CN112322535A - 一种解磷假单胞菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种解磷假单胞菌及其应用。解磷假单胞菌PD171于2020年10月09日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为：GDMCC No：61233。本发明公开的溶磷假单胞菌PD171为假单胞菌属的新物种，能够高效地溶解难溶态的磷酸钙，培养4天的溶磷量高达607.37mg/L，解磷性能显著优于大多数已报道的解磷菌株。因此，本发明公开的溶磷假单胞菌PD171可用于提高土壤中磷素的有效性，在促进植物生长，制备微生物菌剂和生物肥料等方面具有重要的应用潜力。

Description

一种解磷假单胞菌及其应用
技术领域：
本发明属于农业微生物技术领域，具体涉及一种解磷假单胞菌及其应用。
背景技术：
磷是植物生长所必需的大量元素，也是农业生产中最重要的养分限制因子。我国土壤中全磷含量约为40～2500mg/kg，但能够被植物直接吸收利用的有效磷平均含量不足10mg/kg。而外施的磷肥当季的利用率仅10％～15％，绝大部分磷素都与土壤中Ca2+、Fe3+、Al3+等阳离子结合成了难溶态的正磷酸盐化合物，无法被植物吸收。农业生产中磷肥的长期大量施用以及作物对其低效的吸收利用，一方面不断增加磷素向水环境的释放量，造成了严重的水体富营养化，另一方面磷肥中伴随的一些重金属元素也随着施用在土壤及周边水体中累积，对生态环境和农业可持续发展构成了严重的威胁。如何充分活化土壤中固定态的磷素，提高作物的吸收利用效率，从而减少磷肥的施用，是现代农业发展面临的重要课题。
大量研究表明溶磷细菌能通过分泌有机酸、胞外酶等方式将土壤中的难溶性磷活化，提高土壤有效磷的含量，促进植物对磷素的吸收和利用，从而提高植物的产量，在农业生产上有着重要的应用潜力和经济价值。目前大多溶磷细菌在NBRIP培养基中溶磷量约100～500mg/L，已报道的有芽胞杆菌(Bacillus)、类芽胞杆菌(Panebacillus)、假单胞菌(Pseudomonas)、根瘤菌(Rhizobium)、伯克霍尔德氏菌(Burkholderia)、微杆菌(Microbacterium)等30多个属，对植物生长均表现出了显著的促进作用。除溶解土壤中难溶性的磷素外，部分解磷细菌还能够通过分泌ACC脱氨酶、铁载体、植物生长素(IAA)等作用促进植物的生长。因此，不断发掘高效的溶磷微生物新资源，利用其制备的微生物菌剂、微生物肥料等产品将难溶态磷转化为植物可吸收利用的有效磷，提高土壤磷素的有效性，这对于改善土壤肥力，保护农业生态环境和支撑农业可持续发展都具有十分重要的意义。
发明内容：
本发明的第一个目的是提供一种具有高效溶磷能力的解磷假单胞菌(Pseudomonas phosphatilytica)PD171，其于2020年10月09日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为：GDMCC No：61233。
本发明的第二个目的是提供解磷假单胞菌PD171在制备溶解无机磷制剂中的应用。
本发明的第三个目的是提供一种溶解无机磷制剂，其含有解磷假单胞菌PD171作为活性成分。
所述的溶解无机磷制剂可以为微生物菌剂或生物肥料等。
与现有技术相比，本发明有如下优势：
①溶磷假单胞菌PD171是不同于其他溶磷细菌的假单胞菌新物种；
②溶磷假单胞菌PD171在NBRIP中培养4天能溶解无机磷量高达607.37mg/L，溶磷能力显著优于大多已报道的溶磷细菌(溶磷量100～500mg/L)。
因此，本发明公开的溶磷假单胞菌PD171可用于提高土壤中磷的有效性，在促进植物生长，制备微生物菌剂和生物肥料等方面具有重要的应用潜力。
附图说明：
图1是溶磷假单胞菌PD171细胞透射电镜观察图。
图2是基于溶磷假单胞菌PD171的16S rRNA基因序列构建的NJ系统进化树。
图3是溶磷假单胞菌PD171溶磷效果及培养液pH变化。
具体实施方式：
以下实施例用于解释本发明，但不用来限制本发明的保护范围。以下实施方式除特殊说明外，均为本领域常规试剂和方法步骤。
实施例1溶磷菌株PD171的分离
