JP6599006B2 - 微生物、リグノセルロース系バイオマス分解用組成物、糖化液の製造方法及びリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造方法 - Google Patents
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Description
本発明は、微生物、リグノセルロース系バイオマス分解用組成物、糖化液の製造方法及びリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造方法に関する。
本願は、２０１６年６月２１日に、日本に出願された特願２０１６−１２３０６５号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
本願は、２０１６年６月２１日に、日本に出願された特願２０１６−１２３０６５号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
近年、地球温暖化対策や、廃棄物の有効活用の観点から、植物資源を原料とするバイオマスの利用が注目されている。一般に、バイオマスからエタノール等の化合物を製造するための原料としては、サトウキビ等の糖質やトウモロコシ等の可食のデンプンに加え、非食用デンプンとして、リグノセルロース系バイオマスを用いることが検討されている。リグノセルロース系バイオマスは、リグノセルロースを主成分として含む。リグノセルロースはセルロース、ヘミセルロース、リグニンが強固に結合した構造をしており、発酵に使用可能である五炭糖又は六炭糖の単糖やオリゴ糖に分解するのは容易ではない。
通常、リグノセルロース系バイオマスからエタノール等の化合物を製造する場合には、酵素による糖化が行うために、主成分であるリグノセルロースを分解し、酵素がリグノセルロース系バイオマスに含まれる多糖に接触可能にするために、前処理を行う。前処理方法としては、例えば、粉砕、爆砕、蒸煮、マイクロ波照射、ガンマ線照射、電子線照射、希硫酸処理、アルカリ処理、ソルボリシス処理等が挙げられる。これらの前処理方法は、エネルギーの投入量が大きい、前処理による糖の損失が大きい、有害物質による環境負荷が大きい、発酵阻害物質が副産物として生成される等の問題点がある。
一方、前処理方法として、リグノセルロース中のリグニンを分解できる微生物である白色腐朽菌を用いる方法が知られている。
一方、前処理方法として、リグノセルロース中のリグニンを分解できる微生物である白色腐朽菌を用いる方法が知られている。
特許文献１には、リグノセルロース分解作用を有する白色腐朽菌（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０５９１）又はその変異株を用いて、酵素による糖化工程及び微生物による発酵工程の前処理を行う方法が開示されている。
しかしながら、従来よりもリグノセルロース分解能の高い微生物が求められていた。
本発明は上記事情を鑑みてなされたものであり、リグノセルロース分解能の優れた新規微生物を提供する。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、腐葉土から採集された菌株の中から、リグノセルロースに対し優れた分解能を有し、且つ分解対象となるリグノセルロース系バイオマスの種類に制限がない菌株を見出し、本発明を完成させるに至った。
本発明の第１態様に係る微生物は、クロストリジウム・スピーシーズ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．）Ａ７株（ＮＩＴＥ ＢＰ−０２２１６）である。
本発明の第２態様に係る微生物は、セルロシバクター・アルカリサーモフィラス（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｂａｃｔｅｒ ａｌｋａｌｉｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｗ２１−１０株（ＮＩＴＥ ＢＰ−０２２６５）である。
本発明の第３態様に係るリグノセルロース系バイオマス分解用組成物は、クロストリジウム・スピーシーズ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．）Ａ７株（ＮＩＴＥ ＢＰ−０２２１６）、及びセルロシバクター・アルカリサーモフィラス（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｂａｃｔｅｒ ａｌｋａｌｉｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｗ２１−１０株（ＮＩＴＥ ＢＰ−０２２６５）からなる群より選択される少なくとも１種の微生物、又は前記微生物由来の酵素若しくは遺伝子産物を含む。
上記第３態様に係るリグノセルロース系バイオマス分解用組成物は、さらに、以下の（ｄ）〜（ｆ）のいずれかの核酸を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有し、且つリグノセルロース系バイオマスの分解能、又はリグノセルロース系バイオマスの分解産物の代謝能を有する微生物のうち少なくとも１種を含んでもよい。
（ｄ）配列番号３〜１１のいずれかに示す塩基配列からなる核酸、
（ｅ）配列番号３〜１１のいずれかに示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する核酸、
（ｆ）配列番号３〜１１のいずれかに示す塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠損、置換若しくは付加された塩基配列からなる核酸
上記第３態様に係るリグノセルロース系バイオマス分解用組成物は、さらに、以下の（ｄ）〜（ｆ）のいずれかの核酸を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有し、且つリグノセルロース系バイオマスの分解能、又はリグノセルロース系バイオマスの分解産物の代謝能を有する微生物のうち少なくとも１種を含んでもよい。
（ｄ）配列番号３〜１１のいずれかに示す塩基配列からなる核酸、
（ｅ）配列番号３〜１１のいずれかに示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する核酸、
（ｆ）配列番号３〜１１のいずれかに示す塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠損、置換若しくは付加された塩基配列からなる核酸
本発明の第４態様に係る糖化液の製造方法は、上記第３態様に係るリグノセルロース系バイオマス分解用組成物を用いて、リグノセルロース系バイオマスから糖化液を生成させる糖化工程を備える方法である。
本発明の第５態様に係るリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造方法は、上記第４態様に係る製造方法を用いて、糖化液を製造した後、前記糖化液からリグノセルロース系バイオマス由来化合物を生産させる生産工程を備える方法である。
上記態様によれば、リグノセルロース分解能の優れた新規微生物を提供することができる。
≪微生物≫
本発明の一実施形態に係る微生物は、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの核酸を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有し、且つリグノセルロース系バイオマスの分解能を有する。
（ａ）配列番号１又は２に示す塩基配列からなる核酸、
（ｂ）配列番号１又は２に示す塩基配列と９５％以上の同一性を有する核酸、
（ｃ）配列番号１又は２に示す塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠損、置換若しくは付加された塩基配列からなる核酸
本発明の一実施形態に係る微生物は、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの核酸を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有し、且つリグノセルロース系バイオマスの分解能を有する。
（ａ）配列番号１又は２に示す塩基配列からなる核酸、
（ｂ）配列番号１又は２に示す塩基配列と９５％以上の同一性を有する核酸、
（ｃ）配列番号１又は２に示す塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠損、置換若しくは付加された塩基配列からなる核酸
本実施形態の微生物のうち、配列番号１に示す塩基配列からなる核酸、又は該核酸と機能的に同等な核酸を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する微生物はクロストリジウム属に属する桿菌であって、優れたリグノセルロース分解能を有する。
クロストリジウムは、グラム陽性内生胞子形成桿菌の一属である。
また、本実施形態の微生物のうち、配列番号２に示す塩基配列からなる核酸、又は該核酸と機能的に同等な核酸を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する微生物はセルロシバクター属アルカリサーモフィラス種に属する桿菌であって、優れたリグノセルロース分解能を有する。
セルロシバクター・アルカリサーモフィラスは、好アルカリ好熱嫌気性セルロース分解菌である。
なお、本明細書において、「核酸」はＲＮＡ及びＤＮＡを含む。
また、本明細書において、「１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子」は、リボソームの小サブユニットのＲＮＡ、及び該ＲＮＡをコードするＤＮＡを含む。
クロストリジウムは、グラム陽性内生胞子形成桿菌の一属である。
また、本実施形態の微生物のうち、配列番号２に示す塩基配列からなる核酸、又は該核酸と機能的に同等な核酸を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する微生物はセルロシバクター属アルカリサーモフィラス種に属する桿菌であって、優れたリグノセルロース分解能を有する。
セルロシバクター・アルカリサーモフィラスは、好アルカリ好熱嫌気性セルロース分解菌である。
なお、本明細書において、「核酸」はＲＮＡ及びＤＮＡを含む。
また、本明細書において、「１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子」は、リボソームの小サブユニットのＲＮＡ、及び該ＲＮＡをコードするＤＮＡを含む。
本明細書において、「リグノセルロース分解能」とは、リグノセルロースに含まれる主に、セルロース、ヘミセルロース等の多糖を単糖、オリゴ糖、又は有機酸に分解する活性を意味する。
＜クロストリジウム・スピーシーズ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．）Ａ７株＞
上記（ａ）における配列番号１に示す塩基配列は、クロストリジウム・スピーシーズ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．）Ａ７株（ＮＩＴＥ ＢＰ−０２２１６）の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列である。
上記（ａ）における配列番号１に示す塩基配列は、クロストリジウム・スピーシーズ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．）Ａ７株（ＮＩＴＥ ＢＰ−０２２１６）の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列である。
クロストリジウム・スピーシーズＡ７株の分離精製は、後述の実施例において示す方法により分離精製することができる。また、得られた菌株について、形態観察その他からクロストリジウム属の菌と同定し、Ａ７株と名付けた。
クロストリジウム・スピーシーズＡ７株の微生物学的性質は以下の通りである。走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて撮影したクロストリジウム・スピーシーズＡ７株の顕微鏡写真を図１の（Ａ）〜（Ｃ）に示す。
（科学的性質）
リグノセルロース分解能を有する。
リグノセルロース分解能を有する。
（形態的性質）
（１）細胞の形状が細長い棒状又は円筒状を示す。細胞の長さは約２．０〜６．０μｍ、幅が約０．３〜０．４μｍである。
（２）グラム陽性菌であり、コロニーは橙色である。
（１）細胞の形状が細長い棒状又は円筒状を示す。細胞の長さは約２．０〜６．０μｍ、幅が約０．３〜０．４μｍである。
（２）グラム陽性菌であり、コロニーは橙色である。
（生殖様式）
（１）菌体の長軸方向が一定で長さだけが長くなるかたちで成長し、ある程度の大きさまで成長すると、その中心でほぼ均等に二分される形で分裂する。
（１）菌体の長軸方向が一定で長さだけが長くなるかたちで成長し、ある程度の大きさまで成長すると、その中心でほぼ均等に二分される形で分裂する。
（生理学・生化学性状）
（１）培養液：クラストリジウム属の菌を培養するために用いられる一般的な培地で生育できる。
（２）生育温度域：３７℃以上６０℃以下（至適温度５５℃）。
（３）生育ｐＨ域：ｐＨ６．０〜１０．０（至適ｐＨ９．０）。
（４）栄養源：炭素源として、セルロース、セロビオース、又はリグノセルロースで生育できる。また、窒素源として、硫酸や硝酸アンモニウムのような無機態窒素だけでなく、イーストエキスやペプトン、牛肉エキスのような有機態窒素でも利用できる。
（５）生成物質：酢酸、エタノール、フマル酸、乳酸、コハク酸を生成する。
（１）培養液：クラストリジウム属の菌を培養するために用いられる一般的な培地で生育できる。
（２）生育温度域：３７℃以上６０℃以下（至適温度５５℃）。
（３）生育ｐＨ域：ｐＨ６．０〜１０．０（至適ｐＨ９．０）。
（４）栄養源：炭素源として、セルロース、セロビオース、又はリグノセルロースで生育できる。また、窒素源として、硫酸や硝酸アンモニウムのような無機態窒素だけでなく、イーストエキスやペプトン、牛肉エキスのような有機態窒素でも利用できる。
（５）生成物質：酢酸、エタノール、フマル酸、乳酸、コハク酸を生成する。
（分類学的性質）
クロストリジウム・スピーシーズＡ７株の１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子の塩基配列は、配列表の配列番号１に示したとおりである。図３は、クロストリジウム・スピーシーズＡ７株及びセルロシバクター・アルカリサーモフィラスＷ２１−１０株の１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子の塩基配列と、近縁菌種の１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子の塩基配列とを比較し、作成したヒストグラムである。
この結果、クロストリジウム・スピーシーズＡ７株は新規の菌株と判断した。
