CN117683652A - 一株解磷弗拉特氏菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株解磷弗拉特氏菌及其应用。本发明的解磷弗拉特氏菌(Frateuria sp.)GZRe12于2022年5月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏号为：GDMCCNo：62474。本发明公开的解磷弗拉特氏菌为该属的新物种，能够有效溶解难溶性的无机磷(Ca3(PO4)2)，培养5d的溶磷量高达495.05±11.58mg/L，解磷性能显著优于大多数已报道的解磷菌株。因此，本发明公开的解磷弗拉特氏菌GZRe12可用于提高土壤中磷素的有效性，在促进植物生长发育，制备微生物菌剂和生物肥料等方面具有重要的应用潜力。
Description
技术领域
本发明属于农业微生物技术领域，具体涉及一种解磷弗拉特氏菌及其应用。
背景技术
磷是农作物生长不可或缺的第二大量元素，在植物生长发育及代谢过程中发挥着重要作用，是制约农作物产量与品质的重要因子。我国耕地土壤中磷素含量丰富，但其中95％的磷元素以矿物态存在，能够被作物吸收利用的有效态磷含量极低，耕地土壤面临长期缺磷的状态。外施磷肥的利用率仅占10％～15％，绝大部分磷素都被土壤中阳离子，例如Ca2+、Fe3+、Al3+等螯合固定形成了难溶态的正磷酸盐化合物，无法被植物吸收；此外，长期过量施用磷肥还会造成严重的水体富营养化。如何充分活化土壤中固定态的磷，提高作物对磷的吸收效率，减少磷肥的施用，是现代绿色农业发展面临的重要课题。
解磷细菌(Phosphate-solubilizing bacterial)是一类能够提高土壤种难溶性磷的生物有效性细菌，其能通过分泌有机酸、胞外酶等方式将土壤中的难溶性磷活化，提高土壤有效磷的含量，促进植物对磷素的吸收和利用，从而提高植物的产量，在农业生产中有着重要的应用潜力。据统计，解磷细菌占土壤可培养细菌的40％左右。现有研究显示，已分离到的解磷细菌主要集中在厚壁菌门、变形菌门和放线菌门的30个属中，如芽胞杆菌(Bacillus)、类芽胞杆菌(Panebacillus)、链霉菌属(Streptomyces)、假单胞菌(Pseudomonas)、根瘤菌(Rhizobium)、伯克霍尔德氏菌(Burkholderia)、微杆菌(Microbacterium)等，这些解磷细菌不仅可以提高作物对磷的吸收利用，促进植物生长发育，还能促进土壤中有益微生物的代谢活动，改善植物根际的微生态环境。因此，通过利用土壤中的解磷细菌来调控土壤-植物的磷素循环是一种极佳的方式。
不断发掘作物根际高效的解磷细菌新资源，研发相关微生物菌剂、微生物肥料等产品，通过解磷微生物将土壤中难溶态磷转化为植物可吸收利用的有效磷，对于提高磷肥利用率和改善植物的磷营养状况具有重要的意义，有助于推动绿色农业的高质量发展。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够有效溶解无机磷的弗拉特氏菌属的解磷细菌新物种(Frateuria sp.)GZRe12，该菌株于2022年5月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址为广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编为：510070，其保藏号为：GDMCC No：62474。
本发明的第二个目的是提供解磷弗拉特氏菌GZRe12在制备溶解无机磷制剂中的应用。
本发明的第三个目的是提供一种溶解无机磷制剂，其中含有解磷弗拉特氏菌GZRe12作为主要活性成分。
优选，所述解无机磷制剂可以为微生物菌剂或有机生物肥料等。
本发明相对于现有技术具有以下优点：
1)本发明提供的解磷弗拉特氏菌GZRe12是不同于其他解磷细菌的弗拉特氏菌属的新物种；
2)解磷弗拉氏菌GZRe12在无机磷液体培养基中培养5d溶解无机磷的量高达495±11.58mg/L，解磷能力强于大多数已报道的细菌。因此，本发明公开的解磷弗拉氏菌GZRe12可用于溶解土壤中难溶性的无机磷，提高可溶性磷的含量，在制备微生物菌剂、有机生物肥料及促进农作物生长等方面具有广阔的应用前景。
Rhodanobacter sp.GZRe12于2022年5月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址为广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编为：510070，其保藏号为：GDMCC No：62474。
