CN115725458A - 一种高效解钾活性链霉菌属放线菌及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高效解钾活性链霉菌及其用途，所述高效解钾活性链霉菌经鉴定为五原链霉菌（Streptomyces wuyuanensis），菌株名为KLBMP9348，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏日期为2022年08月24日，保藏编号为GDMCC NO：62737。与现有技术相比，本发明提供的高效解钾活性链霉菌KLBMP9348，生长特性较好，易培养，是一株多功能菌株，具有较高的解钾活性，还具有解磷、产植物激素和抑制植物黑斑病的特点。因此，能够用于制备解钾、解磷、产植物激素和抑制植物黑斑病产品，如微生物肥料等，综合性能好，具有良好应用前景和市场价值。

Description

一种高效解钾活性链霉菌属放线菌及其用途

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种高效解钾活性链霉菌及其用途。

背景技术

元素K通常以经济农作物的品质元素著称，与N、P合为甘薯生长发育必需的三大营养要素，是农业生产的重要支柱之一，主要用于制造农业所需钾肥。钾素能增强经济作物的抗病虫害、抗倒伏、抗旱和抗寒等抗逆能力，从而提高作物的产量和品质。全球钾资源分布极不均衡，其中加拿大、白俄罗斯、俄罗斯是钾盐资源最多的国家。中国非常规钾资源储量丰富，查明难溶性钾资源储量如明矾石、钾长石等达3000亿吨。但中国可溶性钾盐紧缺，探明的可溶钾资源以盐湖卤水矿为主，主要分布在青海柴达木盆地盐湖卤水中。钾盐资源短缺已威胁到中国资源安全并制约了农业发展。如果能够加大对钾元素的转化、开发和利用，生产企业与研究人员继续加大技术研发力度，积极改进创新相关的提钾工艺技术，就可以提高国产钾盐的产量。

微生物是地球上最古老的生物，至少有41亿年的历史，与矿物的相互作用在地球岩石圈表层系统中广泛发生。矿物岩石可为微生物提供能源、微营养及代谢活动所需的电子受体等；反过来，微生物的代谢活动促进矿物的溶解和沉淀过程，对诸多无机及有机元素的地球化学循环进而对环境产生了深远的影响。所有能够风化含钾矿物的细菌都可以被称之为钾矿物溶解细菌，其中最重要的一个类群就是硅酸盐细菌 (Silicate bacteria)，首次由学者亚历山大罗夫和扎克直接从土壤中分离并发现其能够活化硅酸盐矿物中钾元素能力。解钾菌被发现以来，对其解钾机理存在着各种各样的研究结论，如酸解，胞外多糖，细菌-矿物中复合体的形成等。酸解过程是草酸、柠檬酸、酒石酸等小分子有机酸以及氨基酸进行酸溶作用，以及有机分子的络合作用。胞外多糖途径是微生物分泌的荚膜多糖和胞外多糖对矿物进行风化，破坏矿物晶格。细菌-矿物复合体的形成是细菌的铁载体在风化钾矿物过程中可以加快矿物表面腐蚀坑的形成，鳌合矿物表面的金属离子，破坏矿物的晶格结构，促进矿物分解。有的丝状微生物如蓝细菌、放线菌和真菌等微生物类群的菌丝甚至可以产生穿透矿物岩石作用。

国内外学者相继分离获得了许多其它钾矿物溶解功能细菌。细菌Burkholderiaglathei可以加速黑云母矿物的风化，释放植物可吸收的镁和钾元素，对松树具有显著的促生作用。来源于风沙土棉花根际的根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)也能明显提高钾素的释放。钾矿区的矿物土壤中存在着大量的矿物分解细菌，主要集中归类于泛菌属(Pantoea)，沙雷氏菌属(Serratia)及假单胞菌属(Pseudomonas)。放线菌也可以风化含钾矿物。如链霉菌(Streptomyces)BM-2具有固氮和解有机钾活性，能够产生ACC脱氨酶、铁载体和IAA。陕西链霉菌(Streptomyces shaanxiensis)的解钾率约为20％。阿氏肠杆菌(Enterobacter asburiae)能明显提高钾素释放，并且作为菌剂应用于烤烟使可显著提高烤烟产量。

