CN101560488A - 分解木质纤维素的酶与菌剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种分解木质纤维素的菌剂及其应用。该菌剂的活性成份由粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)、解木聚糖拟杆菌(Bacteroides xylanisolvens)、解木聚糖梭菌(Clostridium xylanolyticum)、缓徐瘤梭菌(Clostridium lentocellum)、水生黄杆菌(Flavobacterium aquatile)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)组成。实验证明,本发明的菌剂对木质纤维素的降解率高,可达60-70%。本发明菌剂成本低廉,制备简单。本发明菌剂突破由纯化菌及其分解酶无法高效分解天然纤维素的局限,为分解、糖化含纤维素生物质转化为能源提供关键技术,在木质纤维素降解领域将有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及分解木质纤维素的酶与菌剂。
背景技术
木质纤维素由木质素、半纤维素和纤维素组成,是潜在的可再生资源,可以被降解产生二糖或单糖。单糖本身就是一种能源物质,其还可以被加工成醇等其它能源物质。木质纤维素占植物界碳含量的50%以上,其来源广泛,如棉花、木材、麻、麦秆、稻草、甘蔗渣等都是纤维素的丰富来源。在当今能源紧迫的形势下,降解木质素既能产生能源物质,又能变废为宝,是个一举双得的事情。
近年来,木质纤维素降解已成为研究的热点。降解木质纤维素的方法有水解、氧化、生物分解等。对于木质纤维素的生物分解,以往的研究多集中在纯化菌或酶的分离。但在人工培养条件下,依靠纯培养微生物、酶等难以直接分解天然木质纤维素。目前生产中木质纤维素的降解效率还不高,远没有达到生产需求,因此需要寻找一种高效降解木质纤维素的物质与方法。
发明内容
本发明的一个目的是提供分解木质纤维素的复合菌系。
本发明所提供的复合菌系为粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)、解木聚糖拟杆菌(Bacteroides xylanisolvens)、解木聚糖梭菌(Clostridiumxylanolyticum)、缓徐瘤梭菌(Clostridium lentocellum)、水生黄杆菌(Flavobacterium aquatile)和施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)。
其中,所述粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)具体可为保藏编号为DSM 16503的菌株;
所述解木聚糖拟杆菌(Bacteroides xylanisolvens)具体可为保藏编号为DSM18836的菌株;
所述解木聚糖梭菌(Clostridium xylanolyticum)具体可为保藏编号为DSM6555T的菌株;
所述缓徐瘤梭菌(Clostridium lentocellum)具体可为保藏编号为ATCC 49066的菌株;
所述水生黄杆菌(Flavobacterium aquatile)具体可为保藏编号为ATCC 11947的菌株;
所述施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)具体可为保藏编号为ATTC 17641的菌株。
本发明的另一个目的是提供分解木质纤维素的酶。
本发明的所提供的分解木质纤维素的酶是由上述任一所述的复合菌系分泌产生的。
本发明的另一个目的是提供分解木质纤维素的菌剂。
本发明所提供的分解木质纤维素的菌剂,其活性成份由上述任一所述的复合菌系组成。
所述粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)、解木聚糖拟杆菌(Bacteroidesxylanisolvens)、解木聚糖梭菌(Clostridium xylanolyticum)、缓徐瘤梭菌(Clostridium lentocellum)、水生黄杆菌(Flavobacterium aquatile)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)的集落形成单位数目比为(20-30)∶(10-20)∶(10-20)∶(10-20)∶(20-30)∶(10-20)。
