CN103321074A - 一种用枯草芽孢杆菌工程菌降解植物的木质素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用枯草芽孢杆菌工程菌降解植物的木质素的方法。属生物技术领域。首先分别从微生物中克隆锰过氧化物酶基因、木质素过氧化物酶基因和漆酶基因；构建含上述三种基因表达框架的枯草芽孢杆菌表达载体，将枯草芽孢杆菌表达载体转化枯草芽孢杆菌，通过G418抗性筛选而获得含锰过氧化物酶基因表达框架、木质素过氧化物酶基因表达框架和漆酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌。将枯草芽孢杆菌工程菌与植物原料作用而降解植物的木质素。本发明的优点体现于：这种枯草芽孢杆菌工程菌对木质素的降解作用强于当前应用于降解植物的木质素的表达分泌锰过氧化物酶、木质素过氧化物酶和漆酶的天然的微生物。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及构建和应用微生物工程菌的方法。具体是应用微生物工程菌降解植物原料的木质素的方法。
背景技术
锰过氧化物酶(Manganese Peroxidase，MnP)、木质素过氧化物酶(Lignin Peroxidase，LiP)和漆酶(Laccase)具有共同降解木质素的作用。
植物资源不断再生，十分丰富。植物的基本成分是纤维素、半纤维素和木质素。其中在制造沼气和乙醇业中有用的成分是纤维素，次之是半纤维素。前者由葡萄糖构成，而后者由戊糖构成。这些糖都是转化为乙醇和沼气的物质。但是纤维素分子之间被木质素镶嵌，被镶嵌着的纤维素不能被水解。木质素是广泛存在于植物体中的无定形的、分子结构中含有氧代苯丙醇或其衍生物结构单元的芳香性高聚物，形成纤维支架，结构十分稳定。欲利用纤维素则必须先降解木质素。当前用于降解木质素的方法有物理、化学和生物的方法。物理法主要是机械粉碎法、高温热解预处理以及辐射预处理等，但是物理法耗能大，并且需要特殊设备；化学法主要是酸或碱处理的方法。化学处理法具有工艺简单的特点，但是处理后的纤维素和半纤维素损失大，并且产生大量的酸碱废气物污染环境。与化学法和物理法相比，当前应用的生物法主要是应用天然的表达分泌降解木质素的酶的白腐真菌与植物原料作用而降解植物原料中的木质素。应用白腐真菌降解植物的木质素的优势在于，白腐真菌具有完整的降解木质素的酶系(锰过氧化物酶、木质素过氧化物酶和漆酶)，其不足之处是白腐真菌所含的锰过氧化物酶基因、木质素过氧化物酶基因和漆酶基因只是单拷贝，表达的酶的产量少，并且，白腐真菌生长缓慢，降解木质素的周期长。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是常用于生产重组蛋白的微生物。枯草芽孢杆菌营养要求低，生长能力强，能将表达的蛋白分泌到胞外。
发明内容
本发明通过分子生物学技术构建含锰过氧化物酶基因表达框架、木质素过氧化物酶基因表达框架和漆酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌；用含木质素过氧化物酶基因表达框架、锰过氧化物酶基因表达框架和漆酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌与植物原料作用，通过含木质素过氧化物酶基因表达框架、锰过氧化物酶基因表达框架和漆酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌分泌锰过氧化物酶、木质素过氧化物酶和漆酶而降解植物原料的木质素。
本发明所采用的技术方案是：
1.克隆基因：应用反转录PCR或PCR从含锰过氧化物酶基因、木质素过氧化物酶基因、漆酶基因的微生物中分别克隆锰过氧化物酶、木质素过氧化物酶和漆酶基因。
2.通过PCR扩增或DNA序列合成而获得构建表达载体所需的启动子，重组序列，信号肽，转录终止子和抗性基因表达框架的DNA序列。
3.通过分子生物学技术构建含锰过氧化物酶基因表达框架、木质素过氧化物酶基因表达框架和漆酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌表达载体(附图1)。
4.将以上构建的枯草芽孢杆菌表达载体转化枯草芽孢杆菌。根据表达载体上的G418抗性筛 选高拷贝重组子作为含锰过氧化物酶基因表达框架、木质素过氧化物酶基因表达框架和漆酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌。
5.将以上构建含锰过氧化物酶基因表达框架、木质素过氧化物酶基因表达框架和漆酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌应用于降解植物的木质素。
本发明构建了含锰过氧化物酶基因表达框架、木质素过氧化物酶基因表达框架和漆酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌，将这种枯草芽孢杆菌工程菌与植物原料作用，降解植物的木质素的优点体现于：