附图说明
图1为本发明中解磷弗拉特氏菌GZRe12在R2A平板上的形态。
图2为本发明中解磷弗拉特氏菌GZRe12的细胞透射电镜观察图，标尺为5μm。
图3为本发明中解磷弗拉特氏菌GZRe12的16S rRNA基因系统进化树。
图4为本发明中解磷弗拉特氏菌GZRe12的基因组系统进化树。
图5为本发明中解磷弗拉特氏菌GZRe12在无机磷平板上的解磷透明圈。
图6为本发明中解磷弗拉特氏菌GZRe12解磷效果及培养液pH变化。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
下面结合实施例对本发明作进一步说明，下述实施例中试验方法如无特殊说明，均为常规试验方法，下述实施例中所述的实验试剂及耗材如无特殊说明，均来自常规生化试剂公司。
实施例1解磷弗拉特氏菌GZRe12的分离纯化
1、分离及筛选培养基
R2A琼脂培养基(g/L青岛海博生物HB0167-5)：酵母浸出粉0.5g、蛋白胨0.5g、酪蛋白水解物0.5g、葡萄糖0.5g、琼脂粉0.5g，可溶性淀粉0.5g，磷酸氢二钾0.3g，无水硫酸镁0.024g，丙酮酸钠0.3g，琼脂15g，使用时称取上述培养基15.2g，加热溶解于1L蒸馏水中，121℃高压蒸汽灭菌15min，备用。
无机磷细菌培养基(Inorganic phosphorus bacteria，g/L，青岛海博生物，HB8670)：葡萄糖10.0g，硫酸铵0.5g，酵母浸粉0.5g，氯化钠0.3g，氯化钾0.3g，硫酸镁0.3g，硫酸亚铁0.03g，硫酸锰0.03g，磷酸钙5.0g，琼脂粉15g，pH 7.0-7.5，使用时称取上述培养基32g，加热溶解于1L蒸馏水中，121℃高压蒸汽灭菌15min，备用。
2、实验步骤
(1)样品采集：从广东省广州市华南农业大学农场采集常年种植番茄的土壤样品，装入采样袋中带回实验室在室温下自然风干。
(2)土壤梯度稀释液准备，称取10g土壤，加入到事先加有玻璃珠和90mL无菌水的灭菌三角瓶中，于30℃摇床上200rpm震荡培养30min。静置5min后取1mL上清液加入到事先装有9mL灭菌水的试管中，依次进行梯度稀释至10-2-10-7g/mL的土壤悬浮液备用。
(3)解磷细菌分离：分别取100μL稀释好的土壤菌悬液(10-2-10-7g/mL)，用一次性塑料涂布棒均匀涂布在无机磷细菌培养基平板上，每个浓度设置三个重复，涂布完成后将平板倒置放于30℃恒温培养箱中培养。隔天观察平板上菌落的生长情况，挑取产生透明圈的不同形态的菌株在R2A固体平板上划线，对菌株进行纯化，最终分离获得菌株GZRe12。
实施例2.菌株GZRe12的分类鉴定
参考《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠主编科学出版社)对分离菌株进行鉴定。
(1)表型特征：
将菌株GZRe12采用三区划线法接种于R2A培养基上，30℃培养3d后观察其菌落形态。挑取培养的菌落进行革兰氏染色并利用光学显微镜进行形态观察，制备透射电镜观察样本，采用日立的Hitachi H7650透射电镜观察菌株的细胞形态。硝酸盐还原、亚硝酸盐还原、吲哚产生、发酵右旋糖葡萄糖等测试采用API 20NE试剂条(法国梅里埃生物)进行。
菌株GZRe12在R2A培养基上呈暗黄色，单菌落呈圆形，表面光滑，边缘整齐，无流动性。菌株GZRe12革兰氏染色为阴性，透射电镜下细胞呈短杆状，无鞭毛(图1)。发酵右旋糖葡萄糖、左旋精氨酸二水解酶和脲酶为阳性，硝酸盐还原、亚硝酸盐还原、吲哚产生、β-葡萄糖苷酶、水解明胶和β-半乳糖苷酶均为阴性(表1)。
表1菌株GZRe12的表型特征
(2)系统进化分析：
通过水煮法提取菌株GZRe12的DNA，利用细菌的16S rDNA特异性引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGACTTAACCCCAATCGC-3′)和Taq酶对GZRe12的16S rDNA基因序列进行扩增，扩增产物经电泳分析产生约1500b左右的条带，切胶回收该条带后送苏州金唯智生物科技有限公司进行sanger测序，测序得到的序列经DNAMAN软件拼接后获得16S rDNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，提交至EzBioClode网站(https://www.ezbiocloud.net/)进行鉴定。