所述粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)、解木聚糖拟杆菌(Bacteroidesxylanisolvens)、解木聚糖梭菌(Clostridium xylanolyticum)、缓徐瘤梭菌(Clostridium lentocellum)、水生黄杆菌(Flavobacterium aquatile)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)的集落形成单位数目比具体可为25∶15∶10∶15∶20∶15。
所述菌剂中的载体可包括甘油和EDTA;所述活性成份、甘油和EDTA的配比为1CFU∶(1×10-11-5×10-11)g甘油∶(1×10-11-2×10-11)g EDTA),优选为1CFU∶5×10-11g甘油∶1×10-11g EDTA。
所述菌剂中的载体还可为吸附载体;所述活性成份与所述吸附载体的配比为1CFU∶(1×10-6-1×10-5)g吸附载体,优选为1CFU∶5×10-6g吸附载体;所述吸附载体为麦饭石和/或秸秆粉。
上述任一所述复合菌系或酶或上述任一所述菌剂在分解木质纤维素中的应用也属于本发明的保护范围。
实验证明,本发明的菌剂对木质纤维素的降解率高,可达60-70%。本发明菌剂成本低廉,制备简单。本发明菌剂突破由纯化菌及其分解酶无法高效分解天然纤维素的局限,为分解、糖化含纤维素生物质转化为能源提供关键技术,在木质纤维素降解领域将有广阔的应用前景。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1、分解木质纤维素的复合菌系的组成
分解木质纤维素的复合菌系的菌组成:
粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)(购自德国微生物菌种保藏中心,菌种保藏编号为DSM 16503);
解木聚糖拟杆菌(Bacteroides xylanisolvens)(购自德国微生物菌种保藏中心,菌种保藏编号为DSM 18836);
解木聚糖梭菌(Clostridium xylanolyticum)(购自德国微生物菌种保藏中心,菌种保藏编号为DSM 6555T);
缓徐瘤梭菌(Clostridium lentocellum)(购自美国菌种保藏中心,菌种保藏编号为ATCC 49066);
水生黄杆菌(Flavobacterium aquatile)(购自美国菌种保藏中心,菌种保藏编号为ATCC 11947);
施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)(购自美国菌种保藏中心,菌种保藏编号为ATTC 17641)。
实施例2、菌剂的制备
用实施例1中所述的复合菌系制备菌剂。
一、菌剂I的制备
(一)复合菌系培养物的制备:
将粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)DSM 16503接种于蛋白胨纤维素培养液(PCS)改良培养基中,在室温(30℃)和黑暗条件下静止培养1d,收集所有的发酵液作为培养物A;
将解木聚糖拟杆菌(Bacteroides xylanisolvens)DSM 18836接种于蛋白胨纤维素培养液(PCS)改良培养基中,在室温(30℃)和黑暗条件下静止培养1d,收集所有的发酵液作为培养物C;
将解木聚糖梭菌(Clostridium xylanolyticum)DSM 6555T接种于蛋白胨纤维素培养液(PCS)改良培养基中,在室温(30℃)和黑暗条件下静止培养1d,收集所有的发酵液作为培养物D;
将缓徐瘤梭菌(Clostridium lentocellum)ATCC 49066接种于蛋白胨纤维素培养液(PCS)改良培养基中,在室温(30℃)和黑暗条件下静止培养1d,收集所有的发酵液作为培养物E;
将水生黄杆菌(Flavobacterium aquatile)ATCC 11947接种于蛋白胨纤维素培养液(PCS)改良培养基中,在室温(30℃)和黑暗条件下静止培养1d,收集所有的发酵液作为培养物F;
将施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)ATTC 17641接种于蛋白胨纤维素培养液(PCS)改良培养基中,在室温(30℃)和黑暗条件下静止培养1d,收集所有的发酵液作为培养物F;
培养中所用的蛋白胨纤维素培养液(PCS)改良培养基的组成为:蛋白胨5g,酵母提取物1g,NaCl 5g,K2HPO41g,MgSO47H2O 0.35g,CaCO33g,溶解在1L水中。