由于工程菌的构建选择了强的启动子调控基因，选择生产性能好的微生物作为工程菌构建的对象，并且选择高拷贝的重组子作为工程菌，所以，本发明构建的含锰过氧化物酶基因表达框架、木质素过氧化物酶基因表达框架和含漆酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌不仅具备枯草芽孢杆菌本身的营养要求低、生长繁殖迅速等特点，还具备工程菌的良好表达分泌降解木质素的酶系(锰过氧化物酶、木质素过氧化物酶和漆酶)的功能，这种含锰过氧化物酶基因表达框架、木质素过氧化物酶基因表达框架和漆酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌的木质素的降解作用强于当前应用于降解植物的木质素的天然的表达分泌木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶的天然的微生物。
附图说明
附图1.枯草芽孢杆菌表达载体。
P.巨大芽孢杆菌的的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子；S.MFα因子信号肽；genel.锰过氧化物酶基因；gene2.木质素过氧化物酶基因；gene3.漆酶基因；T.转录终止子序列；G418.G418基因表达框架；ColE1.大肠杆菌复制起点；AMP.氨苄青霉素基因表达框架；rDNA.枯草芽孢杆菌的rDNA序列。
附图2.扫描电镜拍的枯草芽孢杆菌工程菌与水稻秸秆作用4天后的水稻秸秆的照片。
附图3.扫描电镜拍的含锰过氧化物酶基因、木质素过氧化物酶基因和漆酶基因的白腐真菌与水稻秸秆作用4天后的水稻秸秆的照片。
附图4.扫描电镜拍的氨水与水稻秸秆作用4天后的水稻秸秆的照片。
附图5.扫描电镜拍的枯草芽孢杆菌与水稻秸秆作用4天后的水稻秸秆的照片。
附图6.扫描电镜拍的水稻秸秆的照片。
具体实施方式
下面采用非限定性实施例对本发明作进一步说明。
实施例一
1.1获得酶基因及构建表达载体所需的相关原件
(1)PCR扩增巨大芽孢杆菌的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子序列。
提取巨大芽孢杆菌的基因组DNA，以基因组DNA为模板，应用引物5’TTTACGTAGATCCATTATCGGTGAACCA3’和5’GGGCATGCGGGAATACATTACGGCCGAT3’)进行PCR扩增，PCR产物经序列测定和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是其三磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子序列。
(2)PCR扩增枯草芽孢杆菌的漆酶基因
用蜗牛酶裂解枯草芽孢杆菌的细胞壁，提取枯草芽孢杆菌基因组DNA，应用上游引物(5’AACCTAGGATGACACTTGAAAAATTTGTGGATGC3’)和下游引物(5’AAGCGGCCGCCTATTTATGGGGATCAGTTATA3’)进行PCR扩增，PCR产物经序列测定和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是枯草芽孢杆菌的漆酶基因序列。
(3)应用反转录PCR扩增白腐真菌的木质素过氧化物酶基因和锰过氧化物酶基因
应用RNA提取试剂盒提取白腐真菌菌属的总RNA，以总RNA为模板，应用cDNA合成试剂盒反转录成cDNA。以上述合成的cDNA为模板，应用引物1(5’AAGAATTCGCCACCTGTTCCAACGGCAAGACCGTC3’)和引物2(5’AAGCGGCCGCCTAAGCACCCGGAGGCGGAGGGATGCG3’)进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是白腐真菌的木质素过氧化物酶基因序列；以上述合成的cDNA为模板，应用引物3(5’CCGAATTCGCGGTCTGCCCCGACGGCACCCGCGTCA3’)和引物4(5’TTGCGGCCGCCTATGCGGGACCGTTGAACTGGACACC3’)进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是白腐真菌的锰过氧化物酶基因序列。
(4)用PCR从枯草芽孢杆菌基因组中扩增rDNA序列
应用常规方法提取枯草芽孢杆菌基因组DNA，应用如下引物(5’CCGGTACCgacgaacgctggcggcgtgc3；5’CCTTCGAAgcaccttccgatacggctacct3’)进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是枯草芽孢杆菌基因组中的rDNA序列。
说明：
①枯草芽孢杆菌基因组DNA提取方法：将菌细胞加于9mg/ml的蜗牛酶溶液(蜗牛酶用1mol/L山梨醇溶解)于30℃振摇30分钟，然后按照常规的细菌基因组DNA提取方法提取其基因组DNA。
②引物5’端的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的6个碱基).