在农业上解钾菌主要是作为微生物制剂的主要成分进行施用，其主要作用有提高土壤肥力、促进作物生长、保护生态环境等。诸多试验证明，解钾菌可以增加土壤中速效元素的含量并且提高土壤酶活性。杨冬艳等实验结果表明，解钾菌的施用不仅显著增加了土壤速效钾含量，同时对于土壤磷元素的释放效果优于溶磷菌。刘晓倩等研究表明，解钾菌处理使土壤过氧化氢酶、脲酶、蔗糖酶和酸性磷酸酶4种生物酶类活性分别比对照提高了40.2％、95.6％、119.4％和29.0％。解钾菌可提供作物生长的营养成分、促进作物生长、改善作物品质等。郗蓓蓓等实验结果表明，钾细菌能提高作物种子发芽率、株高、鲜质量和干质量，并且可以分泌生长素、蛋白酶，具有抑菌作用。丛枝菌根真菌(AMF)对NASPOT 11号品种的甘薯有增产能力。放线菌UAE1通过增加游离多胺和其他植物生长激素来促进盐生植物盐角草的生长。链霉菌(Streptomyces)提高了鼠李幼苗对NPK的吸收和抗旱性。

在用于生物促生和防治的微生物中，针对解磷固氮功能的研究居多，而解钾功能的研究较少。另外，放线菌在解钾方面的研究也较少。因此，开发一株可活化钾、磷元素兼具产植物激素、抗病害的功能放线菌菌株对土壤修复、促进植物生长、防治植物病害以及保证粮食安全等都具重大意义。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明目的是提供一种高效解钾活性链霉菌及其用途，该菌株具有较高的解钾活性，还具有解磷、产植物激素和抑制植物黑斑病的特点，可用于制备微生物肥。

技术方案：为了达到上述发明目的，本发明所采用的技术方案如下：

一种高效解钾活性链霉菌，经鉴定为五原链霉菌(Streptomyces wuyuanensis)，菌株名为KLBMP9348，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏日期为2022年8月24日，保藏编号为GDMCCNO：62737。

上述高效解钾活性链霉菌是从徐州丰县钾矿区风化岩土中分离筛选出解钾菌KLBMP9348，并对其进行研究和扩大培养。本发明保藏的高效解钾活性链霉菌 KLBMP9348菌落的特征为：菌落呈灰白色，表面褶皱、干燥、不透明、呈粉质状，扫描电镜检查显示KLBMP9348孢子链呈松散螺旋形，孢子表面光滑。

所述高效解钾活性链霉菌KLBMP9348的16S基因序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了所述的高效解钾活性链霉菌在制备解钾产品中的应用。

本发明还提供了所述的高效解钾活性链霉菌在制备解磷产品中的应用。

本发明还提供了所述的高效解钾活性链霉菌在制备产植物激素产品中的应用。

本发明还提供了所述的高效解钾活性链霉菌在制备抑制植物黑斑病产品中的应用。

优选的，所述植物黑斑病为甘薯黑斑病。

优选的，所述产品为微生物肥料。

本发明还提供了一种组合物，包含所述的高效解钾活性链霉菌。

本发明最后提供了所述的组合物在制备解钾、解磷、产植物激素和抑制植物黑斑病产品中的应用。

有益效果：与现有技术相比，本发明提供的高效解钾活性链霉菌KLBMP9348，生长特性较好，易培养，是一株多功能菌株，具有较高的解钾活性，还具有解磷、产植物激素和抑制植物黑斑病的特点。因此，能够用于制备解钾、解磷、产植物激素和抑制植物黑斑病产品，如微生物肥料等，综合性能好，具有良好应用前景和市场价值。。

