CN113249260B - 一株高产壳聚糖酶的菌株sh-50及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株高产壳聚糖酶的菌株SH‑50及其应用，属于微生物发酵技术领域。所述的高产壳聚糖酶的菌株，命名为水丛毛单胞菌(Comamonas aquatic)SH‑50，于2021年01月21日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.21696。本发明用野生SH‑50菌株经高密度发酵得到的壳聚糖酶粗酶液的酶活为46.4U/mL。利用壳聚糖酶制备低分子量壳寡糖过程中，壳聚糖酶酶液与含有Mn2+的壳聚糖溶液复配后，酶活可达768.4U/mL，具有良好的工业化前景。

Description

一株高产壳聚糖酶的菌株SH-50及其应用
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，涉及一株高产壳聚糖酶的菌株SH-50及其应用。
背景技术
壳聚糖是由几丁质分子链上C2位脱去乙酰基得到的多聚糖。一般来说，脱乙酰度大于55％就可称之为壳聚糖。壳寡糖则是将壳聚糖经特殊技术降解得到的聚合度在2-20之间的寡糖产品，平均分子量为500-10000。壳寡糖是自然界中唯一带有正电荷的碱性寡糖，具有良好的水溶性、生物相容性以及生物活性；其独特的生理功能，使其在医药、食品、保健品、化妆品、农业和水产养殖等领域得到了广泛应用。目前市场上大多数壳寡糖的制备仍采用酸降解或者氧化降解等方法，这些方法工艺复杂，存在污染环境的风险，且得到的寡糖分子量较大，溶解性差以及生物活性低。壳聚糖酶可以定向催化水解壳聚糖的β-1,4-糖苷键，是一种专一性水解壳聚糖的酶蛋白，广泛分布于细菌、真菌、病毒以及植物中。酶解法不仅反应条件温和、副产品少、产率高、无污染，而且降解产物的分子量易于控制。
自然界中有许多微生物含有壳聚糖酶基因，但大部分野生菌株产酶活性极低；仅少部分壳聚糖产酶活性高于10U/mL。正因为如此，目前制备高活性壳聚糖酶的方法主要是通过基因重组将壳聚糖酶基因异源表达至大肠杆菌或酵母中获得。公开号为CN112111473A的中国发明专利申请公开了一种具有高活性的壳聚糖酶及其制备和应用，通过基因工程在大肠杆菌中异源表达壳聚糖酶基因，再通过细胞破壁等收集粗酶液，最终粗酶液酶活达到683U/mL。公开号为CN111235131A的中国发明专利申请一种壳聚糖酶及其应用，通过已知的GH5家族壳聚糖酶基因在大肠杆菌中异源表达，使最终酶活达到898.6U/mg。公开号为CN111893125A的中国发明专利申请公开了一种壳聚糖酶基因、壳聚糖酶及其制备方法和应用，该专利申请通过将已知的壳聚糖酶基因序列在毕赤酵母中高效诱导表达，诱导酵母产酶，144h后酶活达到1150U/mL。其中大部分壳聚糖酶的异源表达是通过大肠杆菌获得，但大肠杆菌产胞内酶，易形成包涵体，提取过程较繁琐费时；也有部分报道通过酵母超表达获得胞外壳聚糖酶，但酵母产酶周期往往较长。目前，直接通过野生菌株获得壳聚糖酶，再利用该壳聚糖酶在一定工艺条件下制备壳寡糖的相关报道较少，且新来源的壳聚糖酶产生菌因其壳聚糖酶性质的不同，使得降解产物中寡糖聚合度分布和功能存在差异。因此，在工业化生产壳寡糖及其相关产品过程中，提供一种高产壳聚糖酶的新型菌株，并提供成本低廉、环境友好的壳寡糖制备工艺，具有很好的应用前景和优势。
发明内容
本发明的第一目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一株高产壳聚糖酶的菌株。
本发明的第二个目的在于提供一种壳聚糖酶，由上述高产壳聚糖酶的菌株发酵得到；所述的壳聚糖酶属于诱导酶，且产物中不具有单糖，证明该酶为内切酶。
本发明的第三个目的在于提供上述高产壳聚糖酶的菌株或壳聚糖酶在制备低分子量壳寡糖中的应用。
本发明的第四个目的在于提供一种利用上述壳聚糖酶制备壳寡糖的方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一株高产壳聚糖酶的菌株，命名为水丛毛单胞菌(Comamonas aquatic)SH-50，于2021年01月21日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.21696。
本发明将采集于广西北海虾蟹养殖区附近的泥沙与无菌水混匀，然后通过富集、初筛获得高产壳聚糖酶菌株SH-50。在以壳聚糖为唯一碳源的固体培养基上，该菌株形成的单菌落呈白色圆点状，菌落大，易挑起，边缘光滑，少量粘液分泌。在显微镜下观察，该细菌呈椭圆状，革兰氏染色结果为阴性。以菌株SH-50的基因组DNA为模板，利用细菌16SrDNA的通用引物进行扩增，将得到的序列信息提交到NCBI数据库进行BLAST比对，并构建其系统进化树，结果表明该菌株与水丛毛单胞菌Comamonas aquatic同源性达到99％。基于形态特征，将该菌株鉴定为水丛毛单胞菌，命名为水丛毛单胞菌(Comamonas aquatic)SH-50。
所述的高产壳聚糖酶的菌株具有产酶快、产壳聚糖酶活性高以及比酶活高等特性。
一种壳聚糖酶，由所述的高产壳聚糖酶的菌株水丛毛单胞菌(Comamonasaquatic)SH-50发酵得到；所述的壳聚糖酶属于诱导酶，且产物中不具有单糖，具有内切酶活性。
所述的壳聚糖酶的最适反应温度为40℃，最适pH为6.0，此外，所述的壳聚糖酶在50℃下及pH3.0～7.0范围内较稳定，且金属Mn2+对该酶激活效应达到390％。
一种利用高产壳聚糖酶的菌株制备壳聚糖酶的方法，包括如下步骤：将水丛毛单胞菌(Comamonas aquatic)SH-50菌液接种到发酵培养基中，在25～35℃、180～240r/min条件下培养，得到含壳聚糖酶的发酵液。
所述的发酵培养基的组成优选为壳聚糖6～10g/L、酵母粉1～2g/L、硫酸铵0.3～0.7g/L、磷酸氢二钾0.05～0.15g/L、磷酸二氢钾0.2～0.6g/L、氯化钠8～12g/L、七水硫酸镁0.1g/L、余量为水，pH6～7；更优选为壳聚糖8g/L、酵母粉1.5g/L、硫酸铵0.5g/L、磷酸氢二钾0.1g/L、磷酸二氢钾0.4g/L、氯化钠10g/L、七水硫酸镁0.1g/L、余量为水，pH6.5。
所述的接种量优选为0.5～1.5％(v/v)；更优选为1％(v/v)。
所述的发酵培养基的体积与发酵容器体积优选按2～4:5计算。
当所述的培养为高密度发酵培养时，所述的培养的条件优选为：搅拌转速为160～300r/min，空气流量0.6～1.0L/min，溶氧10％～15％，室温；更优选为：搅拌转速为240r/min，空气流量0.8L/min，溶氧10％～15％，室温。