クロストリジウム・スピーシーズＡ７株の１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子の塩基配列は、配列表の配列番号１に示したとおりである。図３は、クロストリジウム・スピーシーズＡ７株及びセルロシバクター・アルカリサーモフィラスＷ２１−１０株の１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子の塩基配列と、近縁菌種の１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子の塩基配列とを比較し、作成したヒストグラムである。
この結果、クロストリジウム・スピーシーズＡ７株は新規の菌株と判断した。
クロストリジウム・スピーシーズＡ７株は、２０１６年３月８日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）にプタベスト条約の規定化で受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２２１６として国際寄託されている。
（培地）
本実施形態において、クロストリジウム・スピーシーズＡ７株を培養するにあたり、培地を用いることが好ましい。
用いられる培地は、クロストリジウム属に属する菌が生育する条件であれば制限はなく、例えば、このような培地として、下記表１に示す組成のＢＭＮ培地を好ましく用いることができる。
その他用いることができる培地として、一般的な栄養培地であるＮＢ（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ）培地（例えば、Ｄｉｆｃｏ社製の「Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ， Ｂａｃｔｏ」（牛肉エキス３ｇ／Ｌ、ペプトン５ｇ／Ｌ含有）等）等を挙げることができる。中でも、培地としては、高効率でリグノセルロースを分解することから、上記表１に示した組成のＢＭＮ培地が特に好ましい。
本実施形態において、クロストリジウム・スピーシーズＡ７株を培養するにあたり、培地を用いることが好ましい。
用いられる培地は、クロストリジウム属に属する菌が生育する条件であれば制限はなく、例えば、このような培地として、下記表１に示す組成のＢＭＮ培地を好ましく用いることができる。
その他用いることができる培地として、一般的な栄養培地であるＮＢ（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ）培地（例えば、Ｄｉｆｃｏ社製の「Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ， Ｂａｃｔｏ」（牛肉エキス３ｇ／Ｌ、ペプトン５ｇ／Ｌ含有）等）等を挙げることができる。中でも、培地としては、高効率でリグノセルロースを分解することから、上記表１に示した組成のＢＭＮ培地が特に好ましい。
（培養方法）
本実施形態において、クロストリジウム・スピーシーズＡ７株の培養方法は、公知慣用の方法で行うことができる。培養において、上記の培地を用いることができる。
本実施形態において、培養方法としては、例えば、静置培養法、振盪培養法、深部通気撹拌培養法等が挙げられる。
本実施形態において、クロストリジウム・スピーシーズＡ７株の培養方法は、公知慣用の方法で行うことができる。培養において、上記の培地を用いることができる。
本実施形態において、培養方法としては、例えば、静置培養法、振盪培養法、深部通気撹拌培養法等が挙げられる。
培養におけるｐＨは、６．０〜１０．０の中性〜塩基性で行うことができ、ｐＨ９．０であることが好ましい。
培養温度としては、３７℃以上６０℃以下で行うことができ、５５℃で行うことが好ましい。培養温度が上記範囲内である場合、一般的なリグノセルロース系バイオマスを用いた糖化工程及び発酵工程と同様の温度範囲であるため、クロストリジウム・スピーシーズＡ７株は効率的にリグノセルロースを分解し、糖化液又はリグノセルロース系バイオマス由来化合物を得ることができる。
本実施形態において、上述の培養方法により、クロストリジウム・スピーシーズＡ７株を培養すると、安定した増殖を示すばかりでなく、リグノセルロースの分解能が向上したクロストリジウム・スピーシーズＡ７株が得られる。
一般的に、「リグノセルロース」とは、植物細胞壁の成分であり、主にセルロース、ヘミセルロース、及びリグニンからなる。リグノセルロース中のセルロースはβ−１，４グルコースからなる直鎖状のポリマーが水素結合で束になった強固な結晶構造をとっている。
また、本明細書において、「リグノセルロース系バイオマス」とは、主成分として、リグノセルロースを含むものである。リグノセルロース系バイオマスとしては、例えば、針葉樹（例えば、スギ、エゾマツ、カラマツ、クロマツ、トドマツ、ヒメコマツ、イチイ、ネズコ、ハリモミ、イラモミ、イヌマキ、モミ、サワラ、トガサワラ、アスナロ、ヒバ、ツガ、コメツガ、ヒノキ、イチイ、イヌガヤ、トウヒ、イエローシーダー（ベイヒバ）、ロウソンヒノキ（ベイヒ）、ダグラスファー（ベイマツ）、シトカスプルース（ベイトウヒ）、ラジアータマツ、イースタンスプルース、イースタンホワイトパイン、ウェスタンラーチ、ウェスタンファー、ウェスタンヘムロック、タマラック及びこれらの関連樹種等）、広葉樹（例えば、アスベン、アメリカンブラックチェリー、イエローポプラ、ウォールナット、カバザクラ、ケヤキ、シカモア、シルバーチェリー、タモ、チーク、チャイニーズエルム、チャイニーズメープル、ナラ、ハードメイプル、ヒッコリー、ピーカン、ホワイトアッシュ、ホワイトオーク、ホワイトバーチ、レッドオーク及びこれらの関連樹種等）、イネ、ムギ、トウモロコシ（特に、コーンストーバー（とうもろこしの非食部である芯、茎、葉））、パイナップル、オイルパーム、キャッサバ、サトウキビ（特に、サトウキビバガス、サトウキビ茎葉）等の農産物及びその廃棄物；ケナフ、綿等の工業植物及びその廃棄物； アルファルファ、チモシー等の飼料作物； エリエンサス、タケ、ササ等が挙げられ、これらに限定されない。これらのリグノセルロース系バイオマスは単独であってもよく、混合物であってもよい。
また、本明細書において、「リグノセルロース系バイオマス」とは、主成分として、リグノセルロースを含むものである。リグノセルロース系バイオマスとしては、例えば、針葉樹（例えば、スギ、エゾマツ、カラマツ、クロマツ、トドマツ、ヒメコマツ、イチイ、ネズコ、ハリモミ、イラモミ、イヌマキ、モミ、サワラ、トガサワラ、アスナロ、ヒバ、ツガ、コメツガ、ヒノキ、イチイ、イヌガヤ、トウヒ、イエローシーダー（ベイヒバ）、ロウソンヒノキ（ベイヒ）、ダグラスファー（ベイマツ）、シトカスプルース（ベイトウヒ）、ラジアータマツ、イースタンスプルース、イースタンホワイトパイン、ウェスタンラーチ、ウェスタンファー、ウェスタンヘムロック、タマラック及びこれらの関連樹種等）、広葉樹（例えば、アスベン、アメリカンブラックチェリー、イエローポプラ、ウォールナット、カバザクラ、ケヤキ、シカモア、シルバーチェリー、タモ、チーク、チャイニーズエルム、チャイニーズメープル、ナラ、ハードメイプル、ヒッコリー、ピーカン、ホワイトアッシュ、ホワイトオーク、ホワイトバーチ、レッドオーク及びこれらの関連樹種等）、イネ、ムギ、トウモロコシ（特に、コーンストーバー（とうもろこしの非食部である芯、茎、葉））、パイナップル、オイルパーム、キャッサバ、サトウキビ（特に、サトウキビバガス、サトウキビ茎葉）等の農産物及びその廃棄物；ケナフ、綿等の工業植物及びその廃棄物； アルファルファ、チモシー等の飼料作物； エリエンサス、タケ、ササ等が挙げられ、これらに限定されない。これらのリグノセルロース系バイオマスは単独であってもよく、混合物であってもよい。
本実施形態の微生物の分解対象となるリグノセルロース系バイオマスについて、形状は、例えば、粉末状、チップ状、角材状、丸太状、フレーク状、繊維状等が挙げられ、これらに限定されない。中でも、効率的に本実施形態の微生物による分解を行うという観点から、粉末状、チップ状、フレーク状、又は繊維状であることが好ましい。
本明細書において、「ヘミセルロース」には、キシロース等の５つの炭素を構成単位とする五炭糖とよばれるものやマンノース、アラビノース、ガラクツロン酸等の６つの炭素を構成単位とする六炭糖とよばれるもの、さらにグルコマンナンやグルクロノキシラン等のような複合多糖等が含まれる。よって、ヘミセルロースは加水分解を受けると、炭素５つからなる五炭糖の単糖やその単糖が複数個連結された五炭糖のオリゴ糖、炭素６つからなる六炭糖の単糖やその単糖が複数個連結された六炭糖のオリゴ糖、五炭糖の単糖と六炭糖の単糖が複数個連結されたオリゴ糖を生ずる。
「セルロース」には、６つの炭素を構成単位とする六炭糖が含まれる。よって、セルロースは加水分解を受けると、炭素６つからなる六炭糖の単糖やその単糖が複数個連結された六炭糖のオリゴ糖を生ずる。
一般に、ヘミセルロース又はセルロースから生ずる単糖又はオリゴ糖の構成比率や生成量は、前処理方法や原料として用いたリグノセルロース系バイオマスの種類によって異なる。
「セルロース」には、６つの炭素を構成単位とする六炭糖が含まれる。よって、セルロースは加水分解を受けると、炭素６つからなる六炭糖の単糖やその単糖が複数個連結された六炭糖のオリゴ糖を生ずる。
一般に、ヘミセルロース又はセルロースから生ずる単糖又はオリゴ糖の構成比率や生成量は、前処理方法や原料として用いたリグノセルロース系バイオマスの種類によって異なる。
本明細書において、「リグノセルロース系バイオマス由来化合物」とは、リグノセルロース系バイオマスを分解して得られた単糖及びオリゴ糖を、酵母等の微生物が摂取することにより生成された化合物を意味する。リグノセルロース系バイオマス由来化合物として具体的には、例えば、エタノール、ブタノール、１，３−プロパンジオール、１，４−ブタンジオール、グリセロール等のアルコール；ピルビン酸、フマル酸、コハク酸、リンゴ酸、イタコン酸、クエン酸、酢酸、乳酸等の有機酸；イノシン、グアノシン等のヌクレオシド；イノシン酸、グアニル酸等のヌクレオチド；カダベリン等のジアミン化合物等が挙げられる。得られたリグノセルロース系バイオマス由来化合物が乳酸等のモノマーである場合は、重合によりポリマーに変換することもある。
＜セルロシバクター・アルカリサーモフィラス（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｂａｃｔｅｒ ａｌｋａｌｉｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｗ２１−１０株＞
上記（ａ）における配列番号２に示す塩基配列は、セルロシバクター・アルカリサーモフィラス（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｂａｃｔｅｒ ａｌｋａｌｉｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｗ２１−１０株（ＮＩＴＥ ＢＰ−０２２６５）の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列である。
上記（ａ）における配列番号２に示す塩基配列は、セルロシバクター・アルカリサーモフィラス（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｂａｃｔｅｒ ａｌｋａｌｉｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｗ２１−１０株（ＮＩＴＥ ＢＰ−０２２６５）の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列である。
セルロシバクター・アルカリサーモフィラスＷ２１−１０株の分離精製は、後述の実施例において示す方法により分離精製することができる。得られた菌株は、形態観察その他からセルロシバクター属のアルカリサーモフィラス種と同定し、Ｗ２１−１０株と名付けた。
セルロシバクター・アルカリサーモフィラスＷ２１−１０株の微生物学的性質は以下の通りである。走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて撮影したセルロシバクター・アルカリサーモフィラスＷ２１−１０株の顕微鏡写真を図２の（Ａ）及び（Ｂ）に示す。
（科学的性質）
リグノセルロース分解能を有する。
リグノセルロース分解能を有する。
（形態的性質）
（１）細胞の形状が細長い棒状又は円筒状を示す。細胞の長さは約２．０〜３．０μｍ、幅が約０．２〜０．３μｍである。
（２）グラム陽性菌であり、コロニーは黄色である。
（１）細胞の形状が細長い棒状又は円筒状を示す。細胞の長さは約２．０〜３．０μｍ、幅が約０．２〜０．３μｍである。
（２）グラム陽性菌であり、コロニーは黄色である。
（生殖様式）
（１）菌体の長軸方向が一定で長さだけが長くなるかたちで成長し、ある程度の大きさまで成長すると、その中心でほぼ均等に二分される形で分裂する。
（１）菌体の長軸方向が一定で長さだけが長くなるかたちで成長し、ある程度の大きさまで成長すると、その中心でほぼ均等に二分される形で分裂する。
（生理学・生化学性状）
（１）培養液：一般的なセルロシバクター属の菌を培養するための培地で生育できる。
（２）生育温度域：３７℃以上６５℃以下（至適温度６０℃）。
（３）生育ｐＨ域：ｐＨ８．０〜１０．０（至適ｐＨ９．５）。
（４）栄養源：炭素源として、セルロース、セロビオース、リグノセルロース、澱粉、ペクチン、ソルビトール、マンニトール、又はグリセロールで生育できる。また、窒素源として、硫酸や硝酸アンモニウムのような無機態窒素だけでなく、イーストエキスやペプトン、牛肉エキスのような有機態窒素でも利用できる。
（５）生成物質：酢酸、エタノール、フマル酸、乳酸、コハク酸を生成する。
（１）培養液：一般的なセルロシバクター属の菌を培養するための培地で生育できる。
（２）生育温度域：３７℃以上６５℃以下（至適温度６０℃）。
（３）生育ｐＨ域：ｐＨ８．０〜１０．０（至適ｐＨ９．５）。
（４）栄養源：炭素源として、セルロース、セロビオース、リグノセルロース、澱粉、ペクチン、ソルビトール、マンニトール、又はグリセロールで生育できる。また、窒素源として、硫酸や硝酸アンモニウムのような無機態窒素だけでなく、イーストエキスやペプトン、牛肉エキスのような有機態窒素でも利用できる。
（５）生成物質：酢酸、エタノール、フマル酸、乳酸、コハク酸を生成する。
（分類学的性質）
セルロシバクター・アルカリサーモフィラスＷ２１−１０株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列は、配列表の配列番号２に示したとおりである。図３は、クロストリジウム・スピーシーズＡ７株及びセルロシバクター・アルカリサーモフィラスＷ２１−１０株の１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子の塩基配列と、近縁菌種の１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子の塩基配列とを比較し、作成したヒストグラムである。
この結果、セルロシバクター・アルカリサーモフィラスＷ２１−１０株は新規の菌株と判断した。
