CN115287216A - 一种秸秆降解菌txb2及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种秸秆降解菌TXB2及其应用。本发明所提供的秸秆降解菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)TXB2。其在中国典型培养物菌种保藏管理中心的登记入册编号为CCTCC M 2022679。试验证明，用该菌TXB2处理秸秆30d，马铃薯秸秆降解率为53.68％，燕麦秸秆降解率为41.44％，荞麦秸秆降解率为50.12％，藜麦秸秆的降解率为36.88％，玉米秸秆的降解率为21.64％，小麦秸秆降解率为44.56％。

Description

一种秸秆降解菌TXB2及其应用

技术领域

本发明涉及秸秆降解领域，具体涉及一种秸秆降解菌TXB2及其应用。

背景技术

我国是农业大国，秸秆资源种类丰富，年产量为9亿t，主要来自玉米、水稻、小麦三大粮食作物，其次是薯类、豆类、油菜、棉花及其他谷类作物秸秆。我国每年秸秆资源综合利用率不到40％，60％以上的秸秆被焚烧、随意堆放或用作生活燃料。一些农作物病虫害的休眠体在秸秆上越冬，若秸秆直接还田，在下茬作物播种前不能降解，既不利于下茬作物生长又加重了病虫害的发生。加速秸秆降解，一些病虫休眠体会随着秸秆降解而死亡，能大大减少病虫害发生。秸秆是来源于农作物的茎秆及叶片等副产品，含有植物生长所需要的营养元素，秸秆降解能够将这些养分归还于土壤，供作物生长所需，成为重要的肥料。

利用微生物降解能力使秸秆纤维结构破碎，将秸秆中的粗纤维分解为小分子物质，使有机质和纤维结构降解转化为CO₂、水、矿物质及热量，不仅促进作物生长，防治病虫害并培肥土壤，提升土壤有机质含量，不污染环境，简单易实施、秸秆利用率高。建立较完善的秸秆田间处理、收集、储运体系，是实现以地养地、提升耕地质量、建立高产稳产农田的有效技术途径。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种可用于秸秆降解的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)

TXB2。

本发明另一目的在于提供上述秸秆降解菌TXB2在降解马铃薯、燕麦、荞麦、玉米、藜麦和小麦秸秆上的应用。

本发明通过以下技术方案实现：

从马铃薯田距离地表5～10cm取土样，以纤维素为靶标用刚果红染色法对土壤中的微生物进行初筛，将筛选出的纤维素降解菌进行马铃薯秸秆液态发酵试验，测定秸秆降解率，且测定其纤维素酶活性，对筛选到的菌株通过形态学、生理生化和分子生物学进行鉴定，并将菌株TXB2分别对马铃薯、燕麦、荞麦、玉米、藜麦和小麦秸秆进行盆栽防效试验。得到一株秸秆降解菌，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，保藏于中国典型培养物菌种保藏管理中心，保藏单位地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏日期为：2022年05月19日，分类命名：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，保藏编号为CCTCC M 2022679。

本发明具有的优点：

本发明的秸秆降解菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)TXB2。该菌TXB2处理秸秆30d，马铃薯秸秆降解率为53.68％，燕麦秸秆降解率为41.44％，荞麦秸秆降解率为50.12％，藜麦秸秆降解率为36.88％，玉米秸秆降解率为21.64％，小麦秸秆降解率为44.56％。本发明所提供的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)TXB2用于秸秆快速还田，对人蓄安全，对环境没有污染，具有良好的开发和应用前景。

保藏说明：

本发明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)TXB2，于2022年05月19日保藏在中国典型培养物菌种保藏管理中心(CCTCC)，保藏地址是湖北省武汉市武昌区八一路299号中国典型培养物菌种保藏管理中心，保藏中心登记入册编号为CCTCC M 2022679，在本发明中简称菌株TXB2，经检验存活。

附图说明

图1马铃薯秸秆降解率的变化

图2燕麦秸秆降解率的变化

图3荞麦秸秆降解率的变化

图4藜麦秸秆降解率的变化

图5玉米秸秆降解率的变化

图6小麦秸秆降解率的变化

具体实施方式

以下实施例便于更好地阐明本发明，但并不限定本发明的范围。下述实施例中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用材料，如无特殊说明，均能从常规生化试剂公司买到。

下列实施例中的培养基：

LB固体培养基：蛋白胨10g，酵母提取粉5g，NaCl 10g，琼脂15g，蒸馏水1000mL。

LB液体培养基：蛋白胨10g，酵母提取粉5g，NaCl 10g，蒸馏水1000mL。

PDA培养基：去皮马铃薯200g，琼脂18g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL。

高氏1号培养基：MgSO₄·7H₂O 0.5g，FeSO₄·7H₂O 0.01g，KNO₃ 1g，NaCl 0.5g，K₂HPO₄ 0.5g，可溶性淀粉20g，琼脂15g，蒸馏水1000mL。

