CN114480182B

CN114480182B - 一种假节杆菌pl-410及其在产软骨素裂解酶中的应用

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Publication number: CN114480182B
Application number: CN202210022096.6A
Authority: CN
Inventors: 尚楠; 肖梦圆; 武瑞赟; 李平兰
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2022-01-10
Filing date: 2022-01-10
Publication date: 2023-10-31
Anticipated expiration: 2042-01-10
Also published as: CN114480182A

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种假节杆菌PL‑410及其在产软骨素裂解酶中的应用。本发明提供的假节杆菌(Pseudarthrobacter sp.)PL‑410，其保藏编号为CGMCC No.22736。本发明的假节杆菌(Pseudarthrobacter sp.)PL‑410，其可以制备软骨素裂解酶(AC型)，该酶可用于研究硫酸软骨素的结构，构建硫酸软骨素寡糖文库，也可应用于医药领域，具有广阔的应用前景。

Description

一种假节杆菌PL-410及其在产软骨素裂解酶中的应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种假节杆菌PL-410及其在产软骨素裂解酶中的应用。

背景技术

硫酸软骨素(chondroitin sulfate，CS)是一类从动物组织中提取出的糖胺聚糖，广泛存在于脊椎动物结缔组织的细胞表面和细胞外基质中，具有多种生物活性，如修复关节软骨、抗氧化、延缓衰老、抗凝血、抗血栓、降血脂、抗动脉粥状硬化及抗肿瘤等，广泛应用于医药、食品和化妆品行业。常见的CS具有高分子量和高电荷密度，从而导致其生物利用率较低，限制了其生物功效的发挥。越来越多的证据表明，低分子量CS具有黏度小、溶解性好、易吸收等优点，可有效克服CS生物利用率低的缺点。

目前，低分子量CS主要通过酸降解法、氧化降解法、超声降解法、辐射降解法以及酶降解法获得。其中，酶降解法具有反应条件温和、催化效率高、操作简单、作用底物专一、产物分子量可控性高、过程无污染、对CS的降解产物影响小的优点，因此具有更高的性价比和优势。

细菌来源的软骨素裂解酶(chondroitinase，Chase)是一类可降解CS等糖胺聚糖的裂解酶，作用于CS二糖单位之间的β-1,4糖苷键，通过β-消除的方式将CS裂解为不饱和二糖及寡糖，并在产物的非还原端形成4,5-不饱和糖醛酸。Chase降解CS等糖胺聚糖，生成二糖及寡糖，不仅用于高效制备具有多种生物活性的CS低聚糖；还可作为工具酶，用于构建二糖和寡糖的文库，研究糖胺聚糖的结构和性质；还可用于检测药物及各种组织中CS的含量；此外，Chase可特异性地降解硫酸软骨素蛋白聚糖，从而使硫酸软骨素蛋白聚糖恢复正常水平，机体恢复正常功能，调节机体中硫酸软骨素蛋白聚糖含量，减少脊髓损伤、腰椎间盘突出、弱视等疾病的发生，在医学领域具有广泛的应用价值。

综上所述，软骨素裂解酶不仅可以用于制备高活性的低分子量硫酸软骨素，还可作为研究糖胺聚糖结构和性质的工具酶，最重要的是，其本身具有多种药用价值，可以在疾病治疗中发挥独特的作用。但目前具有应用价值的高活力软骨素裂解酶很少，因此筛选新型软骨素裂解酶产生菌，并分离和鉴定新型稳定高活力的软骨素裂解酶具有重要意义。鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的是提供一种可以制备软骨素裂解酶的假节杆菌。该酶可降解硫酸软骨素A和C，是一类软骨素裂解酶AC型。

为了实现本发明的目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供的假节杆菌(Pseudarthrobacter sp.)PL-410，该菌株于2021年6月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为假节杆菌Pseudarthrobacter sp.，保藏编号为CGMCC No.22736。

进一步地，本发明还提供假节杆菌(Pseudarthrobacter sp.)PL-410的发酵产物。含有假节杆菌(Pseudarthrobacter sp.)PL-410或发酵产物的菌剂。

本发明所述的菌剂可以为液体菌剂或固体菌剂，可采用常规技术手段、加入微生物制剂领域允许的辅料制备得到。

本发明通过实验证明，假节杆菌(Pseudarthrobacter sp.)PL-410可以高效制备软骨素裂解酶(AC型)，基于此，本发明还提供一种糖胺聚糖或硫酸软骨素蛋白聚糖的降解剂，其含有假节杆菌(Pseudarthrobacter sp.)PL-410或上述发酵产物或菌剂，或由假节杆菌(Pseudarthrobacter sp.)PL-410制备得到。