所述的室温是指25～35℃；更优选为29℃。
当所述的培养为摇瓶发酵培养时，所述的培养的条件优选为：1％的接种量、温度为29℃、发酵初始pH6.5，转速200r/min。
所述的水丛毛单胞菌(Comamonas aquatic)SH-50菌液通过如下方法得到：将水丛毛单胞菌(Comamonas aquatic)SH-50菌株接种于活化培养基中，于24～35℃、pH 5.5～7.5条件下培养25～35h，得到生长至对数生长期末期的水丛毛单胞菌(Comamonas aquatic)SH-50菌液；其中，所述的活化培养基组成为：壳聚糖8.0～10.0g/L、酵母粉1.5～2.0g/L、硫酸铵0.5～1.0g/L、磷酸氢二钾0.1～0.3g/L、磷酸二氢钾0.4～1.0g/L、氯化钠5.0～10.0g/L、七水硫酸镁0.1～1.0g/L、余量为水；所述的接种量优选为0.5～1.5％(v/v)；更优选为1％(v/v)。
所述的利用高产壳聚糖酶的菌株制备壳聚糖酶的方法还包括将含壳聚糖酶的发酵液在8000～12000r/min下离心8～12min，收集上清液，得到壳聚糖酶粗酶液的操作。
所述的利用高产壳聚糖酶的菌株制备壳聚糖酶的方法，还包括进一步纯化的操作：将所述的壳聚糖酶粗酶液进行硫酸铵分级沉淀，然后透析得到纯化后的壳聚糖酶。
所述的硫酸铵分级沉淀，然后透析的具体操作优选为：在所述的壳聚糖酶粗酶液中加入硫酸铵至30％饱和度，4℃条件下静置后，离心收集上清液，继续加硫酸铵至50％饱和度，离心收集上清液，然后加硫酸铵至80％饱和度，4℃静置过夜，离心弃去上清液，收集沉淀后透析即得纯化后的壳聚糖酶。
所述的离心的转速优选为10000～12000r/min。
所述透析的具体操作为：将沉淀溶于20mmol/L pH 6.5磷酸缓冲液，置于透析袋(MW:14000)，并在20mmol/L pH 6.5磷酸缓冲液透析过夜。
所述的高产壳聚糖酶的菌株或壳聚糖酶在制备低分子量壳寡糖中的应用。
一种利用壳聚糖酶制备低分子量壳寡糖的方法，包括如下步骤：
(1)胶体壳聚糖溶液配制：将壳聚糖分散于水中，搅拌至均匀分散，得到胶体壳聚糖溶液；
(2)金属激活离子的添加：在上述步骤(1)的胶体壳聚糖溶液中添加金属激活离子，继续搅拌至完全溶解，得到含有金属激活离子的溶液；
(3)酶液的添加：向上述步骤(2)得到的含有金属激活离子的溶液中添加浓缩后的酶液，搅拌，得到含有酶液的溶液；
(4)壳聚糖的溶胀：调节步骤(3)得到的含有酶液的溶液的pH至4.6，搅拌，待其完全溶胀形成均匀的胶状物质；
(5)降解：将步骤(4)制备的胶状物质缓慢升温至35～45℃，恒温下搅拌180～200min，即可得到低分子量壳寡糖溶液；
(6)灭活：将步骤(5)中得到的壳寡糖溶液进行灭活处理，即得目标低分子量壳寡糖溶液。
步骤(1)中所述的胶体壳聚糖溶液的质量分数优选为5％(w/w)～15％(w/w)；更优选为10％(w/w)。
步骤(2)中所述的金属激活离子优选包括但不限于使用氯化锰、一水硫酸锰、硫酸锌、硫酸镁、硫酸铜、氯化亚铁、氯化铁和氯化钠中的至少一种；更优选为一水合硫酸锰。
步骤(2)中所述的金属激活离子的添加量以体系中含有0.2～0.4g/L金属激活离子为准；更优选以体系中含有0.3g/L金属激活离子为准；所述的体系由金属激活离子和胶体壳聚糖溶液组成。
步骤(3)中所述的浓缩后的酶液通过如下方法制备得到：将壳聚糖酶粗酶液于旋转蒸发瓶中低压旋转蒸发浓缩，浓缩后的体积为至初始体积的20～25％；更优选为：将壳聚糖酶粗酶液于旋转蒸发瓶中低压旋转蒸发浓缩，浓缩后的体积为至初始体积的22％。
步骤(3)中所述的浓缩后的酶液的添加量优选为由含有金属激活离子的溶液与浓缩后的酶液形成体系的0.2％～0.4％(w/w)；更优选为由含有金属激活离子的溶液与浓缩后的酶液形成体系的0.3％(w/w)。
所述的旋转蒸发的优选温度为40～45℃，转速35～45r/min，时间80～120min；更优选温度为42℃，转速40r/min，时间100min。
步骤(3)中所述的搅拌优选为室温搅拌；所述的室温是指25～35℃。
步骤(4)中所述的调节步骤(3)得到的含有酶液的溶液的pH的试剂优选包括但不限于盐酸、甲酸、乙酸、乳酸、苹果酸和柠檬酸中的至少一种。
步骤(6)中所述的灭活处理优选为高温灭活处理；更优选为将步骤(5)中得到的壳寡糖溶液迅速升温至85～95℃，持续约10～15min以灭活壳寡糖溶液中的酶蛋白及微生物。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1.本发明从自然界筛选到一株产高活性壳聚糖酶的菌株SH-50，该菌株往往应用于环境污染中氨氮及有毒化合物的清除，尚未见报道该菌属具有产高活性壳聚糖酶功能。
2.本发明直接采用野生SH-50菌株经高密度发酵生产制备壳聚糖酶，工艺较为简单，经高密度发酵得到的壳聚糖酶粗酶液的酶活为46.4U/mL。利用壳聚糖酶制备低分子量壳寡糖过程中，壳聚糖酶酶液与含有Mn2+的壳聚糖溶液复配后，酶活可达768.4U/mL；所得壳寡糖的平均分子量≤2000，主要产物为壳二糖、壳三糖和壳四糖，具有良好的工业化前景。
3.本发明制备的壳聚糖酶在一定工艺下能较好的用于制备平均聚合度低，活性稳定的壳寡糖。
附图说明
图1为SH-50菌株的生长特性图；其中：图1A为SH-50菌株在以壳聚糖为唯一碳源的固体培养基上的菌落图；图1B为SH-50菌株经革兰氏染色后的菌株形态图。
图2为SH-50菌株的系统进化树图。
图3为不同条件下SH-50菌株的发酵产酶情况图；其中，图3A为SH-50菌株的生长曲线图；图3B为发酵时间对SH-50菌株的产酶影响的结果分析图；图3C为发酵温度对SH-50菌株相对酶活的影响结果图；图3D为发酵pH对SH-50菌株相对酶活的影响结果图。
图4为不同因素对壳寡糖产率影响的响应面结果图。
图5为SH-50菌株所产壳聚糖酶的酶活性能图；图5A是SH-50菌株所产壳聚糖酶的最适温度结果图；图5B是SH-50菌株所产壳聚糖酶的温度稳定性结果图；图5C是SH-50菌株所产壳聚糖酶的最适pH结果图；图5D是SH-50菌株所产壳聚糖酶的pH稳定性结果图。
图6是TLC分析SH-50菌株所产壳聚糖酶水解壳聚糖的产物结果图。
图7是经ESI-MS分析SH-50菌株所产壳聚糖酶的水解产物结果图。
图8为不同金属离子对SH-50菌株所产壳聚糖酶的激活强度结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例3-6和实施例7、9、10每个实施例重复3次。