附图说明

图1为本发明所述的高效解钾活性链霉菌KLBMP9348在ISP2培养基上的菌落形态图和菌体形态图。

图2为基于16S rDNA基因序列构建的KLBMP9348系统发育树

图3为本发明所述的高效解钾活性链霉菌KLBMP9348解钾能力测试结果以及电镜图。

图4为本发明所述的高效解钾活性链霉菌KLBMP9348解磷能力测试结果。

图5为本发明所述的高效解钾活性链霉菌KLBMP9348产多胺能力测试结果。

图6为本发明所述的高效解钾活性链霉菌KLBMP9348产吲哚乙酸能力测试结果。

图7为本发明所述的高效解钾活性链霉菌KLBMP9348拮抗甘薯黑斑病菌图。

具体实施方式

通过以下实施例进一步对本发明进行进一步阐述。这些实施例完全是例证性的，他们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实验例1

一种高效解钾活性链霉菌Streptomyces wuyuanensis，简称KLBMP9348，该菌株具有解钾解磷又有产植物激素功能，还可以抑制甘薯黑斑病的特点，可用于制备微生物肥料，该菌株已于2022年8月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为 GDMCC NO：62737，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学院微生物研究所。

其中，本发明实施例所用的其他试剂均为分析纯。

本发明中的高效解钾活性链霉菌KLBMP9348是从江苏省徐州市丰县残矿区土壤中分离得到的。具体步骤如下：

(1)菌株的筛选和培养：土壤样品在实验室无菌风干后，取2g样品于无菌三角瓶中，100℃烘干1h，冷却后加无菌水18mL，充分混匀制成土壤悬液。土壤悬液梯度稀释100和1000倍，吸取200μL涂布平板，超净台正置20min，培养箱倒置， 28℃培养28d。28d后挑取单菌落，转接ISP 2(培养基纯化，28℃培养7-14d。

(2)菌株保藏：

a.甘油管保藏法：甘油10mL，蒸馏水40mL于100mL三角瓶中，摇匀，灭菌。1mL/冻存管无菌分装，挑取菌落，冻存管壁碾碎菌体，溶到甘油水溶液中，每个菌种保存三管，按编号顺序放置冻存盒中，-20和-80℃保藏。

b.脱脂奶粉冷冻干燥法：

冻存管：2％盐酸浸泡8h，再经自来水冲洗多次，用蒸馏水涮洗2次，烘干，管口塞好棉塞签，121℃灭菌15min，烘干。

保护剂：蒸馏水100mL，预热到80℃左右，加入脱脂奶粉15％，混匀，115℃灭菌15min，冷却备用。

挑取菌落于冻存管，碾碎，滴加1mL保护剂，混匀，吸取滴至冻存管底部。依次 4℃，-20℃保存30min，-80℃冻存8h。冷冻干机冻干8h，酒精喷灯火焰熔融封口，4℃长期保藏。

(3)菌株形态特征及生理生化特征

形态特征：菌落呈灰白色，表面褶皱、干燥、不透明、呈粉质状，其在ISP2培养基上的菌落形态见图1。

生理生化特征结果如表1:

表1菌株生理生化特征

注：“+”阳性；“-”阴性

(4)菌株DNA提取

a.用无菌竹签挑取适量少许菌体(尽量避免agar)，于无菌的EP管，碾碎(竹签粗头)，-20℃保藏。

b.试剂：

洗涤液：50mmol/L Tris，pH 7.7，25mmol/L EDTA，0.1％PVP。(Tris 1.21g，EDTA1.46 g，PVP 0.2g，蒸馏水200mL，pH 7.7，灭菌，常温保存。)

裂解液：50mmol/L Tris，pH 8.0，25mmol/L EDTA，3％SDS，1.2％PVP。(Tris0.605g，EDTA0.73 g，SDS3 g，PVP 1.2g，蒸馏水100mL，pH 8.0，灭菌，常温保存。)

抽提液：10mmol/L Tris，pH 8.0，1mmol/L EDTA，0.3mol/L NaAc，1.2％PVP。(Tris0.06 g，EDTA 0.0146g，蒸馏水50mL，pH 8.0，灭菌，常温保存。)

苯酚:氯仿:异戊醇＝25:24:1(现配现用)。

70％乙醇(现配现用)。

c.提取步骤

①加洗涤液(含溶菌酶终浓度2mg/mL)1mL，37℃摇瓶1h。

②6000r/min离心2min，弃上清，加入35μL裂解液，振荡悬浮，并于微波炉 (中火)处理45sec。

③加入400μL抽提液(65℃预热),振荡5s。

④加入500μL(等体积)的苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)溶液抽提，震荡，10000 r/min离心5min，缓慢吸取上清200μL转0.5mL EP管。