具体地，由假节杆菌(Pseudarthrobacter sp.)PL-410经发酵得到的发酵产物制备得到。

优选，所述糖胺聚糖为硫酸软骨素。

本发明还提供一种构建二糖和寡糖文库的方法，其包括以上述假节杆菌(Pseudarthrobacter sp.)PL-410进行发酵生产软骨素裂解酶的步骤。

上述假节杆菌(Pseudarthrobacter sp.)PL-410生产的软骨素裂解酶可作为工具酶，用于构建二糖和寡糖的文库，研究糖胺聚糖的结构和性质。

本发明还提供一种生产软骨素裂解酶的方法，其包括以上述假节杆菌(Pseudarthrobacter sp.)PL-410进行发酵的步骤。

所述发酵的条件为：接种量为2×10⁶～4×10⁶CFU/mL，发酵温度为23～32℃，转速为160～220rpm；

和/或，所述发酵的培养基每升包括：硫酸软骨素7-8g，胰蛋白胨2-3g，NaCl 4.5-5.5g，KH₂PO₄ 0.25-0.35g，pH值为6-7。

以本发明的发酵培养基和条件进行假节杆菌(Pseudarthrobacter sp.)PL-410的培养，可获得更高的软骨素裂解酶的活力。

本发明另提供一种软骨素裂解酶，其由上述的假节杆菌(Pseudarthrobactersp.)PL-410发酵获得。

所述的软骨素裂解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；和/或，编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明另提供上述假节杆菌(Pseudarthrobacter sp.)PL-410或发酵产物或菌剂在以下任一方面中的应用：

(1)生产软骨素裂解酶；

(2)制备糖胺聚糖降解剂；

(3)制备硫酸软骨素蛋白聚糖降解剂；

(4)构建二糖和寡糖文库；

(5)制备低分子量的硫酸软骨素；

(6)检测硫酸软骨素的含量；

(7)制备可治疗脊髓损伤、腰椎间盘突出和弱视的产品；

或，上述软骨素裂解酶在上述(2)-(7)方面中的应用。

所述低分子量的硫酸软骨素的分子量小于10000。

本发明的有益效果在于：

本发明提供一株假节杆菌(Pseudarthrobacter sp.)PL-410，其可以制备软骨素裂解酶(AC型)，该酶对硫酸软骨素A的比活为206IU/mg，对硫酸软骨素C的比活为224IU/mg，可用于研究硫酸软骨素的结构，构建硫酸软骨素寡糖文库，也可应用于医药领域，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例1中假节杆菌(Pseudarthrobacter sp.)PL-410的菌落形态照片。

图2为本发明实施例1中假节杆菌(Pseudarthrobacter sp.)PL-410的革兰氏染色后镜检图。

图3为本发明实施例2中假节杆菌(Pseudarthrobacter sp.)PL-410的生长曲线。

图4为本发明实施例3中假节杆菌(Pseudarthrobacter sp.)PL-410的BLASTp在线分析结果。

图5为本发明实施例3中假节杆菌(Pseudarthrobacter sp.)PL-410的信号肽的预测结果。

图6为本发明实施例3中假节杆菌(Pseudarthrobacter sp.)PL-410的三维结构模型。

图7为本发明实施例4中假节杆菌(Pseudarthrobacter sp.)PL-410生产的软骨素裂解酶的纯度检测结果。

图8为本发明实施例5中软骨素裂解酶对不同底物的相对酶活检测结果。图中柱状图上的字母不同，代表在显著性水平α＝0.05下比较，差异显著。

图9为本发明实施例5中不同pH的缓冲体系中，软骨素裂解酶的相对酶活测定结果。图中不同小写字母，代表在显著性水平α＝0.05下比较，差异显著。

图10为本发明实施例5中不同温度下，软骨素裂解酶的相对酶活测定结果。图中不同小写字母，代表在显著性水平α＝0.05下比较，差异显著。

图11为本发明实施例5中不同的金属离子对软骨素裂解酶的酶活力影响结果。图中柱状图上的字母不同，代表在显著性水平α＝0.05下比较，差异显著。

图12为本发明实施例5中不同底物(硫酸软骨素A)浓度时软骨素裂解酶的酶活力结果。

图13为本发明实施例5中不同底物(硫酸软骨素C)浓度时软骨素裂解酶的酶活力结果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1本发明假节杆菌(Pseudarthrobacter sp.)的获得

取土壤少许于锥形瓶中，加入9mL无菌生理盐水，充分振荡，吸取1mL上清液于富集培养基中，30℃、200rpm振荡培养18h，获得富集菌液。取1mL富集菌液，梯度稀释至10^-6浓度，取合适浓度梯度的菌液均匀涂布于分离培养基，30℃培养3d，挑取不同形态的菌落进行划线纯化，得到单菌落。将单菌落点种到初筛培养基上，30℃培养3d后，向初筛培养基加入5mL2mol/L的醋酸溶液，浸没5min，观察有无透明圈产生，挑取有透明圈产生的菌株进行复筛。将有透明圈产生的菌株分别接种到复筛培养基，30℃振荡培养，每隔12h测定发酵上清液中软骨素降解酶的活力，将发酵上清液中软骨素裂解酶活力(针对硫酸软骨素A)最高的菌株挑取到LB培养基上培养，并保种记为PL-410。