实施例1：水丛毛单胞菌(Comamonas aquatic)SH-50分离、筛选及鉴定
1.培养基的配制
富集培养基：壳聚糖10g/L，蛋白胨2g/L，酵母粉1g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，硫酸镁1g/L，氯化钠5g/L，pH7.0。
固体培养基：壳聚糖10g/L，硫酸铵4g/L，硫酸镁1g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，氯化钠5g/L，琼脂1.5％(w/v)，pH7.0。
种子培养基：氯化钠10g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L。
2.菌株的筛选
(1)富集：取广西北海虾蟹养殖区附近泥土样品5g与50mL无菌水混合样置于150mL三角烧瓶中振荡1h，振荡条件为常温常压，180r/min；静置待泥土沉底后取上清液1mL接种于100mL/250mL富集培养基中，28℃、180r/min培养3d。
(2)检测酶活：取富集后的发酵液1mL，在12000r/min，4℃条件下离心5min，取上清液100μL和900μL 1％(m/v)壳聚糖溶液加入至25mL比色管中，40℃反应10min后，加入1.5mLDNS溶液，沸水浴5min，冷却至室温后，加蒸馏水定容至25mL；8000r/min，4.0℃离心10min后，取上清液在540nm处比色，得到具有酶活的富集液。
(3)分离纯化：将具有酶活的富集液按照10-4～10-7梯度稀释后均匀的涂布到固体培养基平板上，28℃恒温培养2d，观察平板上的菌落生长状况，挑取具有明显透明圈的菌点进一步纯化3次。结果如图1所示。从图1可以看出，该菌株在以壳聚糖为唯一碳源的固体培养基上形成的单菌落呈白色圆点状，菌落大，易挑起，边缘光滑，少量粘液分泌。在显微镜下观察，该细菌呈椭圆状，革兰氏染色结果为阴性。将该菌株命名为SH-50。
(4)菌种保存：将纯化后的菌株接于种子培养基中生长8h，取40％甘油按1:1的比例将菌液保存于-80℃冰箱。
3.Comamonas aquatic sp.SH-50的16S rDNA鉴定
将纯化后的菌株在唯一碳源为壳聚糖的固体培养基上培养至长出单菌落，刮取微量菌苔加入到150μL无菌水中，混匀后煮沸10min，12000r/min条件下离心10min，取上清液进行PCR扩增。采用细菌16S rDNA通用引物(正向引物：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)进行PCR扩增，扩增程序为：94℃5min；98℃10s，55℃30s，72℃1kb/1min，35个循环；72℃10min；4℃保存。获得的PCR产物利用1％的琼脂糖凝胶电泳验证后，交由广州天一辉远基因科技有限公司进行测序。将测序结果提交到NCBI数据库，利用Blast程序搜索同源序列，选出同源性高的菌株16SrDNA序列为参比对象，通过MEGA7.0软件的Neighbor-Joining法构建系统发育树。经鉴定该菌株属于水丛毛单胞菌属(Comamonas aquatic)，并命名为水丛毛单胞菌(Comamonas aquatic)SH-50。该菌与其近源菌株16S rDNA序列构建的系统发育进化树如图2所示。
水丛毛单胞菌(Comamonas aquatic)SH-50菌株，于2021年01月21日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.21696。
实施例2：水丛毛单胞菌(Comamonas aquatic)SH-50的培养条件研究
(1)取1份-80℃保藏的SH-50菌株转接于100mL/250mL的活化培养基(活化培养基：壳聚糖8.0g/L、酵母粉1.5g/L、硫酸铵0.5g/L、磷酸氢二钾0.1g/L、磷酸二氢钾0.4g/L、氯化钠10.0g/L、七水硫酸镁0.1g/L、余量为水)，于29℃、pH 6.5条件下培养35h，得到生长至对数生长期末期的水丛毛单胞菌(Comamonas aquatic)SH-50菌液。
活化培养基中(接菌量1％(v/v))共培养55h，每间隔5h取样一次，并测定其菌液的OD值，在600nm波长处进行比色，分析其生长周期曲线，结果如图3A所示。
(2)将上述步骤(1)处于对数生长期末期的菌液接种于液体发酵培养基(发酵培养基：壳聚糖8g/L、酵母粉1.5g/L、硫酸铵0.5g/L、磷酸氢二钾0.1g/L、磷酸二氢钾0.4g/L、氯化钠10g/L、七水硫酸镁0.1g/L、余量为水，pH6.5)中，分别研究液体发酵培养基的pH(5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5)，发酵温度(24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、34℃)，时间(5h、10h、15h、20h、25h、30h、35h、40h、45h、50h、55h、60h)等培养条件对SH-50菌株产酶的影响。
结果如图3B-3D所示。SH-50菌株在初始发酵pH为7.0～7.5时，温度为29℃，发酵50h时产酶活性最高。
实施例3：水丛毛单胞菌(Comamonas aquatic)SH-50制备壳聚糖酶
应用实施例1筛选得到的水丛毛单胞菌(Comamonas aquatic)SH-50菌株制备壳聚糖酶的方法，包括以下步骤：
(1)菌株活化：从-80℃超低温冰箱中取已保藏的水丛毛单胞菌(Comamonasaquatic)SH-50菌株1份，待化冰后将其接种于50mL活化培养基中(接菌量1％(v/v))，于150mL三角烧瓶中摇瓶培养(35h，29℃)，菌株生长至对数生长期末期时，取0.5mL该菌液重复接种于50mL/150mL三角烧瓶中，重复此操作3次，得到已经活化的水丛毛单胞菌(Comamonas aquatic)SH-50菌株；
其中，水丛毛单胞菌(Comamonas aquatic)SH-50菌株的活化培养基组成为：壳聚糖8.0g/L、酵母粉1.5g/L、硫酸铵0.5g/L、磷酸氢二钾0.1g/L、磷酸二氢钾0.4g/L、氯化钠10.0g/L、七水硫酸镁0.1g/L、余量为水。
活化培养基的pH为6.5，温度为29℃，转速200r/min。
(2)高密度发酵：培养条件设定：取2.5L发酵培养基(发酵培养基：壳聚糖8g/L、酵母粉1.5g/L、硫酸铵0.5g/L、磷酸氢二钾0.1g/L、磷酸二氢钾0.4g/L、氯化钠10g/L、七水硫酸镁0.1g/L、余量为水，pH6.5)于5L大体积高密度发酵罐中进行高温灭菌(灭菌条件为121℃，压力为101.33kPa)，灭菌时间设置为20min；