羧甲基纤维素钠培养基：CMC-Na 20g，NH₄NO₃ 1g，KH₂PO₄1.5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，Na₂HPO₄ 2.5g，酵母提取粉0.5g，蛋白胨2.5g，琼脂15g，蒸馏水1000mL。

产酶培养基：蛋白胨3g，(NH₄)₂SO₄ 3g，KH₂PO₄ 1g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，NaCl 5g，蒸馏水1000mL。

营养液：(NH₄)₂SO₄ 1.4g，KH₂PO₄ 2g，MgSO₄·7H₂O 0.3g，CaCl₂ 0.3g，FeSO₄·7H₂O7.5mg，MnSO₄·H₂O 2.5mg，ZnSO₄ 2mg，CoCl₂ 3mg，尿素0.3mg，蒸馏水1000mL。

马铃薯秸秆发酵培养基：2g 1～2cm长马铃薯秸秆，50mL营养液。

碳源测定基础培养基：KH₂PO₄ 2.38g，K₂HPO₄·3H₂O 5.65g，(NH₄)₂SO₄ 2.64g，MgSO₄·7H₂O 1g，CuSO₄·5H₂O 6.4mg，ZnSO₄·7H₂O 1.5mg，FeSO₄·7H₂O 1.1mg，MnCl₂·7H₂O7.9mg，琼脂15g，蒸馏水1000mL。

氮源测定基础培养基：葡萄糖10g，K₂HPO₄·3H₂O 1g，MgSO₄·7H₂O 5g，NaCl₂ 5g，FeSO₄·7H₂O 10mg，琼脂15g，蒸馏水1000mL。

丙二酸盐试验培养基：丙二酸钠3g，酵母膏1g，NaCl 2g，(NH₄)₂SO₄ 2g，KH₂PO₄0.4g，K₂HPO₄·3H₂O 0.6g，溴百里酚蓝25mg，蒸馏水1000mL，pH 7.4。

甲基红试验培养基：蛋白胨7.0g，葡萄糖5g，NaCl 5g，蒸馏水1000mL。

淀粉水解试验培养基：可溶性淀粉2g，牛肉浸膏3g，蛋白胨5g，葡萄糖2.5g，琼脂18g，蒸馏水1000mL，pH 7.0。

脂肪水解试验培养基：蛋白胨10g，CaCl·2H₂O 0.1g，琼脂17g，蒸馏水1000mL，pH7.4。

NA培养基：牛肉浸膏3g，蛋白胨5g，葡萄糖2.5g，琼脂18g，蒸馏水1000mL，pH 7.0。

实施例1菌株的分离筛选

从内蒙古呼和浩特市托克托县马铃薯田，距离地表5～10cm取土样。称取10g土壤样品加入装有90mL无菌水的250mL三角瓶中，置于28℃、180r/min恒温振荡培养箱中振荡30min，静置20min，在无菌操作条件下，取1mL上清液进行梯度稀释，稀释至10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8共8个浓度，每个浓度各取0.1mL在LB固体培养基上涂布分离，每个浓度3个平板，在28℃恒温培养箱中倒置培养，直至菌落长出，挑取不同形态菌株进行反复划线纯化，获得纯菌株。

刚果红染色试验筛选秸秆降解菌，采用点接种法分别将纯化后的菌株接种至羧甲基纤维素钠培养基上，每个平板接3个点，设3次重复，在28℃恒温培养箱培养72h，加入适量1mg/mL的刚果红溶液染色30min，弃去染液，加入适量1mol/L的NaCl溶液脱色20min，观察并测量菌落直径(d，cm)及其周围透明圈直径(D，cm)，计算D/d值。

结果，菌株TXB2在刚果红染色试验平板上出现透明圈，透明圈直径D与菌落直径d的比值(D/d)为6.22，具有纤维素降解能力。经过初筛，得到1个菌株，命名为TXB2。

刚果红染色试验结果

实施例2菌株TXB2对马铃薯秸秆降解率的测定

将初筛得到的具有降解纤维素能力的菌株接种至LB液体培养基中，制备浓度为1×107CFU/mL菌悬液，按体积为10％的比例接种至马铃薯秸秆发酵培养基中，以不接菌为空白对照，设3次重复，在28℃、180r/min恒温振荡培养箱中培养，分别在第0d、5d、15d、25d和35d取样，将不同处理的秸秆残渣用无菌水反复清洗3次，置于80℃烘箱烘干至恒重，称量，计算秸秆相对降解率。

