CN110684699A - 一株纤维化纤维微细菌dgnk-jj1及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株纤维化纤维微细菌(Cellulosimicrobium cellulans)DGNK‑JJ1，其于2019年8月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编510075，保藏编号为GDMCC NO：60749。本发明从中药渣堆肥后土壤的土样中，分离筛选出能高效解钾的细菌DGNK‑JJ1，并对其进行鉴定，为解钾菌肥生产提供有效菌种，可以避免或减轻生态环境问题和农产品质量安全问题，有助于发展生态农业。

Description

一株纤维化纤维微细菌DGNK-JJ1及其应用
技术领域
本发明涉及农业生物技术领域，尤其是一株纤维化纤维微细菌(Cellulosimicrobium cellulans)DGNK-JJ1及其应用。
背景技术
钾是植物生长发育必需的营养元素，土壤中钾的供应直接影响作物的产量和品质。土壤中的钾含量丰富，但多以植物极难吸收的难溶矿物态存在，作物可直接吸收利用的速效钾一般在40mg/kg-200mg/kg之间，只占全钾的1％-5％，不能满足作物的需要。我国土壤中磷、钾的形态主要是不易被作物吸收利用的难溶性磷及矿物态钾，能供植物直接吸收利用的磷、钾资源极其有限。为实现作物的增产增收，农业生产中长期使用大量钾肥，容易造成土壤板结、环境污染、农药残留等一系列的生态环境问题和农产品质量安全问题。
解钾微生物(potassium bacteria)是指能分解土壤中的硅铝酸盐等矿物，将难溶性的钾、磷、硅转变为可溶性状态供植物吸收利用的一类微生物，其所产生的激素、氨基酸、多糖等物质促进作物的生长。如果能找到一种溶钾细菌，利用该溶钾细菌制作生物肥料施到田间，可以增加土壤中速效钾浓度，减少钾肥的施用量，能很好地维系土壤养分平衡，恢复土壤有机状态；还能促进作物生长、改善作物品质、增强作物的抗逆性等。
发明内容
基于上述问题，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种能高效解钾的细菌。
为实现上述目的，本申请的发明人通过大量的实验和不懈的探索，最终获得了如下技术方案：
本发明提供了一株纤维化纤维微细菌(Cellulosimicrobium cellulans)DGNK-JJ1，已于2019年8月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编510075，保藏编号为GDMCC NO：60749。
本发明的纤维化纤维微细菌DGNK-JJ1，是发明人从药渣堆肥中，经过多次选择性筛选和分离纯化培养获得，该菌株能在3～5天内将培养基中速效钾的含量提高92％以上。
本发明的纤维化纤维微细菌DGNK-JJ1是革兰氏阳性杆菌，菌体单个、成双或链状排列；纤维化纤维微细菌DGNK-JJ1在NA培养基36℃培养48h，可见其菌落较小，黄色，凸起，表面光滑，圆形。
作为本发明的另一个方面，本发明提供上述纤维化纤维微细菌DGNK-JJ1在生物肥料制备中的用途。
作为本发明的又一个方面，本发明提供一种生物肥料，其中含有上述的维化纤维微细菌DGNK-JJ1。
本发明还提供了一种提高土壤中速效钾含量的方法，其包括将上述的生物肥料施放到田间。
综上所述，本发明的有益效果为：
本发明从中药渣堆肥后土壤的土样中，分离筛选出一株高效解钾菌DGNK-JJ1，并对其进行鉴定，为解钾菌肥生产提供有效菌种，可以避免或减轻生态环境问题和农产品质量安全问题，有助于发展生态农业。
附图说明
图1为本发明的解钾菌株DGNK-JJ1的菌落形态；
图2是解钾菌株DGNK-JJ1的菌体形态(10×100)；
图3是本发明的解钾菌株DGNK-JJ1的16S rDNA电泳图；
图4是基于16S rDNA构建的解钾菌株系统发育进化树。
生物保藏信息
一株纤维化纤维微细菌DGNK-JJ1，已于2019年8月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编510075，保藏编号为GDMCC NO：60749。
具体实施方式
本发明从中药渣堆肥中，分离筛选出一株高效解钾菌—纤维化纤维微细菌(Cellulosimicrobium cellulans)DGNK-JJ1，并对其进行形态学、生理生化和分子生物学鉴定，为解钾菌肥生产提供有效菌种，有助于发展有机生态农业。
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
下述实施例中所使用的实验方法如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中所用材料、试剂等，如无特别说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中，所述百分含量如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例1解钾细菌的分离筛选