セルロシバクター・アルカリサーモフィラスＷ２１−１０株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列は、配列表の配列番号２に示したとおりである。図３は、クロストリジウム・スピーシーズＡ７株及びセルロシバクター・アルカリサーモフィラスＷ２１−１０株の１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子の塩基配列と、近縁菌種の１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子の塩基配列とを比較し、作成したヒストグラムである。
この結果、セルロシバクター・アルカリサーモフィラスＷ２１−１０株は新規の菌株と判断した。
セルロシバクター・アルカリサーモフィラスＷ２１−１０株は、２０１６年５月２４日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）にプタベスト条約の規定化で受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２２６５として国際寄託されている。
（培地）
本実施形態において、セルロシバクター・アルカリサーモフィラスＷ２１−１０株を培養するにあたり、培地を用いることが好ましい。
用いられる培地は、セルロシバクター属の菌が生育する条件であれば制限はなく、例えば、このような培地として、上記表１に示した組成のＢＭＮ培地を好ましく用いることができる。
その他用いることができる培地として、一般的な栄養培地であるＮＢ（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ）培地（例えば、Ｄｉｆｃｏ社製の「Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ， Ｂａｃｔｏ」（牛肉エキス３ｇ／Ｌ、ペプトン５ｇ／Ｌ含有）等）等を挙げることができる。中でも、培地としては、高効率でリグノセルロースを分解することから、上記表１に示した組成のＢＭＮ培地が特に好ましい。
本実施形態において、セルロシバクター・アルカリサーモフィラスＷ２１−１０株を培養するにあたり、培地を用いることが好ましい。
用いられる培地は、セルロシバクター属の菌が生育する条件であれば制限はなく、例えば、このような培地として、上記表１に示した組成のＢＭＮ培地を好ましく用いることができる。
その他用いることができる培地として、一般的な栄養培地であるＮＢ（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ）培地（例えば、Ｄｉｆｃｏ社製の「Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ， Ｂａｃｔｏ」（牛肉エキス３ｇ／Ｌ、ペプトン５ｇ／Ｌ含有）等）等を挙げることができる。中でも、培地としては、高効率でリグノセルロースを分解することから、上記表１に示した組成のＢＭＮ培地が特に好ましい。
（培養方法）
本実施形態において、セルロシバクター・アルカリサーモフィラスＷ２１−１０株の培養方法は、公知慣用の方法で行うことができる。培養において、上記の培地を用いることができる。
本実施形態において、培養方法としては、例えば、静置培養法、振盪培養法、深部通気撹拌培養法等が挙げられる。
本実施形態において、セルロシバクター・アルカリサーモフィラスＷ２１−１０株の培養方法は、公知慣用の方法で行うことができる。培養において、上記の培地を用いることができる。
本実施形態において、培養方法としては、例えば、静置培養法、振盪培養法、深部通気撹拌培養法等が挙げられる。
培養におけるｐＨは、８．０〜１０．０の塩基性で行うことができ、ｐＨ９．５であることが好ましい。
培養温度としては、３７℃以上６５℃以下で行うことができ、６０℃で行うことが好ましい。培養温度が上記範囲内である場合、一般的なリグノセルロース系バイオマスを用いた糖化工程及び発酵工程と同様の温度範囲であるため、セルロシバクター・アルカリサーモフィラスＷ２１−１０株は効率的にリグノセルロースを分解し、糖化液又はリグノセルロース系バイオマス由来化合物を得ることができる。
本実施形態において、上述の培養方法により、セルロシバクター・アルカリサーモフィラスＷ２１−１０株を培養すると、安定した増殖を示すばかりでなく、リグノセルロースの分解能が向上したセルロシバクター・アルカリサーモフィラスＷ２１−１０株が得られる。
本実施形態の微生物は、前記（ａ）と機能的に同等な核酸を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子として、下記（ｂ）の核酸を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するものであってもよい。
（ｂ）配列番号１又は２に示す塩基配列と９５％以上の同一性を有する核酸。
（ｂ）配列番号１又は２に示す塩基配列と９５％以上の同一性を有する核酸。
前記（ａ）の核酸を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子と機能的に同等であるためには９５％以上の同一性を有する。係る同一性としては、９５％以上が好ましく、９６％以上がより好ましく、９７％以上がさらに好ましく、９８％以上が特に好ましく、９９％以上が最も好ましい。
さらに、前記（ｂ）の核酸を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子は、リグノセルロース分解能を有する。
さらに、前記（ｂ）の核酸を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子は、リグノセルロース分解能を有する。
本実施形態の微生物は、前記（ａ）と機能的に同等な核酸を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子として、下記（ｃ）の核酸を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するものであってもよい。
（ｃ）配列番号１又は２に示す塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠損、置換若しくは付加された塩基配列からなる核酸。
（ｃ）配列番号１又は２に示す塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠損、置換若しくは付加された塩基配列からなる核酸。
ここで、欠失、置換、若しくは付加されてもよい塩基の数としては、１個以上１５個以下が好ましく、１個以上１０個以下がより好ましく、１個以上５個以下が特に好ましい。
さらに、前記（ｃ）の核酸を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子は、リグノセルロース分解能を有する。
さらに、前記（ｃ）の核酸を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子は、リグノセルロース分解能を有する。
≪リグノセルロース系バイオマス分解用組成物≫
本発明の一実施形態に係るリグノセルロース系バイオマス分解用組成物は、少なくとも１種の上述の微生物、又は前記微生物由来の酵素若しくは遺伝子産物を含む。
本発明の一実施形態に係るリグノセルロース系バイオマス分解用組成物は、少なくとも１種の上述の微生物、又は前記微生物由来の酵素若しくは遺伝子産物を含む。
本実施形態のリグノセルロース系バイオマス分解用組成物によれば、リグノセルロースを高効率で分解し、糖化液又はリグノセルロース系バイオマス由来化合物を高収率で得ることができる。
本実施形態のリグノセルロース系バイオマス分解用組成物に含まれる微生物としては、上述の≪微生物≫に記載のものと同様のものが挙げられる。中でも、前記微生物としては、クロストリジウム・スピーシーズＡ７株、又はセルロシバクター・アルカリサーモフィラスＷ２１−１０株であることが好ましい。
本実施形態のリグノセルロース系バイオマス分解用組成物において、上述の微生物の代わりに、前記微生物由来の酵素又は遺伝子産物を含んでいてもよい。
前記微生物由来の酵素としては、例えば、エキソ−１，４−β−グルカナーゼ、エンド−１，４−β−グルカナーゼ、セルラーゼ（例えば、エンドグルカナーゼ（ＥＧ）、セロビオハイドロラーゼ（ＣＢＨ）及びβ−グルコシダーゼ（ＢＧＬ）等）、ヘミセルラーゼ（例えば、キシラナーゼ、キシロシダーゼ、マンナナーゼ、ペクチナーゼ、ガラクトシダーゼ、グルクロニダーゼ、アラビノフラノシダーゼ等）等の多糖分解酵素等が挙げられる。
前記微生物由来の酵素としては、例えば、エキソ−１，４−β−グルカナーゼ、エンド−１，４−β−グルカナーゼ、セルラーゼ（例えば、エンドグルカナーゼ（ＥＧ）、セロビオハイドロラーゼ（ＣＢＨ）及びβ−グルコシダーゼ（ＢＧＬ）等）、ヘミセルラーゼ（例えば、キシラナーゼ、キシロシダーゼ、マンナナーゼ、ペクチナーゼ、ガラクトシダーゼ、グルクロニダーゼ、アラビノフラノシダーゼ等）等の多糖分解酵素等が挙げられる。
前記微生物由来の遺伝子産物としては、例えば、上述の酵素をコードするＤＮＡ、又はＲＮＡ等が挙げられる。前記遺伝子産物は、発現ベクターに組み込まれた形であってもよい。発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３等の大腸菌由来のプラスミド；ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４等の枯草菌由来のプラスミド；ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５等の酵母由来プラスミド；λファージ等のバクテリオファージ；アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス、レンチウィルス、ワクシニアウィルス、バキュロウィルス等のウィルス；及びこれらを改変したベクター等が挙げられ、これらに限定されない。
本実施形態のリグノセルロース系バイオマス分解用組成物において、微生物、又は前記微生物由来の酵素若しくは遺伝子産物を１種類含んでいてもよく、又は２種類以上含んでいてもよい。中でも、本実施形態のリグノセルロース系バイオマス分解用組成物は、リグノセルロースを高効率で分解できることから、微生物、又は前記微生物由来の酵素若しくは遺伝子産物を２種類以上含んでいることが好ましい。
＜その他微生物＞
本実施形態のリグノセルロース系バイオマス分解用組成物は、さらに、以下の（ｄ）の核酸を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する微生物のうち少なくとも１種を含んでいてもよい。
（ｄ）配列番号３〜１１のいずれかに示す塩基配列からなる核酸。
本実施形態のリグノセルロース系バイオマス分解用組成物は、さらに、以下の（ｄ）の核酸を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する微生物のうち少なくとも１種を含んでいてもよい。
（ｄ）配列番号３〜１１のいずれかに示す塩基配列からなる核酸。
上記（ｄ）における配列番号３に示す塩基配列は、モレラ・グリセリーニ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｇｌｙｃｅｒｉｎｉ）ＪＷ／ＡＳ−Ｙ６株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に８８％の同一性を有する菌種の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列である。
上記（ｄ）における配列番号４に示す塩基配列は、モレラ・ヒューミフェレラ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｈｕｍｉｆｅｒｒｅａ）６４−ＦＧＱ株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に８７％の同一性を有する菌種の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列である。
上記（ｄ）における配列番号５に示す塩基配列は、テピダナエロバクター・アセタトキシダン（Ｔｅｐｉｄａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｃｅｔａｔｏｘｙｄａｎｓ）Ｒｅ１株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に８８％の同一性を有する菌種の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列である。
上記（ｄ）における配列番号６に示す塩基配列は、テピダナエロバクター・アセタトキシダン（Ｔｅｐｉｄａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｃｅｔａｔｏｘｙｄａｎｓ）Ｒｅ１株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に９１％の同一性を有する菌種の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列である。
上記（ｄ）における配列番号７に示す塩基配列は、テピダナエロバクター・アセタトキシダン（Ｔｅｐｉｄａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｃｅｔａｔｏｘｙｄａｎｓ）Ｒｅ１株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に９５％の同一性を有する菌種の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列である。
上記（ｄ）における配列番号８に示す塩基配列は、テピディマイクロビウム・フェリフィラム（Ｔｅｐｉｄｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｆｅｒｒｉｐｈｉｌｕｍ）ＤＳＭ１６６２４株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に９６％の同一性を有する菌種の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列である。
上記（ｄ）における配列番号９に示す塩基配列は、クロストリジウム・サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）ＤＳＭ１３１３株、又はクロストリジウム・サーモセラムＡＴＣＣ２７４０６株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に９９％の同一性を有する菌種の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列である。
上記（ｄ）における配列番号１０に示す塩基配列は、サーモアナエロバクター・マサラニー（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｍａｔｈｒａｎｉｉ）Ａ３株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に９９％の同一性を有する菌種の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列である。