设定发酵时的搅拌转速为240r/min，空气流量0.8L/min，溶氧10％～15％，温度29℃；
将步骤(1)中已经活化的水丛毛单胞菌(Comamonas aquatic)SH-50菌株按1％(v/v)的接种量接种到高密度发酵罐中，发酵20h后加入补料培养基进行第一次补料，补料量为1L；补料后继续发酵10h后加入补料培养基进行第二次补料，补料量为0.5L，第二次补料后继续发酵20h，即得含壳聚糖酶的发酵液；
所述的补料培养基的组成为：壳聚糖10g/L、葡萄糖0.1g/L、蛋白胨0.1g/L、硫酸铵0.1g/L、磷酸氢二钾0.1g/L、磷酸二氢钾0.4g/L、氯化钠5g/L、七水硫酸镁0.1g/L、余量为水。
(3)粗酶液制备：将含壳聚糖酶的发酵液置于低温高速离心机下离心，离心后的上清液即所需粗酶液，离心转速设置为10000r/min，温度设置为4℃，时间设定为10min。
实施例4：水丛毛单胞菌(Comamonas aquatic)SH-50制备壳聚糖酶
应用实施例1筛选得到的水丛毛单胞菌(Comamonas aquatic)SH-50菌株制备壳聚糖酶的方法，包括以下步骤：
(1)菌株活化：从-80℃超低温冰箱中取已保藏的水丛毛单胞菌(Comamonasaquatic)SH-50菌株1份，待化冰后将其接种于50mL活化培养基(接菌量1％(v/v))中，于150mL三角烧瓶中摇瓶培养(35h，29℃)，菌株生长至对数生长期末期时，取0.5mL该菌液重复接种于50mL/150mL三角烧瓶中，重复此操作3次，得到已经活化的水丛毛单胞菌(Comamonas aquatic)SH-50菌株；
其中，水丛毛单胞菌(Comamonas aquatic)SH-50菌株的活化培养基组成为：壳聚糖8g/L、葡萄糖0.5g/L、蛋白胨0.1g/L、硫酸铵0.5g/L、磷酸氢二钾0.2g/L、磷酸二氢钾0.1g/L、氯化钠5g/L、七水硫酸镁0.1g/L、余量为水。
活化培养基的pH为6.0，温度为29℃，转速200r/min。
(2)高密度发酵：培养条件设定：取2L发酵培养基(发酵培养基：壳聚糖8g/L、葡萄糖0.5g/L、蛋白胨0.1g/L、硫酸铵0.5g/L、磷酸氢二钾0.2g/L、磷酸二氢钾0.1g/L、氯化钠5g/L、七水硫酸镁0.1g/L、余量为水)于5L大体积高密度发酵罐中进行高温灭菌(灭菌条件为121℃，压力为101.33kPa)，灭菌时间设置为20min；
设定发酵时的搅拌转速为240r/min，空气流量0.8L/min，溶氧10％～15％，温度35℃；
高密度发酵：将步骤(1)中已经活化的水丛毛单胞菌(Comamonas aquatic)SH-50菌株按1％(v/v)的接种量接种到高密度发酵罐中，发酵20h后加入补料培养基进行第一次补料，补料量为1L；补料后继续发酵20h后加入补料培养基进行第二次补料，补料量为1L，第二次补料后继续发酵10h，即得含壳聚糖酶的发酵液；
所述的补料培养基的组成为：壳聚糖10g/L、蛋白胨0.1g/L、硫酸铵1g/L、氯化钠4g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、磷酸二氢钾0.2g/L、七水硫酸镁1g/L、余量为水；
(3)粗酶液制备：将含有壳聚糖酶的发酵液置于低温高速离心机下离心，离心后的上清液即所需粗酶液，离心转速设置为10000r/min，温度设置为4℃，时间设定为10min。
实施例5：水丛毛单胞菌(Comamonas aquatic)SH-50制备壳聚糖酶
应用实施例1筛选得到的水丛毛单胞菌(Comamonas aquatic)SH-50菌株制备壳聚糖酶的方法，包括以下步骤：
(1)菌株活化：从-80℃超低温冰箱中取已保藏的水丛毛单胞菌(Comamonasaquatic)SH-50菌株1份，待化冰后将其接种于50mL活化培养基中(接菌量1％(v/v))，于150mL三角烧瓶中摇瓶培养(35h，27℃)，菌株生长至对数生长期末期时，取0.5mL该菌液重复接种于50mL/150mL三角烧瓶中，重复此操作3次，得到已经活化的水丛毛单胞菌(Comamonas aquatic)SH-50菌株；
其中，水丛毛单胞菌(Comamonas aquatic)SH-50菌株的活化培养基组成为：壳聚糖5g/L、葡萄糖0.1g/L、硫酸铵0.1g/L、磷酸氢二钾0.1g/L、磷酸二氢钾0.1g/L、氯化钠4g/L、七水硫酸镁0.1g/L、余量为水；
活化培养基的pH为6.0，温度为27℃，转速200r/min。
(2)高密度发酵：培养条件设定：取3.5L发酵培养基(发酵培养基组分含量同上述活化培养基：壳聚糖5g/L、葡萄糖0.1g/L、硫酸铵0.1g/L、磷酸氢二钾0.1g/L、磷酸二氢钾0.1g/L、氯化钠4g/L、七水硫酸镁0.1g/L、余量为水)于5L大体积高密度发酵罐中进行高温灭菌(灭菌条件为121℃，压力为101.33kPa)，灭菌时间设置为20min；
设定发酵时的搅拌转速为240r/min，空气流量0.8L/min，溶氧10％～15％，温度25℃；
高密度发酵：将步骤(1)中已经活化的水丛毛单胞菌(Comamonas aquatic)SH-50菌株按1％(v/v)的接种量接种到高密度发酵罐中，发酵20h后加入补料培养基进行第一次补料，补料量为0.5L；补料后继续发酵10h后加入补料培养基进行第二次补料，补料量为0.5L，第二次补料后继续发酵25h，即得含壳聚糖酶的发酵液；
所述的补料培养基的组成为：壳聚糖5g/L、葡萄糖0.1g/L、硫酸铵0.1g/L、磷酸氢二钾0.1g/L、磷酸二氢钾0.2g/L、氯化钠3g/L、七水硫酸镁0.1g/L、余量为水。
(3)粗酶液制备：将含壳聚糖酶的发酵液置于低温高速离心机下离心，离心后的上清液即所需粗酶液，离心转速设置为10000r/min，温度设置为4℃，时间设定为10min。
实施例6：水丛毛单胞菌(Comamonas aquatic)SH-50制备壳聚糖酶
应用实施例1筛选得到的水丛毛单胞菌(Comamonas aquatic)SH-50菌株制备壳聚糖酶的方法，包括以下步骤：
(1)菌株活化：从-80℃超低温冰箱中取已保藏的水丛毛单胞菌(Comamonasaquatic)SH-50菌株1份，待化冰后将其接种于50mL活化培养基中(接菌量1％(v/v))，于150mL三角烧瓶中摇瓶培养(35h，27℃)，菌株生长至对数生长期末期时，取0.5mL该菌液重复接种于50mL/150mL三角烧瓶中，重复此操作3次，得到已经活化的水丛毛单胞菌(Comamonas aquatic)SH-50菌株；