在无菌条件下，称取10g土样溶于90mL的无菌水充分振荡并梯度稀释成10－3、10－4、10－5倍的堆肥悬液，然后每个稀释度各取100μL均匀涂布于解钾细菌培养基平板上，37℃倒置培养3d。挑选无色、透明、油滴状的最大菌落，进行平板划线纯化，反复进行3次，同时用显微镜观察菌落纯度，直至获得纯培养。最后将所获得的纯培养菌株转入终浓度为30％的甘油中并密封保存于-20℃冰箱。
实施例2解钾细菌解钾能力的测定
将实施例1所得初筛菌株接种于30mL LB培养基中，于36℃150r/min下培养1d，作为种子液。按2％的接种量吸取种子液加入100mL解钾细菌培养基中，以不接菌的培养基为空白对照组，每个处理设3个重复，于36℃150r/min下培养7d。于3d、5d、7d分别取样，发酵液4℃，6000r/min，离心10min后取上清液，以氯化钾为标准物质，用原子吸收分光光度计测定溶液中速效钾含量。然后计算出速效钾相对增加率(结果参见表1):
Figure BDA0002271646770000041
上式中，A为速效钾相对增加率(％)；K为样品中速效钾含量(mg/L)(接菌)；K0为空白对照中速效钾含量(mg/L)。
表1速效钾相对增加率
Figure BDA0002271646770000042
注:“ck3、ck5、ck7”为第3天、第5天、第7天的空白对照。
实施例3解钾细菌的鉴定
(1)形态学观察。按《伯杰氏细菌鉴定手册》观察实施例1所得解钾细菌培养基表面生长菌落的形态、颜色等；挑取幼龄培养物，涂片、革兰氏染色，显微镜下观察菌体形态、大小、革兰氏染色反应，以及芽孢的有无、形态和着生位置等，结果参见表2、图1和图2。
表2菌落培养特征、镜检结果
Figure BDA0002271646770000043
(2)生理生化试验。采用本领域通用的硝酸盐还原试验、糖发酵试验、七叶灵水解实验、β-半乳糖甙酶试验、β-葡糖醛酸酶、明胶水解试验、脲酶试验、碱性磷酸酶实验和吡咯烷酮酶实验(PYR实验)等。
本发明的解钾菌株(即纤维化纤维微细菌DGNK-JJ1)经API菌种鉴定系统鉴定，从API数据库中获得和该菌种序列相近种、属。鉴定为Cellulosimicrobiumcellulans(纤维化纤维微菌)，鉴定率为99.6％，其生理生化试验结果如下：
表2解钾菌株生理生化特征
生理生化试验 检测结果 生理生化试验 检测结果 生理生化试验 检测结果
硝酸盐还原 — 吡嗪胺酶 + 吡咯烷酮基芳胺酶 +
碱性磷酸酶 + β-葡糖醛酸酶 — β-半乳糖甙酶 +
α-葡糖甙酶 + N-乙酰-β-葡萄糖胺酶 + 七叶灵 +
脲酶 — 明胶水解 + 葡萄糖 +
核糖 + 木糖 + 甘露醇 —
丙二酸盐 + 乳糖 — 蔗糖 +
肝糖 + 触酶 +
注:“+”为反应呈阳性或可生长、利用；“-”为反应呈阴性或不可生长、利用。
(3)分子生物学特性测定。将纯化的菌株(即纤维化纤维微细菌DGNK-JJ1)进行16SrDNA分子鉴定。
PCR引物为27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，
1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。
PCR反应体系25.00μL：10×Taq Buffer 2.50μL，dNTPs(2.5mmol/L)2.00μL，ExTaq(5U/μL)0.25μL，正、反向引物(10μmol/L)各0.50μL，ddH2O 16.25μL，3.00μL DNA模板。
PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃30s，55℃1min，72℃90s，进行30个循环；72℃延伸10min。
PCR结束后电泳检测为阳性的PCR产物(即图3中泳道1或2对应的产物)送至上海美吉生物医药科技有限公司测序。将测序结果提交NCBI使用BLAST程序进行比对，并选取同属内近缘种的16S rDNA基因序列进行同源性分析，并通过MEGA-X采用邻接法构建系统发育进化树，构建的进化树参见图4，结合DGNK-JJ1的形态特征及生理生化试验结果，鉴定菌株DGNK-JJ1为纤维化纤维微细菌。
菌株(即纤维化纤维微细菌DGNK-JJ1)的16S rDNA测序结果如下：
AAGTCGAACGATGATGCCCAGCTTGCTGGGCGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGTAACCTGCCCTTGACTTCGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATATGAGCCGTCCTCGCATGGGGGTGGTTGGAAAGTTTTTCGGTCAGGGATGGGCTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTGATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGAAGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGCAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGTTTGTCGCGTCTGGTGTGAAAACTCGAGGCTCAACCTCGAGCTTGCATCGGGTACGGGCAGACTAGAGTGCGGTAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGGAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGATGGCGAAGGCAGGTCTCTGGGCCGCAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCATGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGTTGGGCACTAGGTGTGGGGCTCATTCCACGAGTTCCGTGCCGCAGCAAACGCATTAAGTGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGCGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATGCACGAGAAGCCACCAGAGATGGTGGTCTCTTTGGACACTCGTGCACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGTCCCATGTTGCCAGCGGGTTATGCCGGGGACTCATGGGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTTCACGCATGCTACAATGGCCGGTACAAAGGGCTGCGATACCGTAAGGTGGAGCGAATCCCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCCATGGCCCAACCGTTCGCGGGGGGA
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (4)

1.一株纤维化纤维微细菌(Cellulosimicrobium cellulans)DGNK-JJ1，其于2019年8月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编510075，保藏编号为GDMCC NO：60749。
2.权利要求1的纤维化纤维微细菌DGNK-JJ1在生物肥料制备中的用途。
3.一种生物肥料，其中含有权利要求1所述的维化纤维微细菌DGNK-JJ1。
4.一种提高土壤中速效钾含量的方法，其包括将权利要求3的生物肥料施放到田间。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115247142A (zh) * 2022-08-16 2022-10-28 安徽农业大学 一株纤维化纤维微细菌及其在秸秆田间堆肥中的应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107858296A (zh) * 2017-12-15 2018-03-30 山东农业大学 一株解磷、解钾和降解纤维素的黑曲霉及其菌剂的制备与应用
CN108795797A (zh) * 2018-05-24 2018-11-13 珠海市现代农业发展中心(珠海市金湾区台湾农民创业园管理委员会、珠海市农渔业科研与推广中心) 一株玉米根系内生阴沟肠杆菌及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107858296A (zh) * 2017-12-15 2018-03-30 山东农业大学 一株解磷、解钾和降解纤维素的黑曲霉及其菌剂的制备与应用
CN108795797A (zh) * 2018-05-24 2018-11-13 珠海市现代农业发展中心(珠海市金湾区台湾农民创业园管理委员会、珠海市农渔业科研与推广中心) 一株玉米根系内生阴沟肠杆菌及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
张凯璇等: "植物内生菌应用于有害金属污染环境修复研究进展", 《江苏农业科学》 *
柳开楼等: "长期施肥下红壤旱地解钾菌变化及其驱动因子", 《土壤学报》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115247142A (zh) * 2022-08-16 2022-10-28 安徽农业大学 一株纤维化纤维微细菌及其在秸秆田间堆肥中的应用
CN115247142B (zh) * 2022-08-16 2023-05-12 安徽农业大学 一株纤维化纤维微细菌及其在秸秆田间堆肥中的应用

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