上記（ｄ）における配列番号１１に示す塩基配列は、難培養微生物（Ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｌｏｎｅ）ＡＴＢ−ＣＫ−１４９２−１１株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に９４％の同一性を有する菌種の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列である。
モレラ・グリセリーニは、好熱性、嫌気性、芽胞形成菌である。
モレラ・ヒューミフェレラは、フミン酸と鉄（ＩＩＩ）との間の往復電子を介して増殖することができる好熱性、嫌気性細菌である。
テピダナエロバクター・アセタトキシダンは、酢酸酸化共生微生物である。
テピディマイクロビウム・フェリフィラムは、嫌気性の中等度好熱菌である。
クロストリジウム・サーモセラムは、セルロソームという特徴的な酵素複合体を有し、効率的なセルロース分解を行う好熱菌である。
サーモアナエロバクター・マサラニーは、好熱性のエタノール生成菌である。
また、一般的に、難培養微生物とは、これまでに分離培養できなかった微生物や既知の微生物種とは系統学的に異なる微生物を意味する。
上記（ｄ）における配列番号４に示す塩基配列は、モレラ・ヒューミフェレラ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｈｕｍｉｆｅｒｒｅａ）６４−ＦＧＱ株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に８７％の同一性を有する菌種の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列である。
上記（ｄ）における配列番号５に示す塩基配列は、テピダナエロバクター・アセタトキシダン（Ｔｅｐｉｄａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｃｅｔａｔｏｘｙｄａｎｓ）Ｒｅ１株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に８８％の同一性を有する菌種の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列である。
上記（ｄ）における配列番号６に示す塩基配列は、テピダナエロバクター・アセタトキシダン（Ｔｅｐｉｄａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｃｅｔａｔｏｘｙｄａｎｓ）Ｒｅ１株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に９１％の同一性を有する菌種の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列である。
上記（ｄ）における配列番号７に示す塩基配列は、テピダナエロバクター・アセタトキシダン（Ｔｅｐｉｄａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｃｅｔａｔｏｘｙｄａｎｓ）Ｒｅ１株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に９５％の同一性を有する菌種の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列である。
上記（ｄ）における配列番号８に示す塩基配列は、テピディマイクロビウム・フェリフィラム（Ｔｅｐｉｄｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｆｅｒｒｉｐｈｉｌｕｍ）ＤＳＭ１６６２４株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に９６％の同一性を有する菌種の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列である。
上記（ｄ）における配列番号９に示す塩基配列は、クロストリジウム・サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）ＤＳＭ１３１３株、又はクロストリジウム・サーモセラムＡＴＣＣ２７４０６株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に９９％の同一性を有する菌種の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列である。
上記（ｄ）における配列番号１０に示す塩基配列は、サーモアナエロバクター・マサラニー（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｍａｔｈｒａｎｉｉ）Ａ３株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に９９％の同一性を有する菌種の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列である。
上記（ｄ）における配列番号１１に示す塩基配列は、難培養微生物（Ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｌｏｎｅ）ＡＴＢ−ＣＫ−１４９２−１１株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に９４％の同一性を有する菌種の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列である。
モレラ・グリセリーニは、好熱性、嫌気性、芽胞形成菌である。
モレラ・ヒューミフェレラは、フミン酸と鉄（ＩＩＩ）との間の往復電子を介して増殖することができる好熱性、嫌気性細菌である。
テピダナエロバクター・アセタトキシダンは、酢酸酸化共生微生物である。
テピディマイクロビウム・フェリフィラムは、嫌気性の中等度好熱菌である。
クロストリジウム・サーモセラムは、セルロソームという特徴的な酵素複合体を有し、効率的なセルロース分解を行う好熱菌である。
サーモアナエロバクター・マサラニーは、好熱性のエタノール生成菌である。
また、一般的に、難培養微生物とは、これまでに分離培養できなかった微生物や既知の微生物種とは系統学的に異なる微生物を意味する。
中でも、本実施形態のリグノセルロース系バイオマス分解用組成物は、配列番号３〜１１のいずれかに示す塩基配列からなる核酸を含む１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する微生物９種を全て含むことが好ましい。これにより、より効率的にリグノセルロースを分解し、糖化液又はリグノセルロース系バイオマス由来化合物を高収率で得ることができる。
また、本実施形態のリグノセルロース系バイオマス分解用組成物は、前記（ｄ）と機能的に同等な核酸を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子として、以下の（ｅ）の核酸を含む１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する微生物を含んでいてもよい。
（ｅ）配列番号３〜１１のいずれかに示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する核酸。
（ｅ）配列番号３〜１１のいずれかに示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する核酸。
前記（ｄ）の核酸を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子と機能的に同等であるためには９５％以上の同一性を有する。係る同一性としては、９５％以上が好ましく、９６％以上がより好ましく、９７％以上がさらに好ましく、９８％以上が特に好ましく、９９％以上が最も好ましい。
さらに、前記（ｅ）の核酸を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子は、リグノセルロース分解能、又はリグノセルロース系バイオマスの分解産物の代謝能を有する。
なお、本明細書において、「リグノセルロース系バイオマスの分解産物の代謝能」とは、リグノセルロース系バイオマスの分解産物を代謝する能力を意味する。リグノセルロース系バイオマスの分解産物の代謝能として具体的には、例えば、リグノセルロース系バイオマスの分解産物である単糖、オリゴ糖、又は有機酸を代謝し、上述のリグノセルロース系バイオマス由来化合物を生成する能力等が挙げられる。
さらに、前記（ｅ）の核酸を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子は、リグノセルロース分解能、又はリグノセルロース系バイオマスの分解産物の代謝能を有する。
なお、本明細書において、「リグノセルロース系バイオマスの分解産物の代謝能」とは、リグノセルロース系バイオマスの分解産物を代謝する能力を意味する。リグノセルロース系バイオマスの分解産物の代謝能として具体的には、例えば、リグノセルロース系バイオマスの分解産物である単糖、オリゴ糖、又は有機酸を代謝し、上述のリグノセルロース系バイオマス由来化合物を生成する能力等が挙げられる。
本実施形態のリグノセルロース系バイオマス分解用組成物は、前記（ｄ）と機能的に同等な核酸を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子として、以下の（ｆ）の核酸を含む１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する微生物を含んでいてもよい。
（ｆ）配列番号３〜１１のいずれかに示す塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠損、置換若しくは付加された塩基配列からなる核酸。
（ｆ）配列番号３〜１１のいずれかに示す塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠損、置換若しくは付加された塩基配列からなる核酸。
ここで、欠失、置換、若しくは付加されてもよい塩基の数としては、１個以上１５個以下が好ましく、１個以上１０個以下がより好ましく、１個以上５個以下が特に好ましい。
さらに、前記（ｆ）の核酸を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子は、リグノセルロース分解能、又はリグノセルロース系バイオマスの分解産物の代謝能を有する。
さらに、前記（ｆ）の核酸を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子は、リグノセルロース分解能、又はリグノセルロース系バイオマスの分解産物の代謝能を有する。
本実施形態のリグノセルロース系バイオマス分解用組成物において、前記（ｄ）〜（ｆ）のいずれかの核酸を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する微生物の代わりに、前記微生物由来の酵素若しくは遺伝子産物を含んでいてもよい。
前記微生物由来の酵素としては、例えば、エキソ−１，４−β−グルカナーゼ、エンド−１，４−β−グルカナーゼ、セルラーゼ（例えば、エンドグルカナーゼ（ＥＧ）、セロビオハイドロラーゼ（ＣＢＨ）及びβ−グルコシダーゼ（ＢＧＬ）等）、ヘミセルラーゼ（例えば、キシラナーゼ、キシロシダーゼ、マンナナーゼ、ペクチナーゼ、ガラクトシダーゼ、グルクロニダーゼ、アラビノフラノシダーゼ等）等の多糖分解酵素等が挙げられ、さらに、タンパク質分解酵素、有機酸分解酵素等を含んでいてもよい。
前記微生物由来の遺伝子産物としては、例えば、上述の酵素をコードするＤＮＡ、又はＲＮＡ等が挙げられる。前記遺伝子産物は、発現ベクターに組み込まれた形であってもよい。発現ベクターとしては、上述において例示したものと同様のものが挙げられる。
本実施形態のリグノセルロース系バイオマス分解用組成物は、含まれる微生物、又は前記微生物由来の酵素若しくは遺伝子産物のリグノセルロース分解能が損なわれないかぎり、どのような形状であってもよく、例えば、凍結乾燥状態であってもよく、液体培地等に撹拌された状態であってもよい。
≪糖化液の製造方法≫
本発明の一実施形態に係る糖化液の製造方法は、上述のリグノセルロース系バイオマス分解用組成物を用いて、リグノセルロース系バイオマスから糖化液を生成させる糖化工程を備える方法である。
本発明の一実施形態に係る糖化液の製造方法は、上述のリグノセルロース系バイオマス分解用組成物を用いて、リグノセルロース系バイオマスから糖化液を生成させる糖化工程を備える方法である。
本実施形態の製造方法によれば、リグノセルロース系バイオマスから糖化液を高効率及び高収率で得ることができる。
＜糖化工程＞
上述のリグノセルロース系バイオマス分解用組成物を用いて、リグノセルロース系バイオマスから糖化液を生成させる。
上述のリグノセルロース系バイオマス分解用組成物を用いて、リグノセルロース系バイオマスから糖化液を生成させる。
本実施形態の製造方法で用いられるリグノセルロース系バイオマスとしては、上述の≪微生物≫で例示されたものと同様のものが挙げられる。
本実施形態の製造方法において、リグノセルロース系バイオマス１００重量部に対して水分を５〜５００重量部、好ましくは５０〜４００重量部、さらに好ましくは５０〜３００重量部程度添加することにより、水分含量を調整すればよい。
また、さらにリグノセルロース系バイオマスには、上述のリグノセルロース系バイオマス分解用組成物に含まれるものが微生物である場合、該微生物の生育に必要とされる塩や栄養素（例えば、ふすま、ペプトン、コーンスティープリカー、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、ポテトエキス、米ぬか、合成無機塩類等）を添加してもよい。
又は、水分、塩や栄養素の代わりに、前記微生物の生育に使用可能な培地を添加してもよい。培地としては、上述の＜クロストリジウム・スピーシーズ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．）Ａ７株＞で例示されたものと同様のものが挙げられる。
また、リグノセルロース系バイオマスは、上述のリグノセルロース系バイオマス分解用組成物と混合する前に、雑菌の繁殖を防止するために、加熱殺菌等の殺菌処理を行ってもよい。
また、さらにリグノセルロース系バイオマスには、上述のリグノセルロース系バイオマス分解用組成物に含まれるものが微生物である場合、該微生物の生育に必要とされる塩や栄養素（例えば、ふすま、ペプトン、コーンスティープリカー、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、ポテトエキス、米ぬか、合成無機塩類等）を添加してもよい。
又は、水分、塩や栄養素の代わりに、前記微生物の生育に使用可能な培地を添加してもよい。培地としては、上述の＜クロストリジウム・スピーシーズ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．）Ａ７株＞で例示されたものと同様のものが挙げられる。