其中，水丛毛单胞菌(Comamonas aquatic)SH-50菌株的活化培养基组成为：壳聚糖10g/L、葡萄糖0.5g/L、蛋白胨0.1g/L、磷酸氢二钾0.2g/L、磷酸二氢钾0.1g/L、氯化钠6g/L、七水硫酸镁0.1g/L、余量为水；
活化培养基的pH为6.5，温度为27℃，转速200r/min。
(2)高密度发酵：培养条件设定：取3L发酵培养基(同上述活化培养基：壳聚糖10g/L、葡萄糖0.5g/L、蛋白胨0.1g/L、磷酸氢二钾0.2g/L、磷酸二氢钾0.1g/L、氯化钠6g/L、七水硫酸镁0.1g/L、余量为水)于5L大体积高密度发酵罐中进行高温灭菌，灭菌时间设置为20min；
设定发酵时的搅拌转速为240r/min，空气流量1L/min，溶氧10％～15％，温度为29℃；
高密度发酵：将步骤(1)中已经活化的水丛毛单胞菌(Comamonas aquatic)SH-50菌株按1％(v/v)的接种量直接接种到高密度发酵罐中，发酵10h后加入补料培养基进行第一次补料，补料量为0.5L；补料后继续发酵16h后加入补料培养基进行第二次补料，补料量为1L，第二次补料后继续发酵18h，即得含壳聚糖酶的发酵液；
所述的补料培养基的组成为：壳聚糖10g/L、葡萄糖0.1g/L、酵母粉0.2g/L、硫酸铵0.3g/L、磷酸氢二钾0.1g/L、磷酸二氢钾0.2g/L、氯化钠5g/L、七水硫酸镁0.1g/L、余量为水；
(3)粗酶液制备：将含壳聚糖酶的发酵液置于低温高速离心机下离心，离心后的上清液即所需粗酶液，离心转速设置为8000r/min，温度设置为4℃，时间设定为10min。
实施例7：
一种利用实施例3得到的壳聚糖酶粗酶液制备低分子量壳寡糖的方法，包括如下步骤：
(1)胶体壳聚糖溶液配制：配制10％(w/w)的胶体壳聚糖溶液(壳聚糖的脱乙酰度≥85；购自青岛博智汇力生物科技有限公司；溶剂为水)，搅拌至均匀分散；
(2)金属激活离子的添加：在上述步骤(1)的胶体壳聚糖溶液中添加金属激活离子：一水合硫酸锰，使体系中含有一水合硫酸锰0.3g/L，继续搅拌至完全溶解，得到含有金属激活离子的溶液；
(3)酶液的添加：向上述步骤(2)得到的含有金属激活离子的溶液中添加浓缩后的酶液，使浓缩后的酶液占含有金属激活离子的溶液与浓缩后的酶液形成体系的0.3％(w/w)，室温搅拌20min，得到含有酶液的溶液；其中，所述的浓缩后的酶液通过如下方法制备得到：将实施例3制备得到的壳聚糖酶粗酶液1L于旋转蒸发瓶中低压旋转蒸发浓缩，浓缩后的体积为至初始体积的22％；其中旋转蒸发的温度为42℃，转速40r/min，时间为100min。
(4)壳聚糖的溶胀：向上述步骤(3)得到的含有酶液的溶液中加乙酸(分析纯级)调节pH至4.6，继续搅拌20min，待其完全溶胀形成均匀的胶状物质；
(5)降解：将步骤(4)制备的胶状物质缓慢升温至42℃，恒温下搅拌180min，即可得到10％(w/w)的低分子量壳寡糖溶液；
(6)灭活：将步骤(5)中得到的壳寡糖溶液迅速升温至90℃，持续约10min以灭活壳寡糖溶液中的酶蛋白及微生物，即得目标10％(w/w)的低分子量壳寡糖溶液。
实施例8：响应面优化提高壳寡糖的产率
利用Design expert 8.0软件设计Box-Behnken Design试验找出降解壳聚糖酶时的最优反应条件，壳寡糖酶在降解过程中需要在一定的酸碱度、温度以及时间条件下得到，按照实施例7中记载的方法分别以步骤(4)中的pH(3.0、3.5、4.0、4.5、5.0)、步骤(5)中的搅拌时间(2.5h、3.0h、3.5h)、步骤(5)中的缓慢升温温度(38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃)三个因素作为主要变量进行单因素试验，计算目标10％(w/w)的低分子量壳寡的糖产率；并对上述三个因素进行响应面分析(见下表1)，每个因素分别设置高水平(1)、中水平(0)、低水平(-1)，以产率作为响应值构建回归方程，最后对数据进行方差及可信度分析，结果如图4和表2-3所示。
表1：三因素响应面试验设计
Figure BDA0003081632840000111
表2：响应面试验结果
Figure BDA0003081632840000112
Figure BDA0003081632840000121
表3：响应面结果方差分析
Figure BDA0003081632840000122
相应得到的回归方程为：
Y＝85.89+0.52A+0.43B+0.068C-0.51AB+0.80AC-0.14BC-6.42A2-5.2B2-4.11C2，由表2可知，该模型P＜0.05，表示极显著，失拟项为不显著，且该模型的R2＝0.9574，Radj 2＝0.9026，说明该响应面分析能较好的拟合90.26％响应值的变化。响应面软件预测最优降解条件值为pH4.6，时间为180min，温度为42.21℃，与实际最优结果相差较小。
实施例9：
一种利用实施例3得到的壳聚糖酶粗酶液制备低分子量壳寡糖的方法，包括如下步骤：
(1)胶体壳聚糖溶液配制：配制10％(w/w)的胶体壳聚糖溶液(壳聚糖的脱乙酰度为≥85％；购自青岛博智汇力生物科技有限公司；溶剂为水)，搅拌至均匀分散；
(2)壳聚糖的溶胀：在上述步骤(1)得到的10％(w/w)的胶体壳聚糖溶液加乙酸(分析纯级)调节pH至4.6，继续搅拌20min，待其完全溶胀形成均匀的胶状物质；
(3)金属激活离子的添加：在上述步骤(2)的胶体物质中添加金属激活离子：一水合硫酸锰，使体系中含有一水合硫酸锰0.1g/L，继续搅拌至完全溶解，得到含有金属激活离子的溶液；
(4)酶液的添加：向上述步骤(3)得到的含有金属激活离子的溶液中添加浓缩后的酶液，使浓缩后的酶液占含有金属激活离子的溶液和浓缩后的酶液形成体系的0.3％(w/w)，室温搅拌20min，得到含有酶液的溶液；其中，所述的浓缩后的酶液通过如下方法制备得到：将实施例3制备得到的壳聚糖粗酶液1L于旋转蒸发瓶中低压旋转蒸发浓缩，浓缩后的体积为至初始体积的22％；其中旋转蒸发的温度为42℃，转速40r/min，时间为100min；
(5)降解：将步骤(4)制备的含有酶液的溶液缓慢升温至42℃，恒温下搅拌180min，即可得到10％(w/w)的低分子量壳寡糖溶液；
(6)灭活：将步骤(5)中得到的壳寡糖溶液迅速升温至90℃，持续约10min以灭活壳寡糖溶液中的酶蛋白及微生物，即得目标10％(w/w)的低分子量壳寡糖溶液。
实施例10：
一种利用实施例3得到的壳聚糖酶粗酶液制备低分子量壳寡糖的方法，包括如下步骤：
(1)胶体壳聚糖溶液配制：配制10％(w/w)的胶体壳聚糖溶液(壳聚糖的脱乙酰度为≥85％；购自青岛博智汇力生物科技有限公司；溶剂为水)，搅拌至均匀分散；