所述PL-410菌株在LB固体培养基30℃培养3d后，形成直径1～2mm的圆形菌落，菌落中心凸起、表面光滑、边缘较规则、不透明，呈乳白色，如图1所示。对PL-410菌株进行革兰氏染色观察，发现其为革兰氏阳性菌，菌体呈细长、不规则的杆状，单个或成对，多呈现直线和V字形排列，如图2所示。经16S rRNA鉴定，PL-410菌株为假节杆菌(Pseudarthrobactersp.)，其16S rRNA的基因序列见SEQ ID NO.1。

①上述富集培养基每升组分如下：

(NH₄)₂SO₄ 10g，NaCl 5g，KH₂PO₄ 0.3g，硫酸软骨素5g，余量为去离子水，pH值为7.0。

②上述分离培养基每升组分如下：

(NH₄)₂SO₄ 10g，NaCl 5g，KH₂PO₄ 0.3g，硫酸软骨素5g，琼脂25g，余量为去离子水，pH值为7.0。

③上述初筛培养基每升组分如下：

(NH₄)₂SO₄ 10g，NaCl 5g，KH₂PO₄ 0.3g，硫酸软骨素5g，牛血清白蛋白组分V10g，琼脂25g，余量为去离子水，pH值为7.0。

④上述复筛培养基每升组分如下：

NaCl 5g，KH₂PO₄ 0.3g，MgSO₄ 2g，硫酸软骨素5g，酵母浸粉10g，余量为去离子水，pH值为7.0。

⑤上述软骨素裂解酶活力测定的方法如下：

取1mL发酵液，4℃、8000rpm离心5min，取发酵上清液。吸取0.02mol/L Tris-HCl(pH7.5)3.9mL和0.2％硫酸软骨素A溶液(0.02mol/L Tris-HCl配制，pH7.5)4mL于试管中，37℃保温10分钟，吸取发酵上清液0.1mL加入到反应体系中，37℃水浴反应20min后，立即于沸水中煮沸5min，然后在冷水中冷却10min，232nm下测定其吸光值A。对照组：发酵上清液煮沸5min后，在冷水中冷却，吸取灭活的发酵上清液0.1mL加入到反应体系中，37℃水浴反应20min后，立即于沸水中煮沸5min，然后在冷水中冷却10min，232nm下测定其吸光值A₀。

软骨素降解酶酶活力单位计算公式：

ε：毫摩尔消光系数，单位为L/(mmol·cm)，ΔD_i-4S的毫摩尔消光系数为5.1，ΔD_i-6S的毫摩尔消光系数为5.5；

d：所用石英比色皿的厚度，一般为1cm；

t：酶促反应时间，此处为20min；

V_t：酶促反应的总体积，此处为8mL；

V_s：酶促反应体系中添加的粗酶液体积，此处为0.1mL。

软骨素降解酶酶活力单位定义：37℃条件下，每分钟降解硫酸软骨素产生1μmol的不饱和二糖所需的酶量。

实施例2本发明假节杆菌的培养

挑取假节杆菌PL-410菌株接种至液体培养基中，26℃、200rpm振荡培养过夜，制得种子液。吸取种子液，以1％的体积百分比接种于液体培养基中，26℃、200rpm振荡培养，其生长曲线如图3所示，菌种在6h后进入对数生长期，28～44h为稳定期，44h后进入衰亡期。

上述液体培养基每升组分如下：

胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，NaCl 10g，余量为去离子水，pH值为7.2。

实施例3本发明假节杆菌全基因组测序及其序列分析

按照实施例2所述的培养方法，培养PL-410菌株18h，取菌液1L，10000rpm离心10min，收集菌体沉淀，由北京希望组生物科技有限公司对假节杆菌PL-410的全基因组DNA进行测序。用NCBI(National Center for Biotechnology Information)网站的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)对测序结果进行分析，NCBI分析结果显示假节杆菌PL-410基因组上携带一个软骨素裂解酶基因l410，基因l410的编码区长2397bp，核苷酸序列见SEQ ID NO.2。基因l410所编码的软骨素裂解酶L410共含有798个氨基酸，其氨基酸序列见SEQ ID NO.3。