⑤加入200μL(等体积)的苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)溶液抽提，震荡，10000 r/min离心5min，缓慢吸取上清100μL转0.5mL EP管。

⑥加100μL异丙醇，-20℃静置30min，10 000r/min离心5min。

⑦用70％乙醇200μL洗涤，10000r/min离心5min，缓慢倾倒上清，重复2次。

⑧65℃水浴锅上烘干，加20μL无菌蒸馏水(分子实验用)，4℃保存。

(5)菌株鉴定

16S rDNA基因PCR扩增：

正向Prime A：5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3'(E.coli的7～24位碱基)

反向Prime B：5'-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'(E.coli的1540～1522位碱基)

PCR反应体系如表2所示：

表2 PCR反应体系

反应程序如表3:

表3反应程序表

PCR扩增细菌16S rDNA序列，扩增产物测序后与EzBioCloud中已知16S rDNA 序列比对分析，将鉴定为Streptomyces属。

实验例2

所述高效解钾活性链霉菌KLBMP9348用于溶解钾长石粉，可提高培养液的钾离子含量，处理方法如下：

(1)选取分离培养基中的单菌落，接种至改良解钾培养基。改良解钾培养基配方为：葡萄糖5.0g/L，Na₂HPO₄ 2.0g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，Na₂HPO₄ 2.0g/L，FeCl₃ 5.0mg/L，CaCO₃ 0.1g/L，钾长石粉1.0g/L，琼脂20.0g/L，pH7.0，培养基中添加100mg/L BTB显色剂。钾长石粉的预处理：钾长石粉过1000目筛，去离子水浸泡过夜后用20％盐酸溶液淋洗，再用超纯水超声波清洗数次，直至溶液pH呈中性，烘干干燥保存。

(2)接种后的平板倒置放于28℃恒温箱中培养3-7天，观察是否有黄色解钾圈的形成。

(3)将初筛后的链霉菌制成孢子液(1×10⁸CFU/mL)，按10％的接种量接种到种子液中活化。

(4)将种子液按2％的接种量接种到Aleksandrov培养基中，28℃，180r/min培养14天。Aleksandrov培养基配方为MgSO₄·7H₂O 0.5g/L,CaCO₃0.1 g/L、FeCl₃ 5.0 mg/L、Ca₃(PO₄)₂2.0g/L、钾长石粉5.0g/L、葡萄糖5.0g/L、(NH₄)₂SO₄ 5.0g/L。

(5)测定培养后上清液钾离子含量。

结果如图3所示，本发明所述的KLBMP9348提高了培养液中钾离子含量，有很强的实用性。经过测定，本实施例中钾离子含量为13.267μg/mL。

实验例3

所述高效解钾活性链霉菌KLBMP9348用于溶解无机磷，可提高培养液的磷酸根含量，处理方法如下：

(1)将分离纯化的菌株用灭菌的竹签接种到改良无机磷培养基(NBRIP)平板上，平板上划3条菌苔，28℃培养5-7天后，观察是否有透明圈出现。改良NBRIP培养基配方：葡萄糖5.00g/L，MgCl·6H₂O 5.00g/L，MgSO₄·7H₂O 0.25g/L，(NH₄)₂SO₄ 0.10 g/L，KCl 0.20g/L，FeSO₄·7H₂O 0.01g/L，Ca₃(PO₄)₂ 5.00g/L，pH 7.0-7.4，添加溴酚蓝作为显色剂。

(2)供试菌接入50mL NBRIP液体培养基，28℃，180r/min，培养5d后，将菌液10000rpm离心10min，测量上清液pH值，取上清液1.25mL，加入到含有2.5mL 钼锑抗比显剂的试管中，慢慢摇动试管排出液体中的CO₂，并用去离子水定容至10 mL，摇匀后静置30min于730nm处比色，将测量的吸光值带入标准曲线公式中，计算出磷酸产量。