(2)壳聚糖的溶胀：在上述步骤(1)得到的10％(w/w)的胶体壳聚糖溶液加乙酸(分析纯级)调节pH至4.6，继续搅拌20min，待其完全溶胀形成均匀的胶状物质；
(3)酶液的添加：向上述步骤(2)得到的胶状物质中添加浓缩后的酶液，使浓缩后的酶液占胶状物质和浓缩后的酶液形成体系的0.3％(w/w)，室温搅拌20min，得到含有酶液的溶液；其中，所述的浓缩后的酶液通过如下方法制备得到：将实施例3制备得到的壳聚糖粗酶液1L于旋转蒸发瓶中低压旋转蒸发浓缩，浓缩后的体积为至初始体积的22％；其中旋转蒸发的温度为42℃，转速40r/min，时间为100min；
(4)降解：将步骤(3)制备的含有酶液的溶液缓慢升温至42℃，恒温下搅拌180min，即可得到10％(w/w)的低分子量壳寡糖溶液；
(5)灭活：将步骤(4)得到的壳寡糖溶液迅速升温至90℃，持续约10min以灭活壳寡糖溶液中的酶蛋白及微生物，即得目标10％(w/w)的低分子量壳寡糖溶液。
性能测定：
对实施例3～6制备的壳聚糖酶粗酶液的酶活(即：酶液活性)进行测定，酶活的测定参照《几丁质酶活性检测方法》(GB/T 34799-2017)中公开的方法对本发明制备的壳聚糖酶酶活进行检测；
上述测定壳聚糖酶酶活定义为：每mL酶液每分钟产生1μmol还原糖所需的酶量定义为一个酶活力单位(U)。
结果如表4所示：
表4：不同培养基条件下SH-50菌株所产壳聚糖酶活性
实施例 重复1(U/mL) 重复2(U/mL) 重复3(U/mL) 酶液活性(U/mL)
实施例3 47.6 46.5 43.9 46.4
实施例4 19.7 23.1 20.1 20.9
实施例5 31.7 32.0 36.5 33.4
实施例6 27.3 26.4 31.8 28.5
从表4可以看出，水丛毛单胞菌(Comamonas aquatic)SH-50菌株经高密度发酵后的粗酶液的最高活性为46.4U/mL。
对实施例7、9、10中所用的浓缩后的酶液的酶活(即：浓缩酶活)和含有酶液的溶液的酶活(即：复配后酶活)进行测定，结果如表5所示；
表5：不同工艺条件下SH-50菌株所产壳聚糖酶活性
Figure BDA0003081632840000141
Figure BDA0003081632840000151
同时检测实施例7、9、10经降解操作后得到的低分子量壳寡糖的平均分子量及产率，结果如表6所示：
壳寡糖的产率计算方法为：分别取实施例7、9、10制备的目标10％(w/w)的低分子量壳寡糖溶液60g，10000r/min，4℃条件下离心10min，倒去清液后置于50℃烘箱中干燥2h，称量剩余固体残渣质量。
壳寡糖的产率＝(壳聚糖溶液中壳聚糖质量-剩余固体残渣质量)/壳聚糖溶液中壳聚糖质量×100％；
其中，壳聚糖溶液中壳聚糖质量＝目标10％(w/w)的低分子量壳寡糖溶液质量×10％。
表6：不同工艺条件下寡糖平均分子量及产率
实施例 重复1(Da) 重复2(Da) 重复3(Da) 平均分子量(Da) 产率(％)
实施例7 1230 1000 1120 1110 95.2
实施例9 1500 1450 1300 1400 87.8
实施例10 1300 1200 1160 1220 84.1
实施例11：壳聚糖酶的分离纯化及酶学性质
1.硫酸铵分级沉淀
向实施例3制备的壳聚糖酶粗酶液中缓慢加入硫酸铵至30％饱和度，4℃条件下静置4h后，11000r/min离心去除沉淀，收集上清液，继续加硫酸铵至50％饱和度，12000r/min离心去除沉淀，收集上清液，然后加硫酸铵至80％饱和度，4℃静置过夜，12000r/min离心弃去上清液，沉淀溶于20mmol/L pH 6.5磷酸缓冲液，置于透析袋(MW:14000)，并在20mmol/LpH 6.5磷酸缓冲液透析过夜。结果如表7所示。
通过对温度(20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃)、pH(2、3、4、5、6、7、8、9)、温度和pH稳定性等条件对壳聚糖酶的酶活进行研究，结果如图5所示。从如图5可以看出，温度对水丛毛单胞菌(Comamonas aquatic)SH-50菌株的酶活的影响结果表明(图5A)，在20～40℃范围内该酶的酶活随着温度升高而增加，当反应温度高于40℃时酶活迅速降低，故其最适反应温度为40℃。热稳定性试验表明(图5B)，该酶在40℃以下相对稳定；图5C说明该酶的最适pH为6.0，图5D说明2h内壳聚糖酶在pH3.0～7.0范围内较稳定。
表7：不同硫酸铵饱和浓度下壳聚糖酶的分级沉淀
Figure BDA0003081632840000152
Figure BDA0003081632840000161
从表7可以看出，SH-50菌株发酵的粗酶液酶活为46.4U/mL，总蛋白质量为0.037g/mL，比酶活力为1230U/mg。在硫酸饱和度为30％以下时几乎没有壳聚糖酶析出，在硫酸铵饱和度为30％～50％时，有少量壳聚糖酶析出，在硫酸铵饱和度为50～80％时几乎所有壳聚糖酶都会析出，比酶活为4221U/mg。
实施例12
对实施例7制备的目标10％(w/w)的低分子量壳寡糖产率进行分析：
(1)采用TLC(硅胶薄层层析)分析SH-50菌株所产壳聚糖酶水解壳聚糖的产物分布。具体地，将实施例7步骤(4)中制备的胶状物质缓慢升温至60℃，恒温下分别搅拌20min、40min、80min、120min，得到上述时间对应的低分子量壳寡糖溶液。用毛细管取样分别滴于TLC板上，吹干后置于展开剂(异丙醇：氨水＝2:1，v/v)中缓慢展开。待展开剂铺满硅胶板后，取出吹干，均匀喷洒1％(w/w)的茚三酮溶液，于110℃放置5分钟显色。结果如图6所示。
(2)采用电喷雾串联质谱(ESI-MS)分析SH-50菌株所产壳聚糖酶水解壳聚糖的水解产物。选择实施例7步骤(6)制备得到的目标10％(w/w)的低分子量壳寡糖溶液，条件设置为：正离子模式，分子量范围为50-2000(m/z)，电压3.5kV，温度180℃。结果如图7。
通过对上述产物检测可以得出，本发明实施例7所制备壳寡糖的平均分子量≤2000，主要产物为壳二糖、壳三糖、壳四糖以及少量壳五糖、壳六糖等高聚合度壳寡糖，产率基本在85％以上，利用本发明所述方法制备农用级壳寡糖液具有工艺简单，操作方便等优势，适合工业化生产。
实施例13：金属离子对壳聚糖酶的效应
以实施例3发酵得到的粗酶液为基础试验不同金属离子对壳聚糖酶活性的影响。
将Fe3+、Mn2+、Zn2+、Ca2+、Mg2+作为效应离子进行试验，设置离子浓度分别为(mmol/L)：0.5、1.0、2.0、5.0、10.0；