用NCBI网站的BLASTp在线分析，结果显示，NCBI数据库中已鉴定的蛋白，与软骨素裂解酶L410的氨基酸序列相似性最大的是来源于Paenarthrobacter aurescens的软骨素裂解酶AC(PDB ID：1RWA_A)，相似性为67.86％。BLASTp分析结果还显示软骨素裂解酶L410内部含有糖胺聚糖裂解酶超级家族中保守的假定催化结构域，同时含有多糖裂解酶8家族(PL8)的保守结构域，如图4所示。利用在线工具ExPASy的ProtParam tool(https://web.expasy.org/protparam/)分析，软骨素裂解酶L410的理论分子量约为85.28kDa，理论等电点pI约为5.98。利用在线工具SigalP-5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)进行信号肽的预测，结果显示软骨素裂解酶L410含有信号肽(TAT信号肽)，可能性为0.8929，信号肽剪切位点在第34个氨基酸和第35个氨基酸之间，如图5所示，表明软骨素裂解酶L410为分泌型蛋白。利用SWISS-MODEL同源建模服务器(https://swissmodel.expasy.org)对软骨素裂解酶L410的蛋白质三维结构进行同源建模，最终得到的软骨素裂解酶L410三维结构模型如图6所示。

实施例4本发明假节杆菌在制备软骨素裂解酶中的应用

挑取假节杆菌PL-410菌落，接种至种子培养基中，26℃、200rpm振荡培养至菌体数约为10⁸CFU/mL，制得种子液。

取种子液，按2.98％的体积百分比接种于发酵培养基中，在温度为24℃，摇瓶装液量为8％的体积百分比和摇床转速为160rpm的条件下，发酵27.63h，制得假节杆菌PL-410发酵液，测得发酵液中软骨素裂解酶的活力(针对硫酸软骨素A)为2532IU/L。

取假节杆菌PL-410发酵液，于4℃、10000rpm离心10min，弃沉淀取上清液，获得软骨素裂解酶粗酶液。利用5kDa截留分子量的超滤膜对发酵上清液进行超滤浓缩，获得浓缩液。利用DEAE-琼脂糖凝胶FF阴离子交换层析(1cm×30cm)对浓缩液进行分离纯化，上样量为4mL，用20mmol/L Tris-HCl溶液(pH7.5，含0～0.5mol/L NaCl)进行梯度洗脱，洗脱速度为2mL/min，设置紫外检测器波长为280nm，收集蛋白峰，测定每个蛋白峰的软骨素裂解酶活力，收集有酶活力的组分。将上述有酶活力的组分利用5kDa截留分子量的超滤膜进行超滤浓缩，浓缩液上样到葡聚糖G-100凝胶层析(16cm×60cm)，上样量为6mL，洗脱液为20mmol/LTris-HCl溶液(pH7.5)，洗脱速度为0.44mL/min，设置紫外检测器波长为280nm，收集蛋白峰，测定每个蛋白峰的软骨素裂解酶活力，收集有酶活力的组分。将上述有酶活力的组分利用5kDa截留分子量的超滤膜进行超滤浓缩，制得软骨素裂解酶纯品，用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测软骨素裂解酶的纯度，结果如图7所示，软骨素裂解酶在电泳胶上呈单一条带，且位置与预测的分子量相吻合。软骨素裂解酶的纯化效果如表1所示，纯化后的软骨素裂解酶对硫酸软骨素A的比酶活为206.0973IU/mg，收率为22.491％。

表1软骨素裂解酶的纯化效果

上述种子培养基每升组分如下：

上述发酵培养基每升组分如下：

硫酸软骨素7.5g，胰蛋白胨2.5g，NaCl 5g，KH₂PO₄ 0.3g，余量为去离子水，pH值为6.53。

软骨素裂解酶活力测定的方法同实施例1。

对比例1本发明假节杆菌的发酵

取种子液，按1％的体积百分比接种于发酵培养基中，在温度为30℃，摇瓶装液量为20％的体积百分比和摇床转速为160rpm的条件下，发酵24h，制得假节杆菌PL-410发酵液，测得发酵液中软骨素裂解酶的活力(针对硫酸软骨素A)为224IU/L。

上述种子培养基每升组分如下：

上述发酵培养基每升组分如下：

硫酸软骨素5g，胰蛋白胨5g，NaCl 5g，KH₂PO₄ 0.3g，余量为去离子水，pH值为7.0。

软骨素裂解酶活力测定的方法同实施例1。

实施例5本发明假节杆菌PL-410生产的软骨素裂解酶的酶学性质

1、软骨素裂解酶的底物特异性

以硫酸软骨素A、硫酸软骨素B、硫酸软骨素C、透明质酸(HA)和硫酸乙酰肝素(HS)为底物，用20mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.5)配制2mg/mL的底物溶液，称取纯化之后的软骨素裂解酶，用20mmol/L Tris-HCl溶液(pH7.5)配制适宜酶活力的Chase溶液。按照实施例1所述的酶活力测定方法，软骨素裂解酶可特异性降解硫酸软骨素A、硫酸软骨素C和透明质酸，对硫酸软骨素A的比活为206IU/mg，对硫酸软骨素C的比活为224IU/mg，对透明质酸的比活为68IU/mg，不能降解硫酸软骨素B和硫酸乙酰肝素，表明该软骨素裂解酶为AC型。计算软骨素裂解酶对不同底物的相对酶活(以对硫酸软骨素C的比活为100％计)，结果如图8所示。