从广东省韶关市大宝山矿区采集重金属污染土壤样品。称取土壤样品10g于90mL灭菌双蒸水中，180r/min振荡30min，后采用10倍梯度逐级稀释土壤溶液为10-1～10-5，分别取不同稀释梯度的菌悬液100μL涂布于不同PVK固体培养基平板上。30℃培养3天，后挑取产生透明圈的不同形态菌株至TSA培养基上进行分离纯化，从而最终分离获得菌株PD171。
PVK固体培养基：葡萄糖10g，Ca3(PO4)25g，(NH4)2SO40.5 g，酵母提取物0.5g，NaCl0.3g，KCl 0.3g，MgSO4·7H2O 0.3g，FeSO4·7H2O 0.03g，MnSO4·H2O 0.03g，琼脂15.0g蒸馏水1000mL，pH 7.0，将各成分混合均匀，调pH值，121℃灭菌20min备用。
TSA培养基：胰蛋白胨15.0g，大豆胨5.0g，NaCl 5.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.3，将各成分混合均匀，调pH值，121℃灭菌20min备用。
实施例2菌株PD171的分类鉴定
表型特征：将菌株PD171采用三区划线方式接种于TSA培养基上，30℃培养3天后观察其菌落形态。取培养的菌落进行革兰氏染色，制备透射电镜观察样本，采用HitachiH7650透射电镜观察菌株的细胞形态。荧光素、绿脓素、氧化酶、过氧化氢酶、甲基红、水解淀粉试验方法参考《常见细菌鉴定手册》，硝酸盐还原、吲哚、β-半乳糖苷酶、水解明胶、水解七叶灵、精氨酸双水解酶等测试则采用API 20NE试剂条(法国梅里埃生物)。溶血试验则采用血平板接种后30℃培养7天观察有无溶血圈。
菌株PD171在TSA上呈浅黄色，规则圆形，表面湿润光滑，边缘整齐。菌株PD171革兰氏染色为阴性，细胞呈短杆状，具有端生鞭毛(图1)。产荧光素、氧化酶、过氧化氢酶和精氨酸双水解酶等均为阳性；β-半乳糖苷酶、绿脓菌素、甲基红、硝酸盐还原、吲哚、水解淀粉、水解明胶、水解七叶灵、溶血试验等反应均为阴性(表1)。
表1菌株PD171的表型特征
Figure BDA0002768256260000041
系统进化分析：采用细菌DNA提取试剂盒提取菌株PD171的基因组DNA。以提取的DNA为模板，采用细菌通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGACTTAACCCCAATCGC-3′)进行16S rRNA基因的PCR扩增。PCR反应体系(25μL)：2×PCRMix 12.5μL，上下游引物(10μmol/L)各0.5μL，模板DNA 1μL，ddH2O补足25μL。反应程序为：94℃预变性5min；35个循环(94℃变性30s,56℃退火30s,72延伸90s)；72℃延伸10min。采用1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，目的条带经胶回收后进行TA克隆后由上海美吉生物医药科技有限公司完成测序，序列相似度比较则采用Ezbiocloud(https://www.ezbiocloud.net/)在线工具完成。采用MEGAX构建基于16S rRNA序列的Neighbor-Joining系统进化树，计算模型为Kimura 2-paremeter。通过克隆测序获得菌株PD171的16SrRNA基因全长序列为1513bp(具体如SEQ ID NO.1所示)。序列比对发现菌株PD171与已发表的21个模式菌序列相似度高于物种区分的临界值98.65％，其中相似度最高的模式菌为Pseudomonas juntendi BML3T(99.79％)。基于16S rRNA基因序列构建的NJ系统进化显示，菌株PD171从属于假单胞菌属，且与Pseudomonas juntendi BML3(T)，Pseudomonasalloputida Kh7(T)，Pseudomonas parafulva NBRC 16636(T)和Pseudomonas fulva NBRC16637(T)等模式菌株具有最近的亲缘关系(图2)。