将如上6种培养物A、B、C、D、E和F混合均匀,得到复合菌系培养物,使6种菌的集落形成单位数目cfu比例为粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)∶解木聚糖拟杆菌(Bacteroides xylanisolvens)∶解木聚糖梭菌(Clostridiumxylanolyticum)∶缓徐瘤梭菌(Clostridium lentocellum)∶水生黄杆菌(Flavobacterium aquatile)∶施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)=25∶15∶10∶15∶20∶15。
(二)液体型制剂的菌剂
向上述复合菌系培养物中添加甘油和EDTA,即得到液体型菌剂;其中,所述复合菌系、甘油和EDTA的配比为1CFU∶5×10-11g甘油∶1×10-11g EDTA。
(三)固体型制剂的菌剂
向上述复合菌系培养物中添加吸附载体,即得到固体型菌剂;吸附载体为麦饭石和秸秆粉;所述菌剂与所述吸附载体的配比为1CFU∶5×10-6g吸附载体。
二、菌剂II的制备
(一)复合菌系培养物的制备:同实验一中所述一致,不同的是使得到的复合菌系培养物中6种菌的集落形成单位数目cfu比例为粪产碱杆菌(Alcaligenesfaecalis)、解木聚糖拟杆菌(Bacteroides xylanisolvens)、解木聚糖梭菌(Clostridium xylanolyticum)、缓徐瘤梭菌(Clostridium lentocellum)、水生黄杆菌(Flavobacterium aquatile)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)的集落形成单位数目(CFU)比为20∶10∶10∶10∶20∶10。
(二)液体型制剂的菌剂
向上述复合菌系培养物中添加甘油和EDTA,即得到液体型菌剂;其中,所述复合菌系、甘油和EDTA的配比为1CFU∶1×10-11g甘油∶1×10-11g EDTA。
(三)固体型制剂的菌剂
向上述复合菌系培养物中添加吸附载体,即得到固体型菌剂;吸附载体为麦饭石和秸秆粉;所述菌剂与所述吸附载体的配比为1CFU∶1×10-6g吸附载体。
三、菌剂III的制备
(一)复合菌系培养物的制备:同实验一中所述一致,不同的是使得到的复合菌系培养物中6种菌的集落形成单位数目cfu比例为粪产碱杆菌(Alcaligenesfaecalis)、解木聚糖拟杆菌(Bacteroides xylanisolvens)、解木聚糖梭菌(Clostridium xylanolyticum)、缓徐瘤梭菌(Clostridium lentocellum)、水生黄杆菌(Flavobacterium aquatile)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)的集落形成单位数目(CFU)比为30∶20∶20∶20∶30∶20。
(二)液体型制剂的菌剂
向上述复合菌系培养物中添加甘油和EDTA,即得到液体型菌剂;其中,所述复合菌系、甘油和EDTA的配比为1CFU∶5×10-11g甘油∶2×10-11g EDTA。
(三)固体型制剂的菌剂
向上述复合菌系培养物中添加吸附载体,即得到固体型菌剂;吸附载体为麦饭石和秸秆粉;所述菌剂与所述吸附载体的配比为1CFU∶1×10-5g吸附载体。
上述菌剂制备实验均设3次重复,得到相同的菌剂。
四、菌剂的应用
将上述菌剂I(固体型和液体型)、菌剂II(固体型和液体型)、菌剂III(固体型和液体型)分别进行木质纤维素降解实验。
固体型和液体型菌剂降解试验均以水稻秸秆为原料,在室温(30℃)黑暗静止条件下发酵6-15天。菌剂、水稻秸秆和培养基以如下比例混合后进行发酵试验。
发酵所用培养基为改良的PCS培养基,其组成为:蛋白胨5g,酵母提取物1g,NaCl 5g,K2HPO41g,MgSO47H2O 0.35g,CaCO33g,溶解在1L水中。
菌剂量∶水稻秸秆∶培养基的比例配置如下:
固体型菌剂(g)∶水稻秸秆(g)∶培养基(L)=1∶100∶1
液体型菌剂(L)∶水稻秸秆(g)∶培养基(L)=0.1∶100∶0.9
秸秆中纤维素和半纤维素的含量测定步骤:
(1).将分解前后的水稻秸秆样品分别称取1g(相同样品设置3个重复),装在醋酸纤维滤通中,安装在SOKURE玻璃萃取管内,用乙醇-乙醚(1∶1,体积比)混合液处理24小时,干燥后,得到残留固体,接着用水环流2小时,干燥后称得的重量为M1。
(2).将(1)得到的残留物用0.65mol/L HCl环流2小时,干燥后,称得的重量为M2。
(3).将(2)得到的残留物用15M H2SO4浸泡2小时后,用0.42M H2SO4环流5小时,干燥后称得的重量为M3。
计算公式:
半纤维素的重量=M1-M2;
纤维素的重量=M2-M3;
半纤维素分解率=(分解前半纤维素重量-分解后半纤维素重量)/(分解前秸秆重量-分解后秸秆重量);
纤维素分解率=(分解前纤维素重量-分解后纤维素重量)/(分解前秸秆重量-分解后秸秆重量)。
