaccggcca 300 cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtgggga atattgcaca 360 atgggcgaaa gcctgatgca gcgacgccgc gtgagggatg acggccttcg ggttgtaaac 420 ctctttcagc agggaagaag cgcaagtgac ggtacctgca gaagaagcgc cggctaacta 480 cgtgccagca gccgcggtaa tacgtagggc gcaagcgttg tccggaatta ttgggcgtaa 540 agagctcgta ggcggcttgt cacgtcggat gtgaaagccc ggggcttaac cccgggtctg 600 cattcgatac gggctagcta gagtgtggta ggggagatcg gaattcctgg tgtagcggtg 660 aaatgcgcag atatcaggag gaacaccggt ggcgaaggcg gatctctggg ccattactga 720 cgctgaggag cgaaagcgtg gggagcgaac aggattagat accctggtag tccacgccgt 780 aaacgttggg aactaggtgt tggcgacatt ccacgtcgtc ggtgccgcag ctaacgcatt 840 aagttccccg cctggggagt acggccgcaa ggctaaaact caaaggaatt gacgggggcc 900 cgcacaagca gcggagcatg tggcttaatt cgacgcaacg cgaagaacct taccaaggct 960 tgacatatac cggaaagcat cagagatggt gccccccttg tggtcggtat acaggtggtg 1020 catggctgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc 1080 cttgttctgt gttgccagca tgcccttcgg ggtgatgggg actcacagga gactgccggg 1140 gtcaactcgg aggaaggtgg ggacgacgtc aagtcatcat gccccttatg tcttgggctg 1200 cacacgtgct acaatggccg gtacaatgag ctgcgatgcc gcgaggcgga gcgaatctca 1260 aaaagccggt ctcagttcgg attggggtct gcaactcgac cccatgaagt cggagttgct 1320 agtaatcgca gatcagcatt gctgcggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc 1380 gtcacgtcac gaaagtcggt aacacccgaa gccggtggcc caaccccttg tgggagggag 1440 ctgtcgaagg tgggactggc gattgggacg aagtcgtaac aaggtagccg taccggaagg 1500 tgcggctgga tcacctcctt 1520 <210> 4 <211> 777 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Alginate ALG-5 polynucleotide <400> 4 atgactcgca cccgcaagcg cactctcgcc accaccggag tggccgcact ctccgccctg 60 gccgccctga ccctcccgct cgtcacgggg ggcaccgcca ccgcggccgc cccgtgcgac 120 taccccgccc agcagctcaa cctgaccaac tggaaggtca ccctgccgac cggctccagc 180 ggctcgccca ccgaggtcaa gcagcccgct ctcgcgacct tctcgtccag gccctggttc 240 acggtgaact ccaagtgcac cggcgtccag ttccggtcgg cggtcaacgc cgtcacgaca 300 cccaactcca gctacggacg cgccgagctg cgcgagatga ccgacaacgg aaccaagaac 360 gcctcctggt cggcgacgtc cggcacccac accatgaccc tccgggaggc gttcaacaag 420 ctgcccaacg acaagccgca cgtcgtcggc gcgcagatcc acgacggcga cgacgtcacc 480 gtcttccgtc tggaaggcac cagcctctac atcaccaagg gcgacaacac ccaccacaag 540 ctggtgacca gcaactacca gctgaacacg gtcttcgagg gcaagttcgt cgtcagcggc 600 ggccagatca aggtgtacta caacggcgtc cttcagacga ccatcgcgca caccgcgtcc 660 gggaactact tcaaggccgg cggctacacc caggccaact gcggcaactc ctccccgtgc 720 agcagctcca actacgggca ggtgaccatc tacaagctgc aggtcacaca ctcctga 777 <210> 5 <211> 258 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alginate ALG-5 polypeptide <400> 5 Met Thr Arg Thr Arg Lys Arg Thr Leu Ala Thr Thr Gly Val Ala Ala 1 5 10 15 Leu Ser Ala Leu Ala Ala Leu Thr Leu Pro Leu Val Thr Gly Gly Thr 20 25 30 Ala Thr Ala Ala Ala Pro Cys Asp Tyr Pro Ala Gln Gln Leu Asn Leu 35 40 45 Thr Asn Trp Lys Val Thr Leu Pro Thr Gly Ser Ser Gly Ser Pro Thr 50 55 60 Glu Val Lys Gln Pro Ala Leu Ala Thr Phe Ser Ser Arg Pro Trp Phe 65 70 75 80 Thr Val Asn Ser Lys Cys Thr Gly Val Gln Phe Arg Ser Ala Val Asn 85 90 95 Ala Val Thr Thr Pro Asn Ser Ser Tyr Gly Arg Ala Glu Leu Arg Glu 100 105 110 Met Thr Asp Asn Gly Thr Lys Asn Ala Ser Trp Ser Ala Thr Ser Gly 115 120 125 Thr His Thr Met Thr Leu Arg Glu Ala Phe Asn Lys Leu Pro Asn Asp 130 135 140 Lys Pro His Val Val Gly Ala Gln Ile His Asp Gly Asp Asp Val Thr 145 150 155 160 Val Phe Arg Leu Glu Gly Thr Ser Leu Tyr Ile Thr Lys Gly Asp Asn 165 170 175 Thr His His Lys Leu Val Thr Ser Asn Tyr Gln Leu Asn Thr Val Phe 180 185 190 Glu Gly Lys Phe Val Val Ser Gly Gly Gln Ile Lys Val Tyr Tyr Asn 195 200 205 Gly Val Leu Gln Thr Thr Ile Ala His Thr Ala Ser Gly Asn Tyr Phe 210 215 220 Lys Ala Gly Gly Tyr Thr Gln Ala Asn Cys Gly Asn Ser Ser Pro Cys 225 230 235 240 Ser Ser Ser Asn Tyr Gly Gln Val Thr Ile Tyr Lys Leu Gln Val Thr 245 250 255 His Ser <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5strept-algF Primer <400> 6 atgasyckca cccgmaagcg crsw 24 <210> 7 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5strept-algMF Primer <400> 7 cmcagcagct cracctgacc ractggaagg t 31 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3strept-algR Primer <400> 8 tcaggagtgk ktsaccwgca gcttgta 27 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5G5-algF(NdeI) Primer <400> 9 catatgatga ctcgcacccg caagcgcac 29 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3G5-algR(HindIII) Primer <400> 10 aagcttcagg agtgtgtgac ctgcagcttg 30

Claims (9)

1. 삭제
2. 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 알지네이트 분해효소(alginate lyase).
3. 제2항에 있어서, 상기 분해효소는 서열번호 4에 기재된 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 아미노산 서열로 이루어지는 알지네이트 분해효소(alginate lyase).
4. 삭제
5. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 분해효소는 작용 온도가 20℃ 내지 43℃이고, 작용 pH가 pH 5 내지 pH 7인 알지네이트 분해효소(alginate lyase).
6. 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열을 암호화하는 유전자서열로 이루어지는 알지네이트 분해효소(alginate lyase)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
7. 제6항에 있어서, 상기 유전자서열은 서열번호 4에 기재된 폴리뉴클레오타이드로 이루어지는 알지네이트 분해효소(alginate lyase)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
8. 제6항 또는 제7항에 따른 알지네이트 분해효소(alginate lyase)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 대장균에 도입시켜 형질전환된 대장균.
9. 삭제

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