また、リグノセルロース系バイオマスは、上述のリグノセルロース系バイオマス分解用組成物と混合する前に、雑菌の繁殖を防止するために、加熱殺菌等の殺菌処理を行ってもよい。
糖化温度は、４５℃以上７０℃以下が好ましく、４５℃以上６５℃以下がより好ましく、５０℃以上６０℃以下が特に好ましい。また、糖化時間は１２時間以上１２０時間以下が好ましく、２４時間以上９６時間以下がより好ましく、２４時間以上７２時間以下がさらに好ましい。
糖化工程において、上述の糖化反応条件については、上述のリグノセルロース系バイオマス分解用組成物に含まれる微生物、酵素、又は遺伝子産物の種類や目的とする糖化の程度等に基づいて適宜設定される。
本実施形態の製造方法において、糖化工程の前に、前処理工程を備えていてもよい。
前処理工程としては、例えば、粉砕処理、マイクロ波照射、爆砕処理、蒸煮処理、放射線照射処理、化学処理（例えば、ソルボリシス処理、オゾン処理、アルカリ処理、酸処理、酸化剤処理、還元剤処理等）、菌処理、酸化酵素処理、又はこれらの複合処理等が挙げられる。
前処理工程としては、例えば、粉砕処理、マイクロ波照射、爆砕処理、蒸煮処理、放射線照射処理、化学処理（例えば、ソルボリシス処理、オゾン処理、アルカリ処理、酸処理、酸化剤処理、還元剤処理等）、菌処理、酸化酵素処理、又はこれらの複合処理等が挙げられる。
糖化工程により、リグノセルロース系バイオマスが低分子化されて単糖又はオリゴ糖が生成され、前記単糖又はオリゴ糖を含む糖化液を得ることができる。
この低分子化された前記単糖又はオリゴ糖を炭素源として利用して各種の発酵処理等を行うことにより、後述の≪リグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造方法≫に記載のとおり、各種リグノセルロース系バイオマス由来化合物を製造することができる。
この低分子化された前記単糖又はオリゴ糖を炭素源として利用して各種の発酵処理等を行うことにより、後述の≪リグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造方法≫に記載のとおり、各種リグノセルロース系バイオマス由来化合物を製造することができる。
≪リグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造方法≫
本発明の一実施形態に係るリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造方法は、上述の糖化液の製造方法を用いて、糖化液を製造した後、前記糖化液からリグノセルロース系バイオマス由来化合物を生産させる生産工程を備える方法である。
本発明の一実施形態に係るリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造方法は、上述の糖化液の製造方法を用いて、糖化液を製造した後、前記糖化液からリグノセルロース系バイオマス由来化合物を生産させる生産工程を備える方法である。
本実施形態の製造方法によれば、糖化液からリグノセルロース系バイオマス由来化合物を高効率及び高収率で得ることができる。
＜生産工程＞
上記の≪糖化液の製造方法≫により得られた糖化液を用いて、リグノセルロース系バイオマス由来化合物を生産させる。
上記の≪糖化液の製造方法≫により得られた糖化液を用いて、リグノセルロース系バイオマス由来化合物を生産させる。
生産工程としては、リグノセルロース系バイオマス由来化合物が得られる処理方法であればよく、例えば、発酵処理、化学合成処理等が挙げられる。発酵としては、例えば、エタノール発酵、メタン発酵、水素発酵、アセトン−ブタノール発酵、乳酸発酵、コハク酸発酵、イタコン酸発酵、アミノ酸発酵等が挙げられる。これらの発酵処理に使用される微生物や発酵処理条件は公知のものを用いればよい。
また、前記発酵処理は、上記糖化工程の後に行ってもよく、また上記糖化工程と同時に行ってもよい。後者の発酵処理と糖化工程とを同時に行う場合には、糖化工程に要する上述のリグノセルロース系バイオマス分解用組成物と、発酵処理に要する微生物（例えば、酵母等）とを共存させて、上述のリグノセルロース系バイオマス分解用組成物と微生物との双方が、有効に作用若しくは生育できる条件に設定してインキュベートすればよい。
発酵処理に用いられる微生物としては、目的のリグノセルロース系バイオマス由来化合物を生成できるものであれば、特別な限定はない。発酵処理に用いられる微生物として具体的には、酵母や細菌等が挙げられ、遺伝子組換え微生物であってもよい。遺伝子組換え微生物とは、アルコール等の目的のリグノセルロース系バイオマス由来化合物への変換に必要な酵素遺伝子を有していない微生物に、遺伝子工学技術によりこれら遺伝子を導入し、アルコール等の目的のリグノセルロース系バイオマス由来化合物の生成を可能にしたものである。遺伝子組換え微生物としては、例えば、アルコール発酵性を有する遺伝子組換え大腸菌等が挙げられる。
生産工程において得られるリグノセルロース系バイオマス由来化合物としては、上述の≪微生物≫で例示されたものと同様のものが挙げられる。
また、本実施形態の製造方法において、生成工程の後に、精製工程を備えていてもよい。
精製工程は、前記生成工程において得られたリグノセルロース系バイオマス化合物を精製するための工程である。
精製方法としては、リグノセルロース系バイオマス化合物がアルコール類である場合は、例えば、蒸留法等が挙げられる。また、リグノセルロース系バイオマス化合物がアミノ酸類である場合は、例えば、イオン交換法、活性炭を用いた異物の吸着除去法等が挙げられる。
精製工程は、前記生成工程において得られたリグノセルロース系バイオマス化合物を精製するための工程である。
精製方法としては、リグノセルロース系バイオマス化合物がアルコール類である場合は、例えば、蒸留法等が挙げられる。また、リグノセルロース系バイオマス化合物がアミノ酸類である場合は、例えば、イオン交換法、活性炭を用いた異物の吸着除去法等が挙げられる。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
（１）バイオマス分解菌の選別
まず、サトウキビ茎葉、籾殻、及び牛糞尿を含む堆肥サンプル湿重量約２〜５ｇと、オイルパーム幹の搾汁後の繊維物、又はトウモロコシ茎葉をコーヒーミルにて粉砕した繊維物とを、ＢＭＮ培地２０〜２５ｍＬに懸濁した。次いで、得られた懸濁液を窒素（工業用グレード）にて十分にバブリングし、気相を窒素ガスで置換した後、ブチルゴム栓で密閉し、６０℃にて３日間から１週間程度培養を行った。
なお、ＢＭＮ培地の組成は、１．５ｇ／Ｌのリン酸二水素カリウム、２．９ｇ／Ｌのリン酸水素二カリウム、２．１ｇ／Ｌの尿素、２ｇ／Ｌの酵母エキス（ディフコ社製）、４ｇ／Ｌの炭酸ナトリウム、０．５ｇ／Ｌのシステイン塩酸塩、０．２ｍＬのミネラル溶液(ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ５ｇ; ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．７５ｇ; ＦｅＳＯ４・６Ｈ２Ｏ ０．００６３ｇを水４ｍＬに溶解したもの)である。
（１）バイオマス分解菌の選別
まず、サトウキビ茎葉、籾殻、及び牛糞尿を含む堆肥サンプル湿重量約２〜５ｇと、オイルパーム幹の搾汁後の繊維物、又はトウモロコシ茎葉をコーヒーミルにて粉砕した繊維物とを、ＢＭＮ培地２０〜２５ｍＬに懸濁した。次いで、得られた懸濁液を窒素（工業用グレード）にて十分にバブリングし、気相を窒素ガスで置換した後、ブチルゴム栓で密閉し、６０℃にて３日間から１週間程度培養を行った。
なお、ＢＭＮ培地の組成は、１．５ｇ／Ｌのリン酸二水素カリウム、２．９ｇ／Ｌのリン酸水素二カリウム、２．１ｇ／Ｌの尿素、２ｇ／Ｌの酵母エキス（ディフコ社製）、４ｇ／Ｌの炭酸ナトリウム、０．５ｇ／Ｌのシステイン塩酸塩、０．２ｍＬのミネラル溶液(ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ５ｇ; ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．７５ｇ; ＦｅＳＯ４・６Ｈ２Ｏ ０．００６３ｇを水４ｍＬに溶解したもの)である。
次いで、３日間から１週間程度培養後、サンプルを加えていない上記培養液と比較し、微生物分解による繊維物の色の変化や添加量の明らかな減少や粉末に粘性が認められ、明らかに様子の相違が認められる培養液を選択した。次いで、選択した培養液をよく攪拌懸濁して、そのうち０．５ｍＬの培養液を新しい前記繊維物を含むＢＭＮ培地へ接種し、再度同条件にて培養を行った。この操作を２〜３回繰り返し、バイオマス繊維分解菌を集積培養した。
次いで、約４日間の集積培養後、１％のバイオマス繊維物の容量を目視で半減以下とできる培養液を選択した。その培養液の一部を、１％バイオマス繊維物、１．５％寒天（ディフコ社製）を含むＢＭＮ寒天培地に、適当な希釈倍率にて接種し、６０℃、１２０時間〜１４４時間培養を行った。
１２０時間〜１４４時間後に出現したコロニーのみ選択し、再度１％の前記バイオマス繊維物を含むＢＭＮ液体培地に接種し、分解能を確認した。さらに分離したセルロース分解菌を純化するため、このコロニー分離操作を２回繰り返した。
１２０時間〜１４４時間後に出現したコロニーのみ選択し、再度１％の前記バイオマス繊維物を含むＢＭＮ液体培地に接種し、分解能を確認した。さらに分離したセルロース分解菌を純化するため、このコロニー分離操作を２回繰り返した。
さらに分解菌を純化するために、前記分離したコロニーの培養液一部を、０．５％セロビオース、又は１％結晶性セルロースを含むＢＭＮ寒天培地にそれぞれ接種した。次いで、０．５％セロビオースを含む寒天培地に出現したコロニーは嫌気条件下で単離分離し、バイオマス繊維物を含むＢＭＮ培地で分解能を確認し、高分解性を示すコロニーについて最終的に高分解性菌として選別し、ＩＳＩ−３と命名した。
（２）バイオマス分解能の検討
次いで、（１）で餞別したＩＳＩ−３について、バイオマス分解能を検討するために、様々なバイオマス繊維物を用いて繊維分解能の検討を行った。以下の６種類のバイオマス繊維物を用いて、ＩＳＩ−３のバイオマス分解能を測定した。
ｉ）スターチ工場から排出されるキャッサバパルプ乾燥物（以下、「キャッサバパルプ」と称することがある。）
ｉｉ）サトウキビ搾汁残渣であるサトウキビ繊維（サトウキビバガス）の粉砕物（以下、「サトウキビバガス」と称することがある。）
ｉｉｉ）トウモロコシ茎葉（コーン茎葉）の粉砕物（以下、「コーン茎葉」と称することがある。）
ｉｖ）オイルパーム古木から得られた搾汁後の繊維粉砕物（以下、「パーム幹繊維」と称することがある。）
ｖ）稲わら粉砕物（以下、「キャッサバパルプ」と称することがある。）
ｖｉ）サトウキビ近縁野生種エリアンサスの乾燥繊維粉砕物（以下、「エリアンサス」と称することがある。）
前記６種類のバイオマスはそれぞれ、７０℃で３日間乾燥させ、粉砕ミル（ワンダーブレンダー ＷＢ−１大阪ケミカル社製）を用いて粉砕した。
バイオマス分解能の測定方法は１％の前記バイオマスをそれぞれ含むＢＭＮ液体培地を用いて、ＩＳＩ−３を接種することで外観の容量の減少、及び投入した各バイオマスの重量から最終的に分解物の乾燥重量の差を算出し、比率に表すことにより分解できたバイオマス量を算出した。
分解できたバイオマス量の算出方法としてより具体的には、まず、前記バイオマスを含むＢＭＮ液体培地、及びＩＳＩ−３のそれぞれの培養液を用い、残存する固形物が均一になるように良く混合した。次いで、その培養液からそれぞれ３ｍＬを３本採取し、あらかじめ空の重量を測定してある１５ｍＬのファルコンチューブへ移した。次いで、ファルコンチューブを４℃にて８，０００回転にて上清と沈殿物に分離した。前記沈殿物は５ｍＬの蒸留水で懸濁し、再度、遠心分離を行い、上清を取り除いた。次いで、得られた沈殿物を乾燥させるため、８０℃の恒温器にて３日間乾燥させた。次いで、乾燥させた沈殿物を含むファルコンチューブの重量を測定し、空のファルコンチューブ重量を差し引くことで沈殿物の乾燥重量を算出した。次いで、得られた乾燥重量を３で割ることで、１ｍＬ中のバイオマス乾燥重量とした。さらに、バイオマス分解率（糖化し可溶化したバイオマス量の割合）を以下の計算式により算出した。試験は３回繰り返し、平均値を得た。
バイオマス分解率（％）
＝［｛（分解前のバイオマス乾燥重量［ｇ／ｍＬ］）−（分解後の培養液中に含まれた残渣の乾燥重量［ｇ／ｍＬ］）｝／分解前のバイオマス乾燥重量［ｇ／ｍＬ］］×１００
次いで、（１）で餞別したＩＳＩ−３について、バイオマス分解能を検討するために、様々なバイオマス繊維物を用いて繊維分解能の検討を行った。以下の６種類のバイオマス繊維物を用いて、ＩＳＩ−３のバイオマス分解能を測定した。
ｉ）スターチ工場から排出されるキャッサバパルプ乾燥物（以下、「キャッサバパルプ」と称することがある。）
ｉｉ）サトウキビ搾汁残渣であるサトウキビ繊維（サトウキビバガス）の粉砕物（以下、「サトウキビバガス」と称することがある。）
ｉｉｉ）トウモロコシ茎葉（コーン茎葉）の粉砕物（以下、「コーン茎葉」と称することがある。）
ｉｖ）オイルパーム古木から得られた搾汁後の繊維粉砕物（以下、「パーム幹繊維」と称することがある。）
ｖ）稲わら粉砕物（以下、「キャッサバパルプ」と称することがある。）
ｖｉ）サトウキビ近縁野生種エリアンサスの乾燥繊維粉砕物（以下、「エリアンサス」と称することがある。）
前記６種類のバイオマスはそれぞれ、７０℃で３日間乾燥させ、粉砕ミル（ワンダーブレンダー ＷＢ−１大阪ケミカル社製）を用いて粉砕した。
バイオマス分解能の測定方法は１％の前記バイオマスをそれぞれ含むＢＭＮ液体培地を用いて、ＩＳＩ−３を接種することで外観の容量の減少、及び投入した各バイオマスの重量から最終的に分解物の乾燥重量の差を算出し、比率に表すことにより分解できたバイオマス量を算出した。
分解できたバイオマス量の算出方法としてより具体的には、まず、前記バイオマスを含むＢＭＮ液体培地、及びＩＳＩ−３のそれぞれの培養液を用い、残存する固形物が均一になるように良く混合した。次いで、その培養液からそれぞれ３ｍＬを３本採取し、あらかじめ空の重量を測定してある１５ｍＬのファルコンチューブへ移した。次いで、ファルコンチューブを４℃にて８，０００回転にて上清と沈殿物に分離した。前記沈殿物は５ｍＬの蒸留水で懸濁し、再度、遠心分離を行い、上清を取り除いた。次いで、得られた沈殿物を乾燥させるため、８０℃の恒温器にて３日間乾燥させた。次いで、乾燥させた沈殿物を含むファルコンチューブの重量を測定し、空のファルコンチューブ重量を差し引くことで沈殿物の乾燥重量を算出した。次いで、得られた乾燥重量を３で割ることで、１ｍＬ中のバイオマス乾燥重量とした。さらに、バイオマス分解率（糖化し可溶化したバイオマス量の割合）を以下の計算式により算出した。試験は３回繰り返し、平均値を得た。
バイオマス分解率（％）
＝［｛（分解前のバイオマス乾燥重量［ｇ／ｍＬ］）−（分解後の培養液中に含まれた残渣の乾燥重量［ｇ／ｍＬ］）｝／分解前のバイオマス乾燥重量［ｇ／ｍＬ］］×１００