(5)合成如下氨苄青霉素抗性基因表达框架序列[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是氨苄青霉素抗性基因表达框架序列]
5’AAGGTACCTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCAT AGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTG CAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAG GGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAG CTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTGCAGGCATCGTGGTG TCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCC CCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGC AGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTT TCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTG CCCGGCGTCAACACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAAC GTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGT GCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGC AAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATAAGCTTGG3’
(6)合成如下G418抗性基因表达框架序列[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是G418抗性基因表达框架序列]
CCATCGATCCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATAC CATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTAT CGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAA ATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGC CATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACG CGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATT TTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCAT CAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTA ACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGT CGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCC TCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATGGTACCAA
⑦合成MFα因子信号肽[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是α因子信号肽序列]：
TTGCATGCATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACT ACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGC TGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAG AAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTACACTAGTGG
⑧合成转录终止子序列[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是转录终止子序列]：
TTACTAGTCCTTAGACATGACTGTTCCTCAGTTCAAGTTGGGCACTTACGAGAAGACCGGTCTTGCTA GATTCTAATCAAGAGGATGTCAGAATGCCATTTGCCTGAGAGATGCAGGCTTCATTTTTGATACTTTTT TATTTGTAACCTATATAGTATAGGATTTTTTTTGTCATTTTGTTTCTTCTCGTACGAGCTTGCTCCTGATC AGCCTATCTCGCAGCTGATGAATATCTTGTGGTAGGGGTTTGGGAAAATCATTCGAGTTTGATGTTTTT CTTGGTATTTCCCACTCCTCTTCAGAGTACAGAAGATTAAGTGAGAAGTTCGTTTGTGCAAGCTTATC GATGG
1.2构建枯草芽孢杆菌表达载体
(1)由专业的DNA序列合成公式合成大肠杆菌复制起点的两条碱基互补的双链，并且在每条DNA链序列的两端形成粘性末端。通过T4DNA连接酶的作用使其环化，形成DNA克隆载体。将这克隆载体命名为BD。
(2)通过DNA限制性内切酶和T4DNA连接酶的作用，将枯草芽孢杆菌的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列、α因子信号肽DNA序列、白腐真菌的锰过氧化物酶基因序列和转录终止子序列依次重组于BD载体的多克隆位点。此载体称为BD1。
(3)通过DNA限制性内切酶和T4DNA连接酶的作用，将枯草芽孢杆菌的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列、α因子信号肽DNA序列、白腐真菌的木质素过氧化物酶基因序列和转录终止子序列依次重组于BD载体的多克隆位点。此载体称为BD2。
(4)通过DNA限制性内切酶和T4DNA连接酶的作用，将枯草芽孢杆菌的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列、α因子信号肽DNA序列、枯草芽孢杆菌的漆酶基因序列和转录终止子序列依次重组于BD载体的多克隆位点。此载体称为BD3。