比较基因组学分析：基因组提取采用细菌基因组提取试剂盒(Magen)，后经16SrRNA基因扩增验证后由上海派森诺生物技术有限公司完成基因组测序，PE文库构建和上机测序均由其完成，测序采用Illumina Hiseq 2500平台。采用SPAdes v3.13.0完成下机数据的基因组组装。从NCBI数据库中搜集拟用于比较的已发表模式种的基因组序列，基于基因组序列采用FastANI计算平均核苷酸一致性(ANI)。采用在线工具GGDC 2.1(http://ggdc.dsmz.de/home.php)计算基于基因组序列的模拟DNA-DNA杂交值(dDDH)。菌株PD171的基因组大小约5.08Mb，GC含量60.62mol％。基于比较基因组分析结果如表2所示，菌株PD171与亲缘关系最近的21个已发表模式菌株的ANI值为77.73％～85.55％，显著低于目前公认的95％～96％ANI作为物种界限的阈值，而与之相应的dDDH值则分别为21.90％～29.90％，显著低于70％dDDH作为物种界限的阈值。这些证据表明菌株PD171代表了假单胞菌属的一个不同的新物种，本发明将该菌株PD171命名为解磷假单胞菌(Pseudomonasphosphatilytica)PD171，于2020年10月09日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为：GDMCC No：61233。
表2菌株PD171与21个近缘模式种的比较基因组分析
Figure BDA0002768256260000061
实施例3溶磷假单胞菌PD171在NBRIP培养基中溶磷能力分析
采用R2A液体培养基对溶磷假单胞菌PD171活化，30℃培养生长至对数期后按1％(v/v)的接种量接种到含40mL NBRIP液体培养基的三角瓶中，30℃摇床180r/min振荡培养，并以加入未接种溶磷假单胞菌PD171的灭菌R2A液体培养基作为对照，每个处理设置4个重复。从第3天开始，每隔24小时取样，监测至振荡培养7天。不同时间采集样品先经过12000r/min离心后，取上清用0.02μm的无菌滤膜过滤除菌后-30℃冷冻存储，待测定。采用钼锑抗比色法测定不同时间采集样品中的水溶性磷(ws-p)的含量，并用pH测定上清液的pH值变化，溶磷假单胞菌PD171溶磷量的计算中扣除了空白对照。
溶磷假单胞菌PD171对Ca3(PO4)2的溶解如图3所示，接种培养3天(图中的1，以此类推，因为是从第3天开始取样的)的溶磷量为438.37mg/L，上清液pH 3.82。接种培养第4天(图中的2，以此类推，因为是从第3天开始取样的)溶磷量达到最大值607.37mg/L，pH 3.36。此后尽管溶液pH仍有降低，但上清液中的可溶性磷含量逐渐减少，可能是菌株的繁殖不断消耗其中的可溶性磷。培养至第7天，上清液中的可溶性降至383.9mg/L，pH降至3.19。
R2A液体培养基：酵母提取物0.5g，蛋白胨0.5g，酸水解干酪素0.5g，葡萄糖0.5g，可溶性淀粉0.5g，K2HPO40.3 g，MgSO4·7H2O 0.05g，丙酮酸钠0.3g，ddH2O 1000mL，pH 7.0，将各成分混合均匀，调pH值，121℃灭菌20min备用。
NBRIP液体培养基：葡萄糖10g，Ca3(PO4)25g，MgCl2·6H2O 5g，MgSO4·7H2O 0.25g，KCl 0.2g，(NH4)2SO40.1 g，ddH2O 1000mL，pH 7.0，将各成分混合均匀，调pH值，121℃灭菌20min备用。
序列表
<110> 广东省微生物研究所(广东省微生物分析检测中心)
<120> 一种解磷假单胞菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1513
<212> DNA
<213> 解磷假单胞菌(Pseudomonas phosphatilytica)
<400> 1
gccctttacg gctaccttgt tacgacttca ccccagtcat gaatcacacc gtggtaaccg 60
tcctcccgaa ggttagacta gctacttctg gtgcaaccca ctcccatggt gtgacgggcg 120
gtgtgtacaa ggcccgggaa cgtattcacc gcgacattct gattcgcgat tactagcgat 180
tccgacttca cgcagtcgag ttgcagactg cgatccggac tacgatcggt tttgtgagat 240