结果如图4所示，本发明所述的KLBMP9348提高了培养液中磷酸根浓度，经过测定，本实施例中磷酸根浓度为1.572μg/mL。因此，9348具有水解无机磷的能力。

实验例4

所述高效解钾活性链霉菌KLBMP9348可产生多胺，处理方法如下：

(1)将菌株接种到0.2g/L酚红改良的Moeller脱羧酶琼脂培养基中，28℃在黑暗中培养5-7天，观察菌落下方和周围产生是否暗红色圈。Moeller脱羧酶琼脂培养基配方：蛋白胨5.0g/L，酵母膏3.0g/L，葡萄糖1.0g/L，吡哆醛-5-磷酸5.0mg/L，L-精氨酸2.0g/L，琼脂15.0g/L，pH 6.5。

(2)将菌株制成孢子悬浮液(1×10⁸CFU/mL)，把2mL孢子液接种到50mL多胺液体培养基中，180rpm转速在28℃下培养5天。取500μL上清液加入10mL带盖塑料离心管中，加入100μL苯甲酰氯，再加入1mL 2mol/L NaOH溶液，涡漩20s 后在37℃水浴反应20min。加入2mL饱和NaCl溶液，混匀后用2mL乙醚萃取，然后离心(3000r)5分钟。取1mL醚相到2mL离心管中，真空干燥后用1mL甲醇涡旋溶解，过0.45μm滤膜，滤液进行高效液相测定。

结果如图5所示，本发明所述的KLBMP9348产多胺能力较强，有很强的实用性。

实验例5

所述高效解钾活性链霉菌KLBMP9348可产生吲哚乙酸，处理方法如下：

(1)有氮培养基：葡萄糖10.0g/L,(NH₄)₂SO₄ 1.0g/L，K₂HPO₄ 2.0g/L， MgSO₄·7H₂O0.5g/L，NaCl 0.1g/L，酵母膏0.5g/L，CaCO₃ 0.5g/L，pH 7.2。

(2)Sackowski’s显色剂：150mL浓硫酸溶于250mL去离子水中，加入7.5mL 0.5mol/L FeCl₃·6H₂O溶液。

(3)色氨酸配成2.5mg/mL的溶液，过滤除菌。有氮培养液分装于试管中，每管 4mL，121℃高压灭菌后加入过滤除菌的色氨酸溶液1mL，使Trp的浓度为 0.5mg/mL。挑取菌株接种于上述培养液中，摇床培养4d，用无菌枪头取出1mL菌液于7mL灭菌的离心管中，加入2mLSackowski’s显色剂充分混合，室温下显色 20min，出现粉红色为阳性说明有IAA产生。

结果如图6所示，本发明所述的KLBMP9348可以产吲哚乙酸，有一定的实用性。

实验例6

把KLBMP9348接种到已生长了甘薯黑斑病原菌的PDA平板，28℃培养3d-5d，观察是否产生抑菌现象。

由图7可见，KLBMP9348可以拮抗甘薯黑斑病原菌长喙壳菌(Ceratocytisfimbriata) 的生长。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种高效解钾活性链霉菌，其特征在于，经鉴定为五原链霉菌(Streptomyceswuyuanensis)，菌株名为KLBMP9348，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏日期为2022年8月24日，保藏编号为GDMCC NO：62737。

2.根据权利要求1所述的高效解钾活性链霉菌，其特征在于，所述五原链霉菌KLBMP9348的16S基因序列如SEQ ID NO.1所示。

3.权利要求1所述的高效解钾活性链霉菌在制备解钾产品中的应用。

4.权利要求1所述的高效解钾活性链霉菌在制备解磷产品中的应用。

5.权利要求1所述的高效解钾活性链霉菌在制备产植物激素产品中的应用。

6.权利要求1所述的高效解钾活性链霉菌在制备抑制植物黑斑病产品中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述植物黑斑病为甘薯黑斑病。

8.根据权利要求3-7所述的应用，其特征在于，所述产品为微生物肥料。

9.一种组合物，包含权利要求1所述的高效解钾活性链霉菌。

10.权利要求9所述的组合物在制备解钾、解磷、产植物激素和抑制植物黑斑病产品中的应用。

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