采用MEGA10软件构建基于16S rRNA序列的Neighbor Joining系统发育进化树，计算模型为Kimura 2-paremeter。通过Sanger测序获得的菌株GZRe12的16S rRNA基因的全长为1421bp(SEQ ID NO.1)。序列比对发现菌株GZRe12与已发表的模式菌序列相似度低于物种区分的临界值98.65％(表2)，其中相似度最高的模式菌为Frateuria edaphi KACC 16945T(98.59％)。基于16S rRNA基因序列和基因组序列构建的进化树显示，菌株GZRe12从属于弗拉特氏菌属，且与Frateuria edaphi KACC16945T、Frateuria soli KACC 16943T和Frateuria flava MAH-13T等模式菌具有最近的亲缘关系(图3)。综上，根据16S rRNA基因序列和形态特征结果，将菌株GZRe12鉴定为弗拉特氏菌属(Frateuria)的潜在新物种。
(3)比较基因组学分析：
菌株GZRe12的基因组DNA采用细菌基因组DNA提取试剂盒(Magen)进行提取，后经16S rRNA基因扩增验证后由上海美吉生物科技有限公司完成基因组测序，双端文库构建和Illumina Hiseq 2500测序均委托该公司完成。下机数据利用SPAdes(3.13.0)软件进行基因组序列拼接组装。从NCBI数据库中下载拟用于比较分析的已发表的模式种的基因组序列，基于基因组序列利用FastANI计算各菌株的平均核苷酸一致性(ANI)。采用在线工具GGDC 2.1(http://hhdc.dsmz.de/home.php)计算基于基因组序列的DNA-DNA杂交值(dDDH)。利用UBCG构建基因组ML系统发育树。菌株GZRe12的基因组大小约3.59Mb，GC含量为67.8mol％。基因组进化分析结果与16s rRNA基因序列进化分析结果相一致，显示菌株GZRe12从属于弗拉特氏菌属(图4)。基于基因组序列的比较分析结果见表2，菌株GZRe12与亲缘关系最近的已发表的模式菌株之间的ANI值和dDDH分别为78.1％～93.6％和20.7％～51.1％，显著低于目前公认的95％～96％ANI和70％dDDH作为物种界限的阈值。这些结果表明菌株GZRe12代表了弗拉特氏菌属的一个不同的新物种，本发明将该菌株GZRe12命名为解磷弗拉特氏菌(Frateuria sp.)GZRe12，于2022年5月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编为：510070，其保藏号为：GDMCC No：62474。
表2菌株GZRe12与已发表的6个近源模式种的比较基因组分析
实施例3：解磷弗拉特氏菌GZRe12解无机磷效能分析
在R2A固体平板上活化解磷弗拉特氏菌GZRe12甘油菌，30℃培养2d，挑取单菌落接种到含有5mL R2A液体培养基的试管中，然后置于30℃，200rpm的水平摇床上摇菌，待菌生长至对数期后按1％(v/v)的接种量接种到含100mL以Ca3(PO4)2为无机磷源的无机磷液体培养基(测磷细菌解磷效能)中，30℃，200rpm震荡培养5d，以加入未接种菌株GZRe12的灭菌的R2A培养基的处理为对照，每个处理设置三个生物学重复。测定时取10mL样品12000rpm离心2min，用0.22μm的滤器过滤除菌后测定培养液pH和其中的可溶性磷(ws-p)含量，本研究中采用钼锑抗比色法测定培养液中的可溶性磷的含量，最终溶磷量的计算需要扣除空白对照。
无机磷培养基(不含琼脂，用于测定磷细菌解磷效能，Norganic PhosphorusBacteria，g/L，青岛海博生物，HB8670-1)：葡萄糖10.0g，硫酸铵0.5g，酵母浸粉0.5g，氯化钠0.3g，氯化钾0.3g，硫酸镁0.3g，硫酸亚铁0.03g，硫酸锰0.03g，磷酸三钙5.0g，pH 7.0-7.5，使用时称取上述培养基17g，加热溶解于1L蒸馏水中，121℃高压蒸汽灭菌15min，备用。
解磷弗拉特氏菌GZRe12对无机磷的溶解结果如图5所示，可以看到在菌落周围出现了明显的透明圈，表明菌株GZRe12具有溶解难溶性无机磷的能力；定量测定结果显示，接种培养5d后，菌株GZRe12溶解无机磷的量为495.05±11.58mg/L(图6)。
SEQ ID NO.1
TAAACATGCAAGTCGAACGGCAGCACAGGGGAGCTTGCTCCCTGGGTGGCGAGTGGCGGACGGGTG