2、软骨素裂解酶的最适催化pH

配制不同pH的缓冲体系(浓度为20mmol/L)，柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲体系(pH4.0、5.0、6.0)，磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲体系(pH6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)、Tris-HCl缓冲体系(pH7.5、8.0、8.5、9.0)，利用不同pH的缓冲体系配制2mg/mL的硫酸软骨素A溶液。按照实施例1所述的酶活力测定方法，以硫酸软骨素A为底物，在不同pH的缓冲体系中，测定软骨素裂解酶的相对酶活。结果如图9所示，在pH值为7.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲体系中，软骨素裂解酶的相对酶活最高，因此软骨素裂解酶催化硫酸软骨素A的最适pH为7.0。

3、软骨素裂解酶的最适催化温度

配制浓度为20mmol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH7.0)，利用该缓冲液配制2mg/mL的硫酸软骨素A溶液，按照实施例1所述的酶活力测定方法，以硫酸软骨素A为底物，在不同温度(20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、42℃、45℃、50℃、55℃)下测定软骨素裂解酶的相对酶活。结果如图10所示，当温度为40℃时，软骨素裂解酶对硫酸软骨素A的催化活性最高，其最适催化温度为40℃。

4、金属离子对软骨素裂解酶酶活力的影响

配制浓度为20mmol/L的Tris-HCl缓冲液(pH7.5)，利用该缓冲液分别配制2mg/mL的硫酸软骨素A溶液和100mmol/L的金属离子溶液(Li⁺、K⁺、Na⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、Mg²⁺、Fe³⁺)。按照实施例1所述的酶活力测定方法，以硫酸软骨素A为底物，分别向催化体系中加入不同的金属离子溶液，使其终浓度为1mmol/L，测定金属离子对软骨素裂解酶酶活力的影响。结果如图11所示，Mn²⁺、Fe³⁺、Cu²⁺和Mg²⁺显著抑制软骨素裂解酶的酶活力，特别是Fe³⁺，抑制作用最强，Na⁺、K⁺、Li⁺和Ca²⁺对软骨素裂解酶的酶活力没有显著影响。

5、软骨素裂解酶的动力学参数

配制浓度为20mmol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH7.0)，利用该缓冲液配制不同浓度(0.1、0.2、0.4、1、1.6、2、3、4、5、6mg/mL)的硫酸软骨素A溶液和硫酸软骨素C溶液。按照实施例1所述的酶活力测定方法，底物溶液终浓度为0.05、0.1、0.2、0.5、0.8、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/mL，测定不同底物浓度时软骨素裂解酶的酶活力。以反应速率的倒数为纵坐标，底物浓度的倒数为横坐标，采用Linewaeaver-Burk双倒数作图法测定米氏常数(K_m)和最大反应速率(V_max)。结果如图12和图13所示，底物为硫酸软骨素A时，软骨素裂解酶的双倒数方程为y＝0.2462x+5.9412；底物为硫酸软骨素C时，软骨素裂解酶的双倒数方程为y＝0.456x+3.656。软骨素裂解酶对硫酸软骨素A和硫酸软骨素C的米氏常数K_m值分别为0.0414mg/mL和0.125mg/mL，最大反应速率V_max分别为0.168μmol/(min·mL)和0.274μmol/(min·mL)。软骨素裂解酶对硫酸软骨素A的亲和能力高于硫酸软骨素C。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 一种假节杆菌PL-410及其在产软骨素裂解酶中的应用

<130> KHP211123349.6

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1486

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agagtttgat cctggctcag gatgaacgct ggcggcgtgc ttaacacatg caagtcgaac 60

gatgacctgg tgcttgcact ggtgattagt ggcgaacggg tgagtaacac gtgagtaacc 120

tgcccttgac tctgggataa gcctgggaaa ctgggtctaa taccggatat gactcctcat 180

cgcatggtgg ggggtggaaa gctttttgtg gttttggatg gactcgcggc ctatcagctt 240

gttggtgagg taatggctca ccaaggcgac gacgggtagc cggcctgaga gggtgaccgg 300

ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag gcagcagtgg ggaatattgc 360

acaatgggcg aaagcctgat gcagcgacgc cgcgtgaggg atgacggcct tcgggttgta 420

aacctctttc agtagggaag aagcgaaagt gacggtacct gcagaagaag cgccggctaa 480

ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag ggcgcaagcg ttatccggaa ttattgggcg 540