(5)通过DNA限制性内切酶和T4DNA连接酶的作用，切取BD2和BD3载体的表达框架，并将切下的表达框架依次插入于BD1的多克隆位点。此载体称为BD123。
(6)通过DNA限制性内切酶和T4DNA连接酶的作用依次将氨苄青霉素基因表达框架、G418基因表达框架和枯草芽孢杆菌的rDNA序列重组于BD123载体的多克隆位点，从而完成表达载体的构建(附图1)。
1.3构建枯草芽孢杆菌工程菌
用常规的氯化钙方法制备大肠杆菌感受态，将以上构建的表达载体(附图1)转化于大肠杆菌，提取质粒(载体)DNA。按照常规方法制备枯草芽孢杆菌感受态，用常规的电转化方法将其表达载体(附图1)转化枯草芽孢杆菌，将经过转化作用的枯草芽孢杆菌细胞涂布于含G418浓度为5000μg/ml的LB琼脂(1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％氯化钠，1.5％琼脂粉)平板，30℃培养3天。将在含G418浓度为700μg/ml的LB琼脂平板上生长的克隆转种于G418浓度为20000μg/ml的LB琼脂平板上，30℃培养3天。挑选能在G418浓度为20000μg/ml的LB琼脂平板上生长的克隆进行摇瓶发酵表达，根据SDS-PAGE电泳初步分析目标蛋白的表达。用离子交换和分子筛层析方法分离纯化各种目标蛋白，然后将分离纯化的目标蛋白用蛋白印迹法进行验证(说明.蛋白印迹：委托专业的多肽合成服务公司分别合成以上所述的锰过氧化物酶、木质素过氧化物酶和漆酶蛋白序列C端的35个氨基酸序列，将这些合成的多肽分别注射于家兔制备抗这些多肽的抗体而应用于蛋白印迹)证明以上所述的3种基因在枯草芽孢杆菌中表达和分泌到胞外。用常规方法进行酶活性测定，结果证明在枯 草芽孢杆菌中表达分泌的重组漆酶具有漆酶活性、在枯草芽孢杆菌中表达分泌的重组木质素过氧化物酶具有木质素过氧化物酶活性和在枯草芽孢杆菌中表达分泌的重组锰过氧化物酶具有锰过氧化物酶活性。挑选高G418抗性的重组子作为工程菌。
1.4应用枯草芽孢杆菌工程菌与植物作用，降解植物的木质素
(1)将枯草芽孢杆菌工程菌接种于LB液体培养基(1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％氯化钠)中培养至OD600＝6，取1000mL菌液接种于5000克(湿重)经过粉碎的水稻秸秆中，混匀，于30℃放置4天。用常规的硫酸法测定其经过枯草芽孢杆菌工程菌作用的水稻秸秆残留木质素的含量为4.3％。
(2)将具有分泌表达漆酶、木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶的、通常应用于植物原料发酵沼气和乙醇的预处理(降解木质素)的白腐真菌模式菌种-黄孢原毛平革菌接种于马铃薯培养基(20％马铃薯，2％葡萄糖)中培养至OD600＝6，取1000mL菌液接种于5000克(湿重)经过粉碎的水稻秸秆中，混匀，于30℃放置4天，用常规的硫酸法测定其经过白腐真菌作用的水稻秸秆残留木质素的含量为9.6％。
(3)将枯草芽孢杆菌接种于LB液体培养基中培养至OD600＝6，取1000mL菌液接种于5000克(湿重)经过粉碎的水稻秸秆中，混匀，于30℃放置4天。用常规的硫酸法测定经过枯草芽孢杆菌作用的水稻秸秆残留的木质素的含量为14.4％。
(4)将2600g经过粉碎的水稻秸秆与3400mL5％氨水混匀，于30℃放置4天，用常规的硫酸法测定其经过氨水作用的水稻秸秆残留木质素的含量为10.6％。
(5)用常规的硫酸法测定天然的水稻秸秆木质素含量15％。
统计学分析结果表明，枯草芽孢杆菌工程菌降解植物的木质素的效果极显著强于枯草芽孢杆菌(P＜0.001)、极显著强于白腐真菌(P＜0.001)、以及极显著强于氨水(P＜0.001)的降解木质素的效果。
实施例二
2.1获得酶基因及构建表达载体所需的相关原件
(1)PCR扩增巨大芽孢杆菌的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子序列。
提取巨大芽孢杆菌的基因组DNA，以基因组DNA为模板，应用引物5’TTTACGTAGATCCATTATCGGTGAACCA3’和5’GGGCATGCGGGAATACATTACGGCCGAT3’)进行PCR扩增，PCR产物经序列测定和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是其三磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子序列。
(2)PCR扩增枯草芽孢杆菌的漆酶基因
用蜗牛酶裂解枯草芽孢杆菌的细胞壁，提取枯草芽孢杆菌基因组DNA，应用上游引物(5’AACCTAGGATGACACTTGAAAAATTTGTGGATGC3’)和下游引物(5’AAGCGGCCGCCTATTTATGGGGATCAGTTATA3’)进行PCR扩增，PCR产物经序列测定和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是枯草芽孢杆菌的漆酶基因序列。
(3)应用反转录PCR扩增白腐真菌的木质素过氧化物酶基因和锰过氧化物酶基因
应用RNA提取试剂盒提取白腐真菌菌属的总RNA，以总RNA为模板，应用cDNA合成试剂盒反转录成cDNA。以上述合成的cDNA为模板，应用引物1(5’AAGAATTCGCCACCTGTTCCAACGGCAAGACCGTC3’)和引物2(5’AAGCGGCCGCCTAAGCACCCGGAGGCGGAGGGATGCG3’)进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是白腐真菌的木质素过氧化物酶基因序列；以上述合成的cDNA为模板，应用引物3(5’CCGAATTCGCGGTCTGCCCCGACGGCACCCGCGTCA3’)和引物4(5’TTGCGGCCGCCTATGCGGGACCGTTGAACTGGACACC3’)进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是白腐真菌的锰过氧化物酶基因序列。
(4)用PCR从枯草芽孢杆菌基因组中扩增rDNA序列
应用常规方法提取枯草芽孢杆菌基因组DNA，应用如下引物(5’CCGGTACCgacgaacgctggcggcgtgc3；5’CCTTCGAAgcaccttccgatacggctacct3’)进行PCR扩 增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是枯草芽孢杆菌基因组中的rDNA序列。
说明：
①枯草芽孢杆菌基因组DNA提取方法：将菌细胞加于9mg/ml的蜗牛酶溶液(蜗牛酶用1mol/L山梨醇溶解)于30℃振摇30分钟，然后按照常规的细菌基因组DNA提取方法提取其基因组DNA。
②引物5’端的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的6个碱基).