前記６種類のバイオマス繊維物を用いたＩＳＩ−３のバイオマス分解能の検討試験の結果を図４及び図５に示す。図４は、ＩＳＩ−３接種後の培養５日目における各バイオマスでの分解の様子を示す画像である。各バイオマス繊維物の画像において、左側の培養チューブはＩＳＩ−３の接種なしのコントロールであり、右側の培養チューブはＩＳＩ−３の接種ありの培養物である。また、図５は、ＩＳＩ−３接種後の培養５日目における各バイオマスでの分解率を示すグラフである。
図４及び図５から、ＩＳＩ−３によるバイオマスの分解効率は、６種のバイオマスにおいて、４０〜６０％程度の分解効率であった。
（３）ＩＳＩ−３に含まれる菌種の同定
（３−１）ゲノムＤＮＡの抽出
ＩＳＩ−３の分類学上の性質を明らかにするために、１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列解析を行った。ＩＳＩ−３のゲノムＤＮＡは、以下の手順により抽出した。
まず、前記バイオマス繊維物を炭素源として含むＢＭＮ液体培地を用いて、それぞれＩＳＩ−３を４日間培養した。次いで、培養物を４℃にて１０，０００回転で５分間、遠心分離して、それぞれのバイオマスで培養した菌体を回収した。次いで、得られた菌体を溶菌させるために、最終濃度０．５％となるように１０％ＳＤＳ（ラウリル硫酸ナトリウム）と、最終濃度５μｇ／ｍＬとになるようにプロテナーゼＫ（１ｍｇ／ｍＬ）溶液とを加え、３７℃で１時間反応させた。次いで、最終濃度１％となるように１０％臭化セチルトリメチルアンモニウム−０．７Ｍ塩化ナトリウム溶液を加え、６５℃で１０分間反応させた。次いで、反応後の培養液と等量のクロロフォルム−イソアミルアルコール溶液を加え、よく攪拌した。次いで、１５，０００回転、５分間遠心分離を行い、水層を得た。次いで、得られた水層に再度、フェノール−クロロフォルム−イソアミルアルコール混合液を水層と等量加え、攪拌した。次いで、１５，０００回転、５分間遠心分離を行い、水層を得た。次いで、得られた水層に対し、０．６倍容量のイソプロパノールを加えゲノムＤＮＡを析出させた。次いで、遠心分離を行い、ゲノムＤＮＡを調製した。次いで、調製したゲノムＤＮＡを７０％エタノールで洗浄し、乾燥した。
（３−１）ゲノムＤＮＡの抽出
ＩＳＩ−３の分類学上の性質を明らかにするために、１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列解析を行った。ＩＳＩ−３のゲノムＤＮＡは、以下の手順により抽出した。
まず、前記バイオマス繊維物を炭素源として含むＢＭＮ液体培地を用いて、それぞれＩＳＩ−３を４日間培養した。次いで、培養物を４℃にて１０，０００回転で５分間、遠心分離して、それぞれのバイオマスで培養した菌体を回収した。次いで、得られた菌体を溶菌させるために、最終濃度０．５％となるように１０％ＳＤＳ（ラウリル硫酸ナトリウム）と、最終濃度５μｇ／ｍＬとになるようにプロテナーゼＫ（１ｍｇ／ｍＬ）溶液とを加え、３７℃で１時間反応させた。次いで、最終濃度１％となるように１０％臭化セチルトリメチルアンモニウム−０．７Ｍ塩化ナトリウム溶液を加え、６５℃で１０分間反応させた。次いで、反応後の培養液と等量のクロロフォルム−イソアミルアルコール溶液を加え、よく攪拌した。次いで、１５，０００回転、５分間遠心分離を行い、水層を得た。次いで、得られた水層に再度、フェノール−クロロフォルム−イソアミルアルコール混合液を水層と等量加え、攪拌した。次いで、１５，０００回転、５分間遠心分離を行い、水層を得た。次いで、得られた水層に対し、０．６倍容量のイソプロパノールを加えゲノムＤＮＡを析出させた。次いで、遠心分離を行い、ゲノムＤＮＡを調製した。次いで、調製したゲノムＤＮＡを７０％エタノールで洗浄し、乾燥した。
（３−２）ゲノムＤＮＡの増幅
１６Ｓ ｒＲＮＡ増幅用ＰＣＲプライマーは、２７Ｆオリゴヌクレオチドプライマー（５’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’：配列番号１２）、及び１４９２Ｒオリゴヌクレオチドプライマー（５’−ＧＧＣＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ−３’：配列番号１３）を用いた。また、ＰＣＲは、ＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）により、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の増幅を行った。ＰＣＲの条件は９８℃１分間、５５℃１分間、７２℃２分間を３０サイクルの条件において増幅を行った。得られたＰＣＲ産物は、０．８％アガロースゲル電気泳動で増幅されたバンドを確認後、ＱＩＡＧＥＮ ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、増幅されたＰＣＲ産物を精製した。
１６Ｓ ｒＲＮＡ増幅用ＰＣＲプライマーは、２７Ｆオリゴヌクレオチドプライマー（５’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’：配列番号１２）、及び１４９２Ｒオリゴヌクレオチドプライマー（５’−ＧＧＣＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ−３’：配列番号１３）を用いた。また、ＰＣＲは、ＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）により、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の増幅を行った。ＰＣＲの条件は９８℃１分間、５５℃１分間、７２℃２分間を３０サイクルの条件において増幅を行った。得られたＰＣＲ産物は、０．８％アガロースゲル電気泳動で増幅されたバンドを確認後、ＱＩＡＧＥＮ ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、増幅されたＰＣＲ産物を精製した。
（３−３）ゲノムＤＮＡの解析
塩基配列解析及び相同性検索については、参考文献１及び２に記載された手法（参考文献１：［Lane, D. J., et al., “In Stackebrandt, E. and Goodfellow, M. (eds.), Nucleic acid techniques in bacterial systematics “, 16S/23S rRNA sequencing. p115-175, John Wiley & Sons, New York, 1991.］、参考文献２：［Takai, K. and Horikoshi, K., “Rapid detection and quatification of members of archaeal community by quantitative PCR using fluorogenic probes”, Appl. Environ. Microbiol., 66, p5066-5072, 2000.］）に基づき、ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪのデータベースを用いてＢＬＡＳＴ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi）により実施した。
ＩＳＩ−３を接種したそれぞれのバイオマスにおける微生物コンソーシアムを考えるため、増幅した１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を利用して分子系統解析を行ったところ、１２の微生物の存在が確認された。この１１つの微生物の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号１〜１１に示す。相同性検索の結果、ＩＳＩ−３に含まれる微生物コンソーシアムは、以下の１１の微生物である。
・Ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ． ｃｌｏｎｅ Ｄｅ３１７６の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に９９％の相同性をもつ菌種（配列番号１）
・Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｂａｃｔｅｒ ａｌｋａｌｉｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ａ６の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に９９％の相同性を持つ菌種（配列番号２）
・Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｇｌｙｃｅｒｉｎｉ ｓｔｒａｉｎ ＪＷ ＡＳ−Ｙ６の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に８８％の相同性をもつ菌種（配列番号３）
・Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｈｕｍｉｆｅｒｒｅａ ｓｔｒａｉｎ ６４−ＦＧＱの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に８７％の相同性をもつ菌種（配列番号４）
・Ｔｅｐｉｄａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｃｅｔａｔｏｘｙｄａｎｓ ｓｔｒａｉｎ Ｒｅ１の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に８８％、９１％、又は９５％の相同性をもつ３つの菌種（配列番号５、配列番号６、配列番号７）
・Ｔｅｐｉｄｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｆｅｒｒｉｐｈｉｌｕｍ ｓｔｒａｉｎ ＤＳＭ １６６２４の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に９６％の相同性を示す菌種（配列番号８）
・Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ ＤＳＭ １３１３、又はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ ＡＴＣＣ ２７４０６の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に９９％の相同性をもつ菌種（配列番号９）
・Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｍａｔｈｒａｎｉｉ Ａ３の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に９９％の相同性をもつ菌種（配列番号１０）
・Ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｌｏｎｅ ＡＴＢ−ＣＫ−１４９２−１１の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に９４％の相同性を示す菌種（配列番号１１）
また、今回のＩＳＩ−３に含まれる菌種の同定によって、常に２種類〜５種類程度の菌種がコンソーシアムを組み共存し、バイオマスの効率的分解を行っていることが明らかとなった。
塩基配列解析及び相同性検索については、参考文献１及び２に記載された手法（参考文献１：［Lane, D. J., et al., “In Stackebrandt, E. and Goodfellow, M. (eds.), Nucleic acid techniques in bacterial systematics “, 16S/23S rRNA sequencing. p115-175, John Wiley & Sons, New York, 1991.］、参考文献２：［Takai, K. and Horikoshi, K., “Rapid detection and quatification of members of archaeal community by quantitative PCR using fluorogenic probes”, Appl. Environ. Microbiol., 66, p5066-5072, 2000.］）に基づき、ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪのデータベースを用いてＢＬＡＳＴ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi）により実施した。
ＩＳＩ−３を接種したそれぞれのバイオマスにおける微生物コンソーシアムを考えるため、増幅した１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を利用して分子系統解析を行ったところ、１２の微生物の存在が確認された。この１１つの微生物の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号１〜１１に示す。相同性検索の結果、ＩＳＩ−３に含まれる微生物コンソーシアムは、以下の１１の微生物である。
・Ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ． ｃｌｏｎｅ Ｄｅ３１７６の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に９９％の相同性をもつ菌種（配列番号１）
・Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｂａｃｔｅｒ ａｌｋａｌｉｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ａ６の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に９９％の相同性を持つ菌種（配列番号２）
・Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｇｌｙｃｅｒｉｎｉ ｓｔｒａｉｎ ＪＷ ＡＳ−Ｙ６の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に８８％の相同性をもつ菌種（配列番号３）
・Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｈｕｍｉｆｅｒｒｅａ ｓｔｒａｉｎ ６４−ＦＧＱの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に８７％の相同性をもつ菌種（配列番号４）
・Ｔｅｐｉｄａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｃｅｔａｔｏｘｙｄａｎｓ ｓｔｒａｉｎ Ｒｅ１の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に８８％、９１％、又は９５％の相同性をもつ３つの菌種（配列番号５、配列番号６、配列番号７）
・Ｔｅｐｉｄｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｆｅｒｒｉｐｈｉｌｕｍ ｓｔｒａｉｎ ＤＳＭ １６６２４の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に９６％の相同性を示す菌種（配列番号８）
・Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ ＤＳＭ １３１３、又はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ ＡＴＣＣ ２７４０６の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に９９％の相同性をもつ菌種（配列番号９）
・Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｍａｔｈｒａｎｉｉ Ａ３の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に９９％の相同性をもつ菌種（配列番号１０）
・Ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｌｏｎｅ ＡＴＢ−ＣＫ−１４９２−１１の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に９４％の相同性を示す菌種（配列番号１１）
また、今回のＩＳＩ−３に含まれる菌種の同定によって、常に２種類〜５種類程度の菌種がコンソーシアムを組み共存し、バイオマスの効率的分解を行っていることが明らかとなった。
次いで、炭素源として使用した各バイオマス繊維物において、ＩＳＩ−３の微生物コンソーシアムが存在する微生物の種類を整理し、表２に示した。
全てのバイオマス繊維物を用いた培養において存在したのは、Ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ． ｃｌｏｎｅ Ｄｅ３１７６の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に９９％の相同性をもつ菌種、及びＣｅｌｌｕｌｏｓｉｂａｃｔｅｒ ａｌｋａｌｉｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ａ６の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に９９％の相同性を持つ菌種であった。
また、続いて、多種のバイオマス（キャッサバパルプ、サトウキビバガス、コーン茎葉、パーム幹繊維、及びエリアンサス）を用いた培養において存在したのは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ ＤＳＭ １３１３であった。
また、キャッサバパルプ、サトウキビバガス、コーン茎葉、及びパーム幹繊維において存在したのは、Ｔｅｐｉｄａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｃｅｔａｔｏｘｙｄａｎｓ ｓｔｒａｉｎ Ｒｅ１に８８％、又は９１％の相同性を有する菌種、Ｔｅｐｉｄｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｆｅｒｒｉｐｈｉｌｕｍ ｓｔｒａｉｎ ＤＳＭ １６６２４ に９６％の相同性を有する菌種、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｍａｔｈｒａｎｉｉ Ａ３に９９％の相同性を有する菌種であった。
また、コーン茎葉、パーム幹繊維、及びエリアンサスを用いた培養において存在したのは、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｇｌｙｃｅｒｉｎｉ ｓｔｒａｉｎ ＪＷ／ＡＳ−Ｙ６に８８％の相同性を有する菌種、及びＵｎｃｕｌｔｕｒｅｄ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｌｏｎｅ ＡＴＢ−ＣＫ−１４９２−１１に９４％の相同性を有する菌種であった。
さらに、キャッサバパルプ、及びパーム幹繊維を用いた培養において存在したのは、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｈｕｍｉｆｅｒｒｅａ ｓｔｒａｉｎ ６４−ＦＧＱに８７％の相同性を有する菌種であった。
以上のことから、バイオマスの種類によって、これら存在が確認された微生物種がコンソーシアムを作り、バイオマスを効率的に分解していることが明らかとなった。
また、今回の培養試験の結果から、バイオマスの効率的な分解においてＵｎｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ． ｃｌｏｎｅ Ｄｅ３１７６の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に９９％の相同性をもつ菌種、及びＣｅｌｌｕｌｏｓｉｂａｃｔｅｒ ａｌｋａｌｉｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ａ６の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に９９％の相同性を持つ菌種、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属細菌、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌、Ｔｅｐｉｄａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌、Ｔｅｐｉｄｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ 属細菌、及びＭｏｏｒｅｌｌａ属細菌の関与が重要であることが明らかとなった。
中でも、Ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ． ｃｌｏｎｅ Ｄｅ３１７６の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に９９％の相同性をもつ菌種、及びＣｅｌｌｕｌｏｓｉｂａｃｔｅｒ ａｌｋａｌｉｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ａ６の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に９９％の相同性を持つ菌種に関しては、特に、全てのバイオマスにおいて存在が確認されたことから、これら全てのバイオマス分解に重要な役割を行っていることが示唆される。そこで、上記２種類の菌種に関しては、ＩＳＩ−３から純粋分離を試みた。
中でも、Ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ． ｃｌｏｎｅ Ｄｅ３１７６の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に９９％の相同性をもつ菌種、及びＣｅｌｌｕｌｏｓｉｂａｃｔｅｒ ａｌｋａｌｉｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ａ６の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に９９％の相同性を持つ菌種に関しては、特に、全てのバイオマスにおいて存在が確認されたことから、これら全てのバイオマス分解に重要な役割を行っていることが示唆される。そこで、上記２種類の菌種に関しては、ＩＳＩ−３から純粋分離を試みた。
（４）２種類の菌種の単離
（３）の結果から、Ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ． ｃｌｏｎｅ Ｄｅ３１７６の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に９９％の相同性をもつ菌種、及びＣｅｌｌｕｌｏｓｉｂａｃｔｅｒ ａｌｋａｌｉｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ａ６の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に９９％の相同性を持つ菌種は、セルロース分解能が高い菌株であることが推察された。そこで、ＩＳＩ−３から、特にセルロース分解能の高い菌を分離するため、１％結晶性セルロースを含むＢＭＮ寒天培地によりセルロース分解に伴うハロー形成可能な菌株を単離した。次いで、分離したコロニーは１％結晶性セルロースを含むＢＭＮ寒天培地によるシングルコロニーの分離操作を行い、本操作を３回繰り返した。最終的に、１％結晶性セルロースを含むＢＭ７寒天培地（ＢＭ７培地の組成は、参考文献：「特開２０１０−５１２９５号公報」参照。）において、７２〜８０時間で結晶性セルロース分解によるハローを形成出来るかどうかを確認した。
その結果、セルロース分解に伴うハローを形成可能な菌株を数株単離し、再度１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を明らかにした。得られたＤＮＡ配列データを用いて、（３）と同様にＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪのデータベースを用いてＢＬＡＳＴによる相同性解析を行い、Ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ． ｃｌｏｎｅ Ｄｅ３１７６に９６％の相同性を持つかどうか、又はＣｅｌｌｕｌｏｓｉｂａｃｔｅｒ ａｌｋａｌｉｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｔｒａｉｎ Ａ６に９９％の相同性を持つかどうかを確認した。
（３）の結果から、Ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ． ｃｌｏｎｅ Ｄｅ３１７６の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に９９％の相同性をもつ菌種、及びＣｅｌｌｕｌｏｓｉｂａｃｔｅｒ ａｌｋａｌｉｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ａ６の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に９９％の相同性を持つ菌種は、セルロース分解能が高い菌株であることが推察された。そこで、ＩＳＩ−３から、特にセルロース分解能の高い菌を分離するため、１％結晶性セルロースを含むＢＭＮ寒天培地によりセルロース分解に伴うハロー形成可能な菌株を単離した。次いで、分離したコロニーは１％結晶性セルロースを含むＢＭＮ寒天培地によるシングルコロニーの分離操作を行い、本操作を３回繰り返した。最終的に、１％結晶性セルロースを含むＢＭ７寒天培地（ＢＭ７培地の組成は、参考文献：「特開２０１０−５１２９５号公報」参照。）において、７２〜８０時間で結晶性セルロース分解によるハローを形成出来るかどうかを確認した。
その結果、セルロース分解に伴うハローを形成可能な菌株を数株単離し、再度１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を明らかにした。得られたＤＮＡ配列データを用いて、（３）と同様にＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪのデータベースを用いてＢＬＡＳＴによる相同性解析を行い、Ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ． ｃｌｏｎｅ Ｄｅ３１７６に９６％の相同性を持つかどうか、又はＣｅｌｌｕｌｏｓｉｂａｃｔｅｒ ａｌｋａｌｉｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｔｒａｉｎ Ａ６に９９％の相同性を持つかどうかを確認した。
相同性解析の結果、ＩＳＩ−３から上記２つの微生物と考えられるＵｎｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ． ｃｌｏｎｅ Ｄｅ３１７６に９６％の相同性、及びＣｅｌｌｕｌｏｓｉｂａｃｔｅｒ ａｌｋａｌｉｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｔｒａｉｎ Ａ６に９９％の相同性を持つ高温性の嫌気性セルロース分解菌を新規に単離及び取得した。また、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の結果から、Ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ． ｃｌｏｎｅ Ｄｅ３１７６の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に９９％の相同性をもつ菌種、及びＣｅｌｌｕｌｏｓｉｂａｃｔｅｒ ａｌｋａｌｉｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ａ６の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に９９％の相同性を持つ菌種はそれぞれ、配列番号１及び配列番号２に示す塩基配列と一致していた。
Ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ． ｃｌｏｎｅ Ｄｅ３１７６に９６％の相同性を持つ単離した菌株をＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ． Ａ７株（以下、「Ａ７株」と称することがある。）と命名し、独立行政法人 特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）国際寄託に２０１６年３月８日付けで受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２２１６として寄託されている。
また、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を用いた系統樹解析を図３に示した。系統樹解析からＡ７株は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｌｋａｌｉｃｅｌｌｕｍ Ｚ−７０２６Ｔに近縁である新種である可能性が高いことが明らかとなった。
また、Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｂａｃｔｅｒ ａｌｋａｌｉｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｔｒａｉｎ Ａ６に９９％の相同性を持つ高温性の嫌気性セルロース分解菌はＣｅｌｌｕｌｏｓｉｂａｃｔｅｒ ｓｐ．Ｗ２１−１０株（以下、「Ｗ２１−１０株」と称することがある。）と命名し、独立行政法人 特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）国際寄託に２０１６年５月２４日付けで受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２２６５として寄託されている。
Ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ． ｃｌｏｎｅ Ｄｅ３１７６に９６％の相同性を持つ単離した菌株をＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ． Ａ７株（以下、「Ａ７株」と称することがある。）と命名し、独立行政法人 特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）国際寄託に２０１６年３月８日付けで受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２２１６として寄託されている。
また、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を用いた系統樹解析を図３に示した。系統樹解析からＡ７株は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｌｋａｌｉｃｅｌｌｕｍ Ｚ−７０２６Ｔに近縁である新種である可能性が高いことが明らかとなった。
また、Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｂａｃｔｅｒ ａｌｋａｌｉｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｔｒａｉｎ Ａ６に９９％の相同性を持つ高温性の嫌気性セルロース分解菌はＣｅｌｌｕｌｏｓｉｂａｃｔｅｒ ｓｐ．Ｗ２１−１０株（以下、「Ｗ２１−１０株」と称することがある。）と命名し、独立行政法人 特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）国際寄託に２０１６年５月２４日付けで受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２２６５として寄託されている。
なお、Ａ７株は、以下の形態学的特徴を有していた。
（Ａ７株の形態学的特徴）
・培養至適温度 ：５５℃
・細胞形態 ：桿菌（幅０．３〜０．４μｍ×長さ２．０〜６．０μｍ ）
・グラム染色 ：陽性
・芽胞形成 ：なし
・コロニー色調 ：オレンジ
（Ａ７株の形態学的特徴）
・培養至適温度 ：５５℃
・細胞形態 ：桿菌（幅０．３〜０．４μｍ×長さ２．０〜６．０μｍ ）
・グラム染色 ：陽性
・芽胞形成 ：なし
・コロニー色調 ：オレンジ
また、Ｗ２１−１０株は、以下の形態学的特徴を有していた。
（Ｗ２１−１０株の形態学的特徴）
・培養至適温度 ：６０℃
・細胞形態 ：桿菌（幅０．２〜０．３μｍ×長さ２．０〜３．０μｍ）
・グラム染色 ：陽性
・芽胞形成 ：なし
・コロニー色調 ：イエロー
（Ｗ２１−１０株の形態学的特徴）
・培養至適温度 ：６０℃
・細胞形態 ：桿菌（幅０．２〜０．３μｍ×長さ２．０〜３．０μｍ）
・グラム染色 ：陽性
・芽胞形成 ：なし
・コロニー色調 ：イエロー
（５）Ａ７株及びＷ２１−１０株の生育可能なｐＨの検討
さらに、生育可能なｐＨを調べるために、０．５％セロビオースを含むＢＭＮ液体培地を用いて、ｐＨ４．０からｐＨ１０．０まで、ｐＨ１．０おきに培地中のｐＨを塩酸で調整した後、６００ｎｍによる濁度の上昇を指標に生育測定を行なった。なお、ｐＨ８．０はＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を培地に添加しｐＨの調整を行ない、ｐＨ９．０〜１０．０は炭酸ナトリウム緩衝液を用いｐＨの調整を行なった。各ｐＨに調整された液体培地はオートクレーブ後、ｐＨメーターを用いて、指定のｐＨとなっているか確認をした後、菌を培養して試験を行なった。
さらに、生育可能なｐＨを調べるために、０．５％セロビオースを含むＢＭＮ液体培地を用いて、ｐＨ４．０からｐＨ１０．０まで、ｐＨ１．０おきに培地中のｐＨを塩酸で調整した後、６００ｎｍによる濁度の上昇を指標に生育測定を行なった。なお、ｐＨ８．０はＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を培地に添加しｐＨの調整を行ない、ｐＨ９．０〜１０．０は炭酸ナトリウム緩衝液を用いｐＨの調整を行なった。各ｐＨに調整された液体培地はオートクレーブ後、ｐＨメーターを用いて、指定のｐＨとなっているか確認をした後、菌を培養して試験を行なった。
その結果、Ａ７株ではｐＨ６．０からｐＨ１０．０の範囲で生育を確認でき、至適生育ｐＨは９．０であった。また、Ｗ２１−１０株では、少し生育範囲が狭くｐＨ８．０からｐＨ１０．０の範囲で生育を確認でき、至適生育ｐＨは９．５であった。
（６）Ａ７株及びＷ２１−１０株の炭素源の資化性試験
Ａ７株及びＷ２１−１０株の生理学的特徴を明らかにするために、炭素源の資化性試験を行った。糖の資化性は、セルロース、キシラン、澱粉、βグルカン、セロビオース、グルコース、フラクトース、アラビノース、マンノース、及びマルトースを各０．５％それぞれ含むＢＭ７液体培地を用いて測定を行なった。不溶性基質であるセルロースは、セルロースの消失により資化性の有無を判定し、キシランは生育に伴うガス発生により測定を行った。またその他の可溶性基質を使用した場合、上記と同様に６００ｎｍでの濁度の上昇を測定した。培養は４日間行い、その後生育の有無を測定した。
Ａ７株及びＷ２１−１０株の生理学的特徴を明らかにするために、炭素源の資化性試験を行った。糖の資化性は、セルロース、キシラン、澱粉、βグルカン、セロビオース、グルコース、フラクトース、アラビノース、マンノース、及びマルトースを各０．５％それぞれ含むＢＭ７液体培地を用いて測定を行なった。不溶性基質であるセルロースは、セルロースの消失により資化性の有無を判定し、キシランは生育に伴うガス発生により測定を行った。またその他の可溶性基質を使用した場合、上記と同様に６００ｎｍでの濁度の上昇を測定した。培養は４日間行い、その後生育の有無を測定した。
その結果、Ａ７株及びＷ２１−１０株において、炭素源としてセルロース、キシラン、セロビオースを用いた場合では、良好な生育を示した。また、炭素源としてグルコース、フラクトース、アラビノース、マンノース、マルトース、及びβグルカンを用いた場合では、ゆっくりではあるが生育が認められた。一方、炭素源として澱粉を用いた場合では、Ａ７株では資化が認められなかったが、Ｗ２１−１０株では資化が認められた。さらに、Ｗ２１−１０株は、ペクチン、ソルビトール、マンニトール、及びグリセロールといった異なる糖質資化性能も有していた。
［実施例２］
（１）各バイオマスにおける各種菌株の培養
既知菌株であるクロストリジウム・サーモセラムＡＴＣＣ２７４０５株、Ａ７株、Ｗ２１−１０株、又はそれらの組み合わせにおいて、バイオマスの分解が促進されるかどうかについて試験を行った。クロストリジウム・サーモセラムＡＴＣＣ２７４０５株のみの培養では、ＢＭＮ培地の代わりにＢＭ７培地（ＢＭ７培地の組成は、参考文献：「特開２０１０−５１２９５号公報」参照。）を用いて、６０℃にて４日間培養を行った。また、代表的なバイオマスとして、キャッサバパルプ、バガス、及びコーン茎葉を一例として用いた。それぞれのバイオマスに対して分解効率を示すために、実施例１の（２）と同様の方法を用いて、培養終了後、良く残渣を撹拌した後、遠心分離により上清を取り除き、洗浄及び乾燥を行い、乾燥重量を求め、バイオマス分解率を算出した。結果を図６に示す。図６において、Ｃｔとはクロストリジウム・サーモセラムＡＴＣＣ２７４０５株を示し、Ａ７とはＡ７株を示し、Ｗ２１とはＷ２１−１０株を示す。
（１）各バイオマスにおける各種菌株の培養
既知菌株であるクロストリジウム・サーモセラムＡＴＣＣ２７４０５株、Ａ７株、Ｗ２１−１０株、又はそれらの組み合わせにおいて、バイオマスの分解が促進されるかどうかについて試験を行った。クロストリジウム・サーモセラムＡＴＣＣ２７４０５株のみの培養では、ＢＭＮ培地の代わりにＢＭ７培地（ＢＭ７培地の組成は、参考文献：「特開２０１０−５１２９５号公報」参照。）を用いて、６０℃にて４日間培養を行った。また、代表的なバイオマスとして、キャッサバパルプ、バガス、及びコーン茎葉を一例として用いた。それぞれのバイオマスに対して分解効率を示すために、実施例１の（２）と同様の方法を用いて、培養終了後、良く残渣を撹拌した後、遠心分離により上清を取り除き、洗浄及び乾燥を行い、乾燥重量を求め、バイオマス分解率を算出した。結果を図６に示す。図６において、Ｃｔとはクロストリジウム・サーモセラムＡＴＣＣ２７４０５株を示し、Ａ７とはＡ７株を示し、Ｗ２１とはＷ２１−１０株を示す。
図６から、クロストリジウム・サーモセラムＡＴＣＣ２７４０５株を接種した場合において、残渣重量から見たバイオマスの分解効率はキャッサバパルプ、バガス、コーン茎葉で４０％、３５％、３９％となっていた。特に、キャッサバパルプにおいて分解効率が低い値となっており、これはキャッサバパルプの澱粉が大部分分解されずに残ってしまった結果であると考えられる。
また、Ａ７株を接種した場合においても、特に、キャッサバパルプにおいて分解効率が低い値となっていた。これは、Ａ７株においても、澱粉資化性が弱いため、単独では大部分の澱粉が残存してしまうために、バイオマス残渣が多く残存したせいであると考えられる。
一方、Ｗ２１−１０株では、澱粉やセルロース資化性能両方有していることから、キャッサバパルプ、及びその他のセルロース系バイオマスにおいても、単独でも良好な分解効率を示した。
また、クロストリジウム・サーモセラムＡＴＣＣ２７４０５株単独と比較して、Ａ７株、及び／又はＷ２１−１０株を共存させることで、分解効率は飛躍的に上昇することが明らかとなった。特に、キャッサバパルプを用いた試験において、Ａ７株及びＷ２１−１０株を共存させることより、約７０％が分解し、可溶化できることが明らかとなった。
以上により、セルロース分解においては、Ａ７株、Ｗ２１−１０株が中心となり、リグノセルロース系バイオマスを協調的、共同的に効率良く分解し、さらに、クロストリジウム・サーモセラムの共同作業により、結晶部分の高い結晶セルロース部分を完全に分解するものと考えられる。
また、Ａ７株を接種した場合においても、特に、キャッサバパルプにおいて分解効率が低い値となっていた。これは、Ａ７株においても、澱粉資化性が弱いため、単独では大部分の澱粉が残存してしまうために、バイオマス残渣が多く残存したせいであると考えられる。
一方、Ｗ２１−１０株では、澱粉やセルロース資化性能両方有していることから、キャッサバパルプ、及びその他のセルロース系バイオマスにおいても、単独でも良好な分解効率を示した。
また、クロストリジウム・サーモセラムＡＴＣＣ２７４０５株単独と比較して、Ａ７株、及び／又はＷ２１−１０株を共存させることで、分解効率は飛躍的に上昇することが明らかとなった。特に、キャッサバパルプを用いた試験において、Ａ７株及びＷ２１−１０株を共存させることより、約７０％が分解し、可溶化できることが明らかとなった。
以上により、セルロース分解においては、Ａ７株、Ｗ２１−１０株が中心となり、リグノセルロース系バイオマスを協調的、共同的に効率良く分解し、さらに、クロストリジウム・サーモセラムの共同作業により、結晶部分の高い結晶セルロース部分を完全に分解するものと考えられる。
一方、ＩＳＩ−３によるバイオマスの分解と比較して単独菌でのバイオマスの分解では、分解率が低下している傾向が見られるが、セルロース分解に関与しない菌種、すなわちＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌、Ｔｅｐｉｄａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌、Ｔｅｐｉｄｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ属細菌、及びＭｏｏｒｅｌｌａ属細菌により、生成してくるオリゴ糖や有機酸等が消費され、セルロース分解菌の生産するセルラーゼ等の酵素群におけるセルロース分解作用が促進されると考えられる。
よって、これらの非セルロース分解菌の役割、及び協調作用も、リグノセルロース系バイオマスの分解において、非常に重要であることが明らかとなった。
よって、これらの非セルロース分解菌の役割、及び協調作用も、リグノセルロース系バイオマスの分解において、非常に重要であることが明らかとなった。
本実施形態の微生物は、リグノセルロース分解能の優れた新規微生物である。また、前記微生物を含むリグノセルロース系バイオマス分解用組成物によれば、リグノセルロースを高効率で分解し、糖化液又はリグノセルロース系バイオマス由来化合物を高収率で得ることができる。
Claims (6)
- クロストリジウム・スピーシーズ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．）Ａ７株（ＮＩＴＥ ＢＰ−０２２１６）。
- セルロシバクター・アルカリサーモフィラス（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｂａｃｔｅｒ ａｌｋａｌｉｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｗ２１−１０株（ＮＩＴＥ ＢＰ−０２２６５）。
- クロストリジウム・スピーシーズ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．）Ａ７株（ＮＩＴＥ ＢＰ−０２２１６）、及びセルロシバクター・アルカリサーモフィラス（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｂａｃｔｅｒ ａｌｋａｌｉｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｗ２１−１０株（ＮＩＴＥ ＢＰ−０２２６５）からなる群より選択される少なくとも１種の微生物、又は前記微生物由来の酵素若しくは遺伝子産物を含むリグノセルロース系バイオマス分解用組成物。
- さらに、以下の（ｄ）〜（ｆ）のいずれかの核酸を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有し、且つリグノセルロース系バイオマスの分解能、又はリグノセルロース系バイオマスの分解産物の代謝能を有する微生物のうち少なくとも１種を含む請求項３に記載のリグノセルロース系バイオマス分解用組成物。
（ｄ）配列番号３〜１１のいずれかに示す塩基配列からなる核酸、
（ｅ）配列番号３〜１１のいずれかに示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する核酸、
（ｆ）配列番号３〜１１のいずれかに示す塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠損、置換若しくは付加された塩基配列からなる核酸 - 請求項３又は４に記載のリグノセルロース系バイオマス分解用組成物を用いて、リグノセルロース系バイオマスから糖化液を生成させる糖化工程を備える糖化液の製造方法。
- 請求項５に記載の製造方法を用いて、糖化液を製造した後、前記糖化液からリグノセルロース系バイオマス由来化合物を生産させる生産工程を備えるリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造方法。
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