taaagagctc gtaggcggtt tgtcgcgtct gccgtgaaag tccggggctc aactccggat 600

ctgcggtggg tacgggcaga ctagagtgat gtaggggaga ctggaattcc tggtgtagcg 660

gtgaaatgcg cagatatcag gaggaacacc gatggcgaag gcaggtctct gggcattaac 720

tgacgctgag gagcgaaagc atggggagcg aacaggatta gataccctgg tagtccatgc 780

cgtaaacgtt gggcactagg tgtgggggac attccacgtt ttccgcgccg tagctaacgc 840

attaagtgcc ccgcctgggg agtacggccg caaggctaaa actcaaagga attgacgggg 900

gcccgcacaa gcggcggagc atgcggatta attcgatgca acgcgaagaa ccttaccaag 960

gcttgacatg gactggaaat acctggaaac aggtgccccg cttgcggtcg gttcacaggt 1020

ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc 1080

aaccctcgtt ctatgttgcc agcgcgttat ggcggggact cataggagac tgccggggtc 1140

aactcggagg aaggtgggga cgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgtct tgggcttcac 1200

gcatgctaca atggccggta caaagggttg cgatactgtg aggtggagct aatcccaaaa 1260

agccggtctc agttcggatt ggggtctgca actcgacccc atgaagtcgg agtcgctagt 1320

aatcgcagat cagcaacgct gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc 1380

aagtcacgaa agttggtaac acccgaagcc ggtggcctaa ccccttgtgg gagggagctg 1440

tcgaaggtgg gactggcgat tgggactaag tcgtaacaag gtaacc 1486

<210> 2

<211> 2397

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgatgaccc aagaattttc ccggagatct gcccttaagg gcgcaggagc tgcggcgctg 60