取离心后的粗酶液各20mL，分别将0.5mmol/L、1.0mmol/L、2.0mmol/L、5.0mmol/L、10.0mmol/L的硫酸锰溶液添加至粗酶液中，常温常压下搅拌30min混匀，在5000r/min，4℃条件下离心2min后测定壳聚糖酶活性。将分别含不同浓度的Fe3+、Zn2+、Ca2+、Mg2+的可溶性盐溶液替换硫酸锰溶液进行上述试验。
结果如图8所示，由图8可知，Mn2+浓度为2.0mmol/L时较其他金属离子(Fe3+、Zn2+、Ca2+、Mg2+)对壳聚糖酶的激活效应更强，达390％。
对比例1：
本对比例与实施例7基本相同，不同之处在于：步骤(4)中，分别使用盐酸、甲酸、乳酸、苹果酸、柠檬酸、20％(v/v)乙酸+80％(v/v)柠檬酸、80％(v/v)乙酸+20％(v/v)柠檬酸、50％(v/v)乙酸+50％(v/v)柠檬酸替代乙酸来溶胀含有酶液的溶液中的壳聚糖。(以上酸液均为国产分析纯，国药试剂)
壳寡糖的产率计算方法为：取实施例7步骤(6)制备的目标10％(w/w)的低分子量壳寡糖溶液60g，10000r/min，4℃条件下离心10min，倒去清液后置于50℃烘箱中干燥2h，称量剩余固体残渣质量。
壳寡糖的产率＝(壳聚糖溶液中壳聚糖质量-剩余固体残渣质量)/壳聚糖溶液中壳聚糖质量×100％；
其中，壳聚糖溶液中壳聚糖质量＝目标10％(w/w)的低分子量壳寡糖溶液质量×10％。
不同酸液所产壳寡糖(目标10％(w/w)的低分子量壳寡糖溶液)的分子量及产率结果如下表8所示：
表8：不同酸液对壳寡糖平均分子量及产率的影响
不同酸液 重复1 重复2 重复3 产物平均分子量(Da) 产率(％)
盐酸 1350 1300 1260 1300 85.6
甲酸 1630 1580 1740 1650 87.2
乙酸(实施例7) 1230 1000 1120 1110 95.2
乳酸 1760 1640 1700 1700 82.3
苹果酸 1300 1370 1510 1390 87.5
柠檬酸 800 690 650 710 90.6
80％乙酸+20％柠檬酸 1110 1030 980 1040 89.7
50％乙酸+50％柠檬酸 730 670 720 705 95.2
20％乙酸+80％柠檬酸 760 690 740 730 91.0
从表8可以看出，所有处理产物平均分子量均达到寡糖级别；酶解反应时搭配乙酸复配柠檬酸来溶胀壳聚糖所制得寡糖平均分子量相对较低，产率高。可能是因为柠檬酸和乙酸本身是结构较为简单的弱酸，具有一定缓冲性，且乙酸具有一定挥发性，酶解壳聚糖时pH会随着降解时间的延长逐渐增加，搭配乙酸可能更好的契合酶的反应条件。
对比例2：
本对比例与实施例7基本相同，不同之处在于：本对比例步骤(1)中，所用壳聚糖的脱乙酰度不同，壳聚糖的脱乙酰度分别为：75％＞脱乙酰度≥65％，85％＞脱乙酰度≥75％和脱乙酰度≥99％。(以上不同脱乙酰度的壳聚糖均购于青岛博智汇力生物科技有限公司)上述不同脱乙酰度的壳聚糖和实施例7脱乙酰度≥85％的壳聚糖经实施例7所述方法处理后，最终得到的低分子量壳寡糖的平均分子量和产率如表9所示。
表9：不同脱乙酰度壳聚糖经实施例7方法处理后得到的壳寡糖的平均分子量及产率
壳聚糖 重复1 重复2 重复3 产物平均分子量(Da) 产率(％)
75％＞脱乙酰度≥65％ 2600 2820 2540 2650 72.1
85％＞脱乙酰度≥75％ 1200 1190 1050 1150 85.7
脱乙酰度≥85％(实施例7) 1230 1000 1120 1110 95.2
脱乙酰度≥99％ 1340 1280 1360 1320 93.1
由表9可知，利用实施例3制备的壳聚糖酶按照实施例7记载的方法降解不同脱乙酰度的壳聚糖时，脱乙酰度≥85％的壳聚糖所得壳寡糖的平均分子量最低，壳寡糖产率最高。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一株高产壳聚糖酶的菌株SH-50及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1328
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<223> 16S rDNA序列
<400> 1
atgctgacga gtggcgaacg ggtgagtaat acatcggaac gtgcctagta gtgggggata 60
actactcgaa agagtggcta ataccgcatg agatctacgg atgaaagcag gggatcgcaa 120
gaccttgtgc tactagagcg gccgatggca gattaggtag ttggtgggat aaaagcttac 180
caagccgacg atctgtagct ggtctgagag gacgatcagc cacactggga ctgagacacg 240
gcccagactc ctacgggagg cagcagtggg gaattttgga caatgggcgc aagcctgatc 300
cagcaatgcc gcgtgcagga tgaaggcctt cgggttgtaa actgcttttg tacggaacga 360
aaagccctgg gttaataccc tggggtcatg acggtaccgt aagaataagc accggctaac 420
tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg gtgcgagcgt taatcggaat tactgggcgt 480
aaagcgtgcg caggcggttt tgtaagacag aggtgaaatc cccgggctca acctgggaac 540
tgcctttgtg actgcaaggc tagagtacgg cagaggggga tggaattccg cgtgtagcag 600
tgaaatgcgt agatatgcgg aggaacaccg atggcgaagg caatcccctg ggcctgtact 660
gacgctcatg cacgaaagcg tggggagcaa acaggattag ataccctggt agtccacgcc 720
ctaaacgatg tcaactggtt gttgggtctt aactgtctca gtaacgaagc taacgcgtga 780
agttgaccgc ctggggagta cggccgcaag gttgaaactc aaaggaattg acggggaccc 840