(5)合成如下氨苄青霉素抗性基因表达框架序列[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是氨苄青霉素抗性基因表达框架序列]
5’AAGGTACCTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCAT AGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTG CAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAG GGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAG CTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTGCAGGCATCGTGGTG TCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCC CCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGC AGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTT TCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTG CCCGGCGTCAACACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCAT℃ATTGGAAAAC GTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGT GCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGC AAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATAAGCTTGG3’
(6)合成如下G418抗性基因表达框架序列[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是G418抗性基因表达框架序列]
CCATCGATCCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATAC CATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTAT CGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAA ATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGC CATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACG CGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATT TTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCAT CAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTA ACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGT CGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCC TCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATGGTACCAA
⑦合成MFα因子信号肽[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是α因子信号肽序列]：
TTGCATGCATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACT ACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGC TGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAG AAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTACACTAGTGG
⑧合成转录终止子序列[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是转录终止子序列]：
TTACTAGTCCTTAGACATGACTGTTCCTCAGTTCAAGTTGGGCACTTACGAGAAGACCGGTCTTGCTA GATTCTAATCAAGAGGATGTCAGAATGCCATTTGCCTGAGAGATGCAGGCTTCATTTTTGATACTTTTT TATTTGTAACCTATATAGTATAGGATTTTTTTTGTCATTTTGTTTCTTCTCGTACGAGCTTGCTCCTGATC AGCCTATCTCGCAGCTGATGAATATCTTGTGGTAGGGGTTTGGGAAAATCATTCGAGTTTGATGTTTTT CTTGGTATTTCCCACTCCTCTTCAGAGTACAGAAGATTAAGTGAGAAGTTCGTTTGTGCAAGCTTATCGATGG
2.2构建枯草芽孢杆菌表达载体
(1)由专业的DNA序列合成公式合成大肠杆菌复制起点的两条碱基互补的双链，并且在每条DNA链序列的两端形成粘性末端。通过T4DNA连接酶的作用使其环化，形成DNA克隆载体。将这克隆载体命名为BD。
(2)通过DNA限制性内切酶和T4DNA连接酶的作用，将枯草芽孢杆菌的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列、α因子信号肽DNA序列、白腐真菌的木质素过氧化物酶基因序列和转录终止子序列依次重组于BD载体的多克隆位点。此载体称为BD1。