AGTAATGCATCGGGACCTGCCCAGACGTGGGGGATAACGTAGGGAAACTTACGCTAATACCGCATACG
TCCTACGGGAGAAAGCGGGGGACCTTTTAGGCCTCGCGCGGTTGGATGGACCGATGTTCGATTAGCTT
GTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCGATAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACT
GGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAA
GCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTTATCAGGAGCG
AAATACTACCGGTTAATAACCGGTGGGGCTGACGGTACCTGAGGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTGC
CAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGTAGG
CGGTTTGTTAAGTCTGTTGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAATGGCAATGGATACTGGCAAGCTA
GAGTGTGTCAGAGGATGGTGGAATTCCCGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCGGGAGGAACATC
AGTGGCGAAGGCGGCCATCTGGGACAACACTGACGCTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAG
GATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGCGAACTGGATGTTGGTCTCAACTCGGAGATCA
GTGTCGAAGCTAACGCGTTAAGTTCGCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAA
TTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCT
GGCCTTGACATGTCTGGAATCCTGCAGAGATGCGGGAGTGCCTTCGGGAACCAGAACACAGGTGCTG
CATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCT
TAGTTGCCAGCACGTAATGGTGGGAACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGG
GATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCAGGGCTACACACGTACTACAATGGTCGGTACAGAGG
GTTGCAATACCGCGAGGTGGAGCCAATCCCAGAAAGCCGATCCCAGTCCGGATCGAAGTCTGCAACT
CGACTTCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCTATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGC
CTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGAGTTGCTCCAGAAGCCGTTAGTCTAACCGCAAGG
GGACGACGACC。
Claims (5)
1.一株解磷弗拉特氏菌(Frateuria sp.)GZRe12，其特征在于，保藏号为：GDMCC No：62474。
2.权利要求1所述的解磷弗拉特氏菌GZRe12在制备溶解无机磷制剂中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的溶解无机磷制剂是微生物菌剂或生物肥料。
4.一种溶解无机磷制剂，其特征在于，其含有权利要求1所述的解磷弗拉特氏菌GZRe12作为活性成分。
5.根据权利要求4所述的溶解无机磷制剂，其特征在于，所述溶解无机磷制剂释微生物菌剂或生物肥料。
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