gcacaagcgg tggatgatgt ggtttaattc gatgcaacgc gaaaaacctt acccaccttt 900
gacatgtccg gaatccttta gagatagagg agtgctcgaa agagagccgt aacacaggtg 960
ctgcatggct gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca 1020
acccttgcca ttagttgcta cgaaagggca ctctaatggg actgccggtg acaaaccgga 1080
ggaaggtggg gatgacgtca agtcctcatg gcccttatag gtggggctac acacgtcata 1140
caatggccgg tacaaagggt tgccaacccg cgagggggag ctaatcccat aaagccagtc 1200
gtagtccgga tcgcagtctg caactcgact gcgtgaagtc ggaatcgcta gtaatcgtgg 1260
atcagaatgt cacggtgaat acgttcccgg gtcttgtaca caccgcccgt cacaccatgg 1320
gagcgggt 1328
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<223> 正向引物
<400> 2
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<223> 反向引物
<400> 3
ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (10)

1. 一株高产壳聚糖酶的菌株，命名为水丛毛单胞菌（Comamonas aquatic）SH-50，其特征在于：于2021年01月21日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC No.21696。
2. 一种利用权利要求1所述的高产壳聚糖酶的菌株制备壳聚糖酶的方法，其特征在于：包括如下步骤：将水丛毛单胞菌（Comamonas aquatic）SH-50菌液接种到发酵培养基中，在25～35℃、180～240 r/min条件下培养，得到含壳聚糖酶的发酵液。
3.根据权利要求2所述的利用高产壳聚糖酶的菌株制备壳聚糖酶的方法，其特征在于：
所述的发酵培养基的组成为：壳聚糖6～10g/L、酵母粉1～2g/L、硫酸铵0.3～0.7g/L、磷酸氢二钾0.05～0.15g/L、磷酸二氢钾0.2～0.6g/L、氯化钠8～12 g/L、七水硫酸镁0.1g/L、余量为水，pH6~7；
所述的接种量为0.5～1.5%v/v；
所述的发酵培养基的体积与发酵容器体积按2～4 : 5计算；
当所述的培养为高密度发酵培养时，所述的培养的条件为：搅拌转速为160～300 r/min，空气流量0.6～1.0 L/min，溶氧10%～15%，室温；
当所述的培养为摇瓶发酵培养时，所述的培养的条件为：1%的接种量、温度为29℃、发酵初始pH6.5，转速200 r/min。
4.根据权利要求2所述的利用高产壳聚糖酶的菌株制备壳聚糖酶的方法，其特征在于：
所述的水丛毛单胞菌（Comamonas aquatic）SH-50菌液通过如下方法得到：将水丛毛单胞菌（Comamonas aquatic）SH-50菌株接种于活化培养基中，于24～35℃、pH 5.5～7.5条件下培养25～35 h，得到生长至对数生长期末期的水丛毛单胞菌（Comamonas aquatic）SH-50菌液；其中，所述的活化培养基组成为：壳聚糖8.0～10.0g/L、酵母粉1.5～2.0g/L、硫酸铵0.5～1.0g/L、磷酸氢二钾0.1～0.3g/L、磷酸二氢钾0.4～1.0g/L、氯化钠5.0～10.0g/L、七水硫酸镁0.1～1.0g/L、余量为水；
所述的利用高产壳聚糖酶的菌株制备壳聚糖酶的方法包括以下步骤：
将所述的含壳聚糖酶的发酵液在8000～12000 r/min下离心8～12 min，收集上清液，得到壳聚糖酶粗酶液；
将所述的壳聚糖酶粗酶液进行硫酸铵分级沉淀，然后透析得到纯化后的壳聚糖酶。
5. 一种壳聚糖酶，其特征在于：由权利要求1所述的高产壳聚糖酶的菌株水丛毛单胞菌（Comamonas aquatic）SH-50发酵得到。
6.权利要求1所述的高产壳聚糖酶的菌株或权利要求5所述的壳聚糖酶在制备低分子量壳寡糖中的应用。
7.一种利用权利要求5所述的壳聚糖酶制备低分子量壳寡糖的方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）胶体壳聚糖溶液配制：将壳聚糖分散于水中，搅拌至均匀分散，得到胶体壳聚糖溶液；
（2）金属激活离子的添加：在上述步骤（1）的胶体壳聚糖溶液中添加金属激活离子，继续搅拌至完全溶解，得到含有金属激活离子的溶液；
（3）酶液的添加：向上述步骤（2）得到的含有金属激活离子的溶液中添加浓缩后的酶液，搅拌，得到含有酶液的溶液；
（4）壳聚糖的溶胀：调节步骤（3）得到的含有酶液的溶液的pH至4.6，搅拌，待其完全溶胀形成均匀的胶状物质；
（5）降解：将步骤（4）制备的胶状物质缓慢升温至35～45℃，恒温下搅拌180～200 min，即可得到低分子量壳寡糖溶液；
（6）灭活：将步骤（5）中得到的壳寡糖溶液进行灭活处理，即得目标低分子量壳寡糖溶液。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤（3）中所述的浓缩后的酶液通过如下方法制备得到：将壳聚糖酶粗酶液于旋转蒸发瓶中低压旋转蒸发浓缩，浓缩后的体积为至初始体积的20～25%；
所述的旋转蒸发的温度为40～45℃，转速35～45 r/min，时间80～120min。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤（3）中所述的浓缩后的酶液的添加量为由含有金属激活离子的溶液与浓缩后的酶液形成体系的0.2%～0.4%w/w。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：
步骤（4）中所述的调节步骤（3）得到的含有酶液的溶液的pH的试剂包括但不限于盐酸、甲酸、乙酸、乳酸、苹果酸和柠檬酸中的至少一种；
步骤（6）中所述的灭活处理为高温灭活处理。
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