(3)通过DNA限制性内切酶和T4DNA连接酶的作用，将枯草芽孢杆菌的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列、α因子信号肽DNA序列、白腐真菌的锰过氧化物酶基因序列和转录终止子序列依次重组于BD载体的多克隆位点。此载体称为BD2。
(4)通过DNA限制性内切酶和T4DNA连接酶的作用，将枯草芽孢杆菌的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列、α因子信号肽DNA序列、枯草芽孢杆菌的漆酶基因序列和转录终止子序列依次重组于BD载体的多克隆位点。此载体称为BD3。
(5)通过DNA限制性内切酶和T4DNA连接酶的作用，切取BD2和BD3载体的表达框架，并将切下的表达框架依次插入于BD1的多克隆位点。此载体称为BD123。
(6)通过DNA限制性内切酶和T4DNA连接酶的作用依次将氨苄青霉素基因表达框架、G418基因表达框架和枯草芽孢杆菌的rDNA序列重组于BD123载体的多克隆位点，从而完成表达载体的构建(附图1)。
2.3构建枯草芽孢杆菌工程菌
用常规的氯化钙方法制备大肠杆菌感受态，将以上构建的表达载体(附图1)转化于大肠杆菌，提取质粒(载体)DNA。按照常规方法制备枯草芽孢杆菌感受态，用常规的电转化方法将其表达载体(附图1)转化枯草芽孢杆菌，将经过转化作用的枯草芽孢杆菌细胞涂布于含G418浓度为5000μg/ml的LB琼脂(1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％氯化钠，1.5％琼脂粉)平板，30℃培养3天。将在含G418浓度为700μg/ml的LB琼脂平板上生长的克隆转种于G418浓度为20000μg/ml的LB琼脂平板上，30℃培养3天。挑选能在G418浓度为20000μg/ml的LB琼脂平板上生长的克隆进行摇瓶发酵表达，根据SDS-PAGE电泳初步分析目标蛋白的表达。用离子交换和分子筛层析方法分离纯化各种目标蛋白，然后将分离纯化的目标蛋白用蛋白印迹法进行验证(说明.蛋白印迹：委托专业的多肽合成服务公司分别合成以上所述的锰过氧化物酶、木质素过氧化物酶和漆酶蛋白序列C端的35个氨基酸序列，将这些合成的多肽分别注射于家兔制备抗这些多肽的抗体而应用于蛋白印迹)证明以上所述的3种基因在枯草芽孢杆菌中表达和分泌到胞外。用常规方法进行酶活性测定，结果证明在枯草芽孢杆菌中表达分泌的重组漆酶具有漆酶活性、在枯草芽孢杆菌中表达分泌的重组木质素过氧化物酶具有木质素过氧化物酶活性和在枯草芽孢杆菌中表达分泌的重组锰过氧化物酶具有锰过氧化物酶活性。挑选高G418抗性的重组子作为工程菌。
2.4应用枯草芽孢杆菌工程菌与植物作用，降解植物的木质素
(1)将枯草芽孢杆菌工程菌接种于LB液体培养基(1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％氯化钠)中培养至OD600＝6，取1000mL菌液接种于5000克(湿重)经过粉碎的水稻秸秆中，混匀，于30℃放置4天，扫描电镜展示水稻秸秆的细胞壁的仅残留少量木质素(附图2)。
(2)将具有分泌表达漆酶、木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶的、通常应用于植物原料发酵沼气和乙醇的预处理(降解木质素)的白腐真菌模式菌种-黄孢原毛平革菌接种于马铃薯培养基(20％马铃薯，2％葡萄糖)中培养至OD600＝6，取1000mL菌液接种于5000克(湿重)经过粉碎的水稻秸秆中，混匀，于30℃放置4天，扫描电镜展示水稻秸秆的细胞壁残留木质素的 量明显多于用枯草芽孢杆菌工程菌处理的水稻秸秆(附图3)。
(3)将2600g经过粉碎的水稻秸秆与3400mL5％氨水混匀，于30℃放置4天，扫描电镜展示水稻秸秆的细胞壁结构残留大量的木质素(附图4)。
(4)将枯草芽孢杆菌接种于LB液体培养基中培养至OD600＝6，取1000mL菌液接种于5000克(湿重)经过粉碎的水稻秸秆中，混匀，于30℃放置4天，扫描电镜展示水稻秸秆的细胞壁结构完整，木质素没有被降解(附图5)。
(5)扫描电镜观察展示，没有经过处理的秸秆结构完整(附图6) 。
Claims (2)
1.一种用枯草芽孢杆菌工程菌降解植物的木质素的方法，其特征在于：通过分子生物学技术从微生物中克隆木质素过氧化物酶基因、锰过氧化物酶基因和漆酶基因；构建含木质素过氧化酶基因表达框架、锰过氧化物酶基因表达框架和漆酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌表达载体；将上述构建的枯草芽孢杆菌表达载体转化枯草芽孢杆菌，并通过其表达载体上的抗性进行筛选获得表达载体高拷贝重组的含木质素过氧化酶基因表达框架、锰过氧化物酶基因表达框架和漆酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌；将以上所述的枯草芽孢杆菌工程菌应用于降解植物的木质素。
2.根据权利要求1所述一种用枯草芽孢杆菌工程菌降解植物的木质素的方法，其特征在于：利用权利要求1所述的方法制备降解植物的木质素的枯草芽孢杆菌工程菌的产品。
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| CN 201310134625 CN103321074A (zh) | 2013-04-03 | 2013-04-03 | 一种用枯草芽孢杆菌工程菌降解植物的木质素的方法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN113957002A (zh) * | 2021-08-26 | 2022-01-21 | 中国林业科学研究院林产化学工业研究所 | 一株木质素降解芽孢杆菌及其应用 |
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-
2013
- 2013-04-03 CN CN 201310134625 patent/CN103321074A/zh active Pending
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| PB01 | Publication | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20130925 |