tcgggcctgc tcgtgtcttt ctttcatggg ccggcccatg cgggcgaggc ttcggaggcg 120

gttctttccc cgtcggagtt tgctggtcta aggaaaaagt gggttgatca gatcacgggt 180

agacagacga tcgtggccgg tgacactgac ttcgtcaagg ccttggccac gctggataag 240

agggcacgga cagcgattga tctgctcgac cattctgcag gccgtgccac agtgttctcc 300

gatctcagcc ttggcaagga tgctgatctg gttaccacgc atacgcggct ggcaaccttg 360

gcgacggcat gggccacacc cgggtctgca cactatgaag ataaaggcct gctggccgct 420

atccgggccg gcctcgccga tgcgaactcc ctttgctaca acgagacgaa ggaagaacag 480

ggaaattggt ggtcgtggga gatcggcaca cccaaggccc tggcggacac tatggtgttg 540

cttcatgcgg aattgactgt ggctgagcgg acggcatact gcgccgctat cgaccacttt 600

gtcccggacc cgtggcagca gtttccgccg aaacgcggaa agatcacctc cgttggggca 660

aaccgtgtgg atctctgcca ggcgatcatt atccgctcgc tggtggatga caacccggag 720

aaactaagcc acgccgtcgc gggtctcagc gacgtgtggc aatacgtctc ctccgggaat 780

ggtttcttca ccgacggttc cttcattcag cacagcacca ctccttacac tgggtcctac 840

ggtgtggtct tgttgaccgg attgtccaaa ctctttgccc tactgggcgg gaccggggca 900

gaagtggcgg accccagccg cgacatcctg ttcaaaacag ttgaaggttc ttttgcgccg 960

ttcatggttg ctggtgccat ggcggattcg gtccgtggca ggagtatcag cagggaagcc 1020

aacacgggct ttgaccttgg tgcaagtacc accgaatcga ttttgcttct cgcccgtgcc 1080

gttgaccccg cgaccgcggg acggtggcgg agcctgtgcc aggcctggat cgccaagaac 1140

tctcacgccc cgatcctcga gggtgccagc gttcccagga ccgctcttat caaagagctg 1200

tttgccatgg aacccacacc atcagatctt ccgcgcggcc actatctgtt tcccgccatg 1260

gaccgcacca tgcaccacaa tcagggctgg atcctgtcca ctgcgatggc cagtaaccgc 1320

atcgcatggt atgagtgcgg aaacggcgag aacaaccgcg gttaccatac gggttcagga 1380

atgacttaca tctacgacgc ggatcttgcc cagtacgacg acgcgtactg ggccaccgcg 1440

aattactgcc gtctccctgg catcaccgtg gacacgaccc ccttgcccga taaggcggag 1500

ggtgagtggg gtgcggccac acctgcgaat gaatggaccg gtgccgcagc atatgacgaa 1560

gttgcagtgg tgggggagca ccttatcggc cctggaggaa caggtctaca ggccagaaaa 1620

tcgtggtttg tcagccatga cgtgatggtg tgtctcggtt cggacatcag tactgcctcg 1680

ggctcggtga tcgaaacagt cgtcgatcac cgaaaccttc acggcggctc gaacgcgatg 1740

aggacggctg cagggaccat cgcgggcacc atcggcagca acgacgtcct gacgggtgac 1800

cggtgggtcc accttgaggg attcggaggt tacatcgtgc tggatgcttc gccgctacac 1860

gtgatgcggg agcaacgaac ggggtcatgg gcagaggtta acgcgaaggg cagcacagcc 1920

aggaagaccc ggaactatgc cactctctat ttcactcacg gacagggcgg cgaacgggcg 1980

tcgtacgcct accttgtggc tcccggggca tcggtccaca ggacatccgc actgtcagga 2040

cagtccttcc acgtggtcct ccggaacgac gaagtggcgc aggctgtccg gttcaagaag 2100

gagaagacga cggcagccac attctggcgg ccgggagccg tgggggacct gtcagtgtcc 2160

ggtcccgcct gcgtggtcat cagggatgcc ggcgacaggc tcagtattgc tgtcagcgac 2220

ccgactcagg ctgcccccca actctcattg aggctgagga ccaaacggag ttaccggatt 2280

gtagaaggcc aaggtgcttc cctttttcag gaaccaggtg gcttcatcac tctttccgtg 2340

gacacggcgg gccgcgctgg ggtgtcgatg cagttcgaac tgtccgccga ggaatag 2397

<210> 3

<211> 798

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Met Thr Gln Glu Phe Ser Arg Arg Ser Ala Leu Lys Gly Ala Gly