tagctccacc tcgcggcttg gcaaccctct gtaccgacca ttgtagcacg tgtgtagccc 300
aggccgtaag ggccatgatg acttgacgtc acccccacct tcctccggtt tgtcaccggc 360
agtctcctta gagtgcccac cataacgtgc tggtaactaa ggacaagggt tgcgctcgtt 420
acgggactta acccaacatc tcacgacacg agctgacgac agccatgcag cacctgtgtc 480
agagttcccg aaggcaccaa tccatctctg gaaagttctc tgcatgtcaa ggcctggtaa 540
ggttcttcgc gttgcttcga attaaaccac atgctccacc gcttgtgcgg gcccccgtca 600
attcatttga gttttaacct tgcggccgta ctccccaggc ggtcaactta atgcgttagc 660
tgcgccacta aaatctcaag gattccaacg gctagttgac atcgtttacg gcgtggacta 720
ccagggtatc taatcctgtt tgctccccac gctttcgcac ctcagtgtca gtatcagtcc 780
aggtggtcgc cttcgccact ggtgttcctt cctatatcta cgcatttcac cgctacacag 840
gaaattccac caccctctac cgtactctag cttgccagtt ttgaatgcag ttcccaggtt 900
gagcccgggg ctttcacatc caacttaaca aaccacctac gcgcgcttta cgcccagtaa 960
ttccgattaa cgcttgcacc ctctgtatta ccgcggctgc tggcacagag ttagccggtg 1020
cttattctgt cggtaacgtc aaaacagcaa ggtattaact tactgccctt cctcccaact 1080
taaagtgctt tacaatccga agaccttctt cacacacgcg gcatggctgg atcaggcttt 1140
cgcccattgt ccaatattcc ccactgctgc ctcccgtagg agtctggacc gtgtctcagt 1200
tccagtgtga ctgatcatcc tctcagacca gttacggatc gtcgccttgg tgagccatta 1260
cctcaccaac tagctaatcc gacctaggct catctgatag cgcaaggccc gaaggtcccc 1320
tgctttctcc cgtaggacgt atgcggtatt agcgttcctt tcgaaacgtt gtcccccact 1380
accaggcaga ttcctaggca ttactcaccc gtccgccgct gaatcaagga gcaagctccc 1440
gtcatccgct cgacttgcat gtgttaggcc tgccgccagc gttcaatctg agccatgatc 1500
aaactctaag ggc 1513

Claims (5)

1.解磷假单胞菌(Pseudomonas phosphatilytica)PD171，保藏编号为：GDMCC No：61233。
2.权利要求1所述的解磷假单胞菌PD171在制备溶解无机磷制剂中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的溶解无机磷制剂是微生物菌剂或生物肥料。
4.一种溶解无机磷制剂，其特征在于，含有权利要求1所述的解磷假单胞菌PD171作为活性成分。
5.根据权利要求4所述的溶解无机磷制剂，其特征在于，所述的溶解无机磷制剂是微生物菌剂或生物肥料。
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