实验设3次重复,结果取平均数。相同菌量的固体型菌剂和液体型菌剂的降解效果没有明显差别。
菌剂I的结果:在分解木质纤维素时,首先分解半纤维素,平均6天半纤维素分解率为85%;6天后开始分解纤维素,分解15天后纤维素分解率达50%;分解15天后,木质纤维素总分解率可达70%;该菌对木质纤维素中的木质素没有明显分解能力。
菌剂II的结果:在分解木质纤维素时,首先分解半纤维素,平均6天半纤维素分解率为70%;6天后开始分解纤维素,分解15天后纤维素分解率达30%;分解15天后,木质纤维素总分解率可达60%;该菌对木质纤维素中的木质素没有明显分解能力。
菌剂III的结果:在分解木质纤维素时,首先分解半纤维素,平均6天半纤维素分解率为80%;6天后开始分解纤维素,分解15天后纤维素分解率达40%;分解15天后,木质纤维素总分解率可达65%;该菌对木质纤维素中的木质素没有明显分解能力。
Claims (9)
1、分解木质纤维素的复合菌系,为粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)、解木聚糖拟杆菌(Bacteroides xylanisolvens)、解木聚糖梭菌(Clostridiumxylanolyticum)、缓徐瘤梭菌(Clostridium lentocellum)、水生黄杆菌(Flavobacterium aquatile)和施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)。
2、根据权利要求1所述的复合菌系,其特征在于:
所述粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)为保藏编号为DSM 16503的菌株;
所述解木聚糖拟杆菌(Bacteroides xylanisolvens)为保藏编号为DSM 18836的菌株;
所述解木聚糖梭菌(Clostridium xylanolyticum)为保藏编号为DSM 6555T的菌株;
所述缓徐瘤梭菌(Clostridium lentocellum)为保藏编号为ATCC 49066的菌株;
所述水生黄杆菌(Flavobacterium aquatile)为保藏编号为ATCC 11947的菌株;
所述施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)为保藏编号为ATTC 17641的菌株。
3、分解木质纤维素的酶,由权利要求1或2中所述的复合菌系分泌产生的。
4、分解木质纤维素的菌剂,其活性成份由权利要求1或2中所述的复合菌系组成。
5、根据权利要求4所述的菌剂,其特征在于:所述粪产碱杆菌(Alcaligenesfaecalis)、解木聚糖拟杆菌(Bacteroides xylanisolvens)、解木聚糖梭菌(Clostridium xylanolyticum)、缓徐瘤梭菌(Clostridium lentocellum)、水生黄杆菌(Flavobacterium aquatile)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)的集落形成单位数目比为(20-30)∶(10-20)∶(10-20)∶(10-20)∶(20-30)∶(10-20)。
6、根据权利要求4或5所述的菌剂,其特征在于:所述粪产碱杆菌(Alcaligenesfaecalis)、解木聚糖拟杆菌(Bacteroides xylanisolvens)、解木聚糖梭菌(Clostridium xylanolyticum)、缓徐瘤梭菌(Clostridium lentocellum)、水生黄杆菌(Flavobacterium aquatile)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)的集落形成单位数目比为25∶15∶10∶15∶20∶15。
7、根据权利要求4-6中任一所述的菌剂,其特征在于:所述菌剂中的载体包括甘油和EDTA;
所述活性成份、甘油和EDTA的配比为1CFU∶(1×10-11-5×10-11)g甘油∶(1×10-11-2×10-11)g EDTA,优选为1CFU∶5×10-11g甘油∶1×10-11g EDTA。
8、根据权利要求4-6中任一所述的菌剂,其特征在于:所述菌剂中的载体为吸附载体;所述活性成份与所述吸附载体的配比为1CFU∶(1×10-6-1×10-5)g吸附载体,优选为1CFU∶5×10-6g吸附载体;所述吸附载体为麦饭石和/或秸秆粉。
9、权利要求1所述复合菌系或权利要求3所述酶或权利要求4-8中任一所述菌剂在分解木质纤维素中的应用。
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