1 5 10 15

Ala Ala Ala Leu Ser Gly Leu Leu Val Ser Phe Phe His Gly Pro Ala

20 25 30

His Ala Gly Glu Ala Ser Glu Ala Val Leu Ser Pro Ser Glu Phe Ala

35 40 45

Gly Leu Arg Lys Lys Trp Val Asp Gln Ile Thr Gly Arg Gln Thr Ile

50 55 60

Val Ala Gly Asp Thr Asp Phe Val Lys Ala Leu Ala Thr Leu Asp Lys

65 70 75 80

Arg Ala Arg Thr Ala Ile Asp Leu Leu Asp His Ser Ala Gly Arg Ala

85 90 95

Thr Val Phe Ser Asp Leu Ser Leu Gly Lys Asp Ala Asp Leu Val Thr

100 105 110

Thr His Thr Arg Leu Ala Thr Leu Ala Thr Ala Trp Ala Thr Pro Gly

115 120 125

Ser Ala His Tyr Glu Asp Lys Gly Leu Leu Ala Ala Ile Arg Ala Gly

130 135 140

Leu Ala Asp Ala Asn Ser Leu Cys Tyr Asn Glu Thr Lys Glu Glu Gln

145 150 155 160

Gly Asn Trp Trp Ser Trp Glu Ile Gly Thr Pro Lys Ala Leu Ala Asp

165 170 175

Thr Met Val Leu Leu His Ala Glu Leu Thr Val Ala Glu Arg Thr Ala

180 185 190

Tyr Cys Ala Ala Ile Asp His Phe Val Pro Asp Pro Trp Gln Gln Phe

195 200 205

Pro Pro Lys Arg Gly Lys Ile Thr Ser Val Gly Ala Asn Arg Val Asp

210 215 220

Leu Cys Gln Ala Ile Ile Ile Arg Ser Leu Val Asp Asp Asn Pro Glu

225 230 235 240

Lys Leu Ser His Ala Val Ala Gly Leu Ser Asp Val Trp Gln Tyr Val

245 250 255

Ser Ser Gly Asn Gly Phe Phe Thr Asp Gly Ser Phe Ile Gln His Ser

260 265 270

Thr Thr Pro Tyr Thr Gly Ser Tyr Gly Val Val Leu Leu Thr Gly Leu

275 280 285

Ser Lys Leu Phe Ala Leu Leu Gly Gly Thr Gly Ala Glu Val Ala Asp

290 295 300

Pro Ser Arg Asp Ile Leu Phe Lys Thr Val Glu Gly Ser Phe Ala Pro

305 310 315 320

Phe Met Val Ala Gly Ala Met Ala Asp Ser Val Arg Gly Arg Ser Ile

325 330 335

Ser Arg Glu Ala Asn Thr Gly Phe Asp Leu Gly Ala Ser Thr Thr Glu

340 345 350

Ser Ile Leu Leu Leu Ala Arg Ala Val Asp Pro Ala Thr Ala Gly Arg

355 360 365

Trp Arg Ser Leu Cys Gln Ala Trp Ile Ala Lys Asn Ser His Ala Pro

370 375 380

Ile Leu Glu Gly Ala Ser Val Pro Arg Thr Ala Leu Ile Lys Glu Leu

385 390 395 400

Phe Ala Met Glu Pro Thr Pro Ser Asp Leu Pro Arg Gly His Tyr Leu

405 410 415

Phe Pro Ala Met Asp Arg Thr Met His His Asn Gln Gly Trp Ile Leu

420 425 430

Ser Thr Ala Met Ala Ser Asn Arg Ile Ala Trp Tyr Glu Cys Gly Asn

435 440 445

Gly Glu Asn Asn Arg Gly Tyr His Thr Gly Ser Gly Met Thr Tyr Ile

450 455 460

Tyr Asp Ala Asp Leu Ala Gln Tyr Asp Asp Ala Tyr Trp Ala Thr Ala

465 470 475 480

Asn Tyr Cys Arg Leu Pro Gly Ile Thr Val Asp Thr Thr Pro Leu Pro

485 490 495

Asp Lys Ala Glu Gly Glu Trp Gly Ala Ala Thr Pro Ala Asn Glu Trp

500 505 510

Thr Gly Ala Ala Ala Tyr Asp Glu Val Ala Val Val Gly Glu His Leu

515 520 525

Ile Gly Pro Gly Gly Thr Gly Leu Gln Ala Arg Lys Ser Trp Phe Val

530 535 540

Ser His Asp Val Met Val Cys Leu Gly Ser Asp Ile Ser Thr Ala Ser

545 550 555 560

Gly Ser Val Ile Glu Thr Val Val Asp His Arg Asn Leu His Gly Gly

565 570 575

Ser Asn Ala Met Arg Thr Ala Ala Gly Thr Ile Ala Gly Thr Ile Gly

580 585 590

Ser Asn Asp Val Leu Thr Gly Asp Arg Trp Val His Leu Glu Gly Phe

595 600 605

Gly Gly Tyr Ile Val Leu Asp Ala Ser Pro Leu His Val Met Arg Glu

610 615 620

Gln Arg Thr Gly Ser Trp Ala Glu Val Asn Ala Lys Gly Ser Thr Ala

625 630 635 640

Arg Lys Thr Arg Asn Tyr Ala Thr Leu Tyr Phe Thr His Gly Gln Gly

645 650 655

Gly Glu Arg Ala Ser Tyr Ala Tyr Leu Val Ala Pro Gly Ala Ser Val

660 665 670

His Arg Thr Ser Ala Leu Ser Gly Gln Ser Phe His Val Val Leu Arg

675 680 685

Asn Asp Glu Val Ala Gln Ala Val Arg Phe Lys Lys Glu Lys Thr Thr

690 695 700

Ala Ala Thr Phe Trp Arg Pro Gly Ala Val Gly Asp Leu Ser Val Ser

705 710 715 720

Gly Pro Ala Cys Val Val Ile Arg Asp Ala Gly Asp Arg Leu Ser Ile

725 730 735

Ala Val Ser Asp Pro Thr Gln Ala Ala Pro Gln Leu Ser Leu Arg Leu

740 745 750

Arg Thr Lys Arg Ser Tyr Arg Ile Val Glu Gly Gln Gly Ala Ser Leu

755 760 765

Phe Gln Glu Pro Gly Gly Phe Ile Thr Leu Ser Val Asp Thr Ala Gly

770 775 780

Arg Ala Gly Val Ser Met Gln Phe Glu Leu Ser Ala Glu Glu

785 790 795

Claims

1.假节杆菌(Pseudarthrobacter sp.)PL-410，其特征在于，2021年6月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22736。

2.权利要求1所述的假节杆菌(Pseudarthrobacter sp.)PL-410的发酵液。

3.一种菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述的假节杆菌(Pseudarthrobacter sp.)PL-410或权利要求2所述的发酵液。

4.一种硫酸软骨素的降解剂，其特征在于，含有权利要求1所述的假节杆菌(Pseudarthrobacter sp.)PL-410发酵生产的软骨素裂解酶，所述软骨素裂解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

5.一种构建二糖和寡糖文库的方法，其特征在于，包括以权利要求1所述的假节杆菌(Pseudarthrobacter sp.)PL-410进行发酵生产软骨素裂解酶的步骤，所述软骨素裂解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

6.一种生产软骨素裂解酶的方法，其特征在于，包括以权利要求1所述的假节杆菌(Pseudarthrobacter sp.)PL-410进行发酵的步骤，所述软骨素裂解酶的氨基酸序列如SEQID NO.3所示。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述发酵的条件为：接种量为2×10⁶～4×10⁶CFU/mL，发酵温度为23～32℃，转速为160～220rpm；

8.一种软骨素裂解酶，其特征在于，由权利要求1所述的假节杆菌(Pseudarthrobactersp.)PL-410发酵获得，所述软骨素裂解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

9.根据权利要求8所述的软骨素裂解酶，其特征在于，所述软骨素裂解酶的编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

10.权利要求1所述的假节杆菌(Pseudarthrobacter sp.)PL-410或权利要求2所述的发酵液或权利要求3所述的菌剂在以下任一方面中的应用：

(1)生产软骨素裂解酶；

(2)制备硫酸软骨素降解剂；

(3)构建二糖和寡糖文库；

(4)制备低分子量的硫酸软骨素；

(5)检测硫酸软骨素的含量；

或，权利要求8或9所述的软骨素裂解酶在上述(2)-(5)任一方面中的应用。