降解率＝(M₁-M₂)/M₁×100％

其中M₁为初始秸秆质量，M₂为降解后秸秆质量。

结果，菌株TXB2在发酵35d后，马铃薯秸秆剩余量分别为0.89g，秸秆失重率55.48％。

马铃薯秸秆液态发酵降解效果

实施例3菌株TXB2纤维素酶活力测定

将待测菌株接种至LB液体培养基中，制备浓度为1×10⁷CFU/mL菌悬液，按体积比为9％的接种量分别将菌悬液接入产酶培养基中，28℃、180r/min培养7d，每隔24h取菌悬液，使用商业试剂盒，购自苏州格雷斯生物技术有限公司(中国苏州)，按照苏州格锐思酶活测定说明书进行菌株的半纤维素酶、内切-β-1，4-葡聚糖酶、外切-β-1，4-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶活性的测定。取2mL菌悬液超声破碎15s间隔10s，重复30次，12000rpm，4℃离心10min，取上清待测。

结果，菌株TXB2的半纤维素酶、内切-β-1，4-葡聚糖酶、外切-β-1，4-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶活性最大值分别为：29.94U/mL、289.93U/mL、533.7U/mL和4.78U/mL，说明该菌株能产生纤维素降解酶降解纤维素。

实施例4菌株TXB2鉴定

形态学鉴定

用稀释法将菌株涂布于LB固体培养基中，长出单个菌落，菌株TXB2菌落乳白色，不透明，边缘不规则，有褶皱，中间凹陷。

生理生化鉴定

试验参照《常见细菌系统鉴定手册》，对菌株的生理生化指标碳源、氮源的利用、丙二酸盐的利用、甲基红试验、淀粉水解、氧化酶试验和过氧化氢酶试验等进行测定。菌株TXB2为革兰氏阳性菌，能够将淀粉和脂肪分解，可以利用葡萄糖和甘露醇作为唯一碳源，可以作为唯一氮源的有硝酸铵和硫酸铵。

菌株TXB2生理生化特性

注：“+”表示阳性，“-”表示阴性

分子生物学鉴定

DNA的提取按照TIAN GEN细菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)(中国北京)说明书进行，购自天根生化科技(北京)有限公司。菌株TXB2的PCR引物分别为27F和1492R、7F和1540R、rpoBF和rpoBR、tpiF和tpiR，引物序列详见下表。25μL反应体系含：17μL的ddH₂O，2.5μL的10×PCRBuffer，2μL的dNTP，1μL的上游引物，1μL的下游引物，0.25μL的TaqDNA聚合酶。PCR反应条件：预变性94℃ 5min；变性94℃ 30s；退火温度30s；72℃ 1min；循环34次；72℃10min。将4个基因的PCR产物通过1％的琼脂糖琼脂糖凝胶电泳检测，并送至上海生工生物公司进行16S rDNA测序。将得到的4个基因序列进行拼接，拼接结果与Gen Bank核酸数据库进行比对，选取相似度较高的菌株序列进行分析，利用软件MEGA7.0进行系统发育树的构建。将4个PCR产物测序结果拼接，利用NCBI数据库中的Blast程序比对，并通过MEGA7.0软件系统发育树分析，菌株TXB2与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)聚在一类，登录号分别为(MT950332)、(JQ900623)、(OK428684)、(EU056572)、(OK428687)和(MN900849)。

综合形态学、生理生化试验和分子生物学鉴定结果，菌株TXB2鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

主要引物及序列

实施例5菌株TXB2对不同作物秸秆降解效果

将马铃薯、燕麦、玉米、藜麦、小麦和荞麦秸秆在流动自来水下洗净，于80℃烘箱中烘干，剪成3～4cm短节。取5g不同作物秸秆分别置于小尼龙袋中，用9mL浓度为1×10⁷CFU/mL的TXB2菌悬液浸湿秸秆，以不接菌作为对照CK，每个处理重复5次。将处理好的秸秆置于花盆中间，每个花盆上下覆灭菌土2.0kg，花盆上面覆灭菌土深度为2～3cm，每盆放5小尼龙袋处理好的秸秆，加420mL自来水(相对湿度70～80％)，放于实验室室内培养，每隔5d浇420mL自来水，在培养5d、10d、20d、30d时取样，每次取出1个小尼龙袋秸秆，测定不同秸秆的秸秆降解率。

结果，用该菌TXB2处理各秸秆30d，马铃薯秸秆降解率为53.68％(图1)，燕麦秸秆降解率为41.44％(图2)，荞麦秸秆降解率为50.12％(图3)，藜麦秸秆降解率为36.88％(图4)，玉米秸秆降解率为21.64％(图5)，小麦秸秆降解率为44.56％(图6)。

Claims (2)

1.一种秸秆降解菌TXB2，其特征在于它为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，保藏在中国典型培养物菌种保藏管理中心，保藏地址是湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏日期为2022年5月19日，保藏号为CCTCC M 2022679。

2.一种如权利要求1所述的秸秆降解菌TXB2的应用，其特征在于它用于降解马铃薯、燕麦、荞麦、藜麦、玉米和小麦秸秆。

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