CN107446834A - 一种肠杆菌新菌株、获取方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种肠杆菌新菌株、获取方法及应用，所述新菌株从牛瘤胃内容物中分离、筛选得到，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏名称为，ZH‑4，保藏号是CGMCC NO.12427，保藏日期为2016年5月10日。所述菌株特性及性能：（1）特性：在羧甲基纤维素‑刚果红培养基上菌落形成的透明圈直径比为6~8；菌落椭圆形，表面湿润，不光滑，乳白色，质地均匀且不透明；菌株呈革兰氏阴性杆状。（2）性能：具有一定的纤维素降解能力；具有一定的外切葡聚糖苷酶活力，内切葡聚糖苷酶活力和β‑葡萄糖苷酶活力；对葡萄糖和木糖的利用效率相当。其优点是：能够降解木质纤维素，为有效利用木质纤维素废物提供了新的途径。

Description

一种肠杆菌新菌株、获取方法及应用
技术领域
本发明涉及一种肠杆菌新菌株、获取方法及应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
木质纤维素是地球上储量最丰富的可再生资源，年产量1×1013吨，木质纤维素类生物质主要由纤维素、半纤维素和木质素三种高聚物组成，是取之不竭，用之不尽的碳水化合物。但由于纤维素难降解的特性，导致其利用率很低，由此产生木质纤维素资源不能被有效利用的难题。全球每年产生的木质纤维素废物约数千亿吨，尤其在内蒙古地区，玉米秸秆和沙柳枝条的大量堆积和焚烧，不仅造成了资源浪费，而且污染了环境。因此，如何有效利用这些木质纤维素废物的研究具有深远的意义。
木质纤维素的主要成分是纤维素，也是植物细胞壁的主要成分，而细胞壁又分为初生壁和次生壁，纤维素占初生壁干重的10%～14%，占次生壁干重的40%～ 60%。纤维素是以D-Glucose组成，通过β-1，4糖苷键连接而成的链状高分子化合物，其基本单元是纤维二糖，在纤维素结构式中为由氢键以及氧原子拼接成的高分子聚合物，因此该结构具有很强的刚性及韧性。纤维素分子主要包含碳、氢、氧，三种元素组成，化学通式（C6H10O5）n(n代表聚合度)，纤维素结构复杂，对于一般稀酸，稀碱溶剂具有不溶性的特点。
半纤维素的主要来源是玉米、水稻秸秆和植被枝条等，是植物细胞壁的第二大有机高分子化合物，含量略低于纤维素，其主要特点是：半纤维素是由不同类型单糖构成的异质多聚体，包括阿拉伯糖、鼠李糖，木糖、半乳糖、甘露糖和葡萄糖等，这些单糖通过特殊的连接方式形成带支链的杂多糖，半纤维素与纤维素的作用主要通过范德华力和氢键等非共价键构成网状的植物细胞壁结构，半纤维素存在于细胞壁中纤维素的间隙中，它并非不易降解，但是只有当纤维素降解时半纤维素才能随之降解。
木质素是一种高分子芳香族化合物，其结构复杂几乎不能溶解于任何溶剂，主要是通过形成网状来硬化细胞壁，为次生壁主要成分。木质素大多以酚状形式存在，苯丙基单元由醚键和碳碳双键结合而成，聚合度大约在150-200。木质素通过一定的化学键与半纤维素相结合，木质素很难被降解，并且将纤维素和半纤维素层层包裹在里面形成保护层，起抗压作用并且阻止纤维素和半纤维素的水解。
目前对于生物质的处理方法主要分为3大类，即化学方法、物理方法和生物方法，微生物法破坏木质素，使纤维素和半纤维素裸露在外面，并分泌纤维素酶使其发生降解，该方法条件温和，能耗低，特异性强，且不涉及二次污染等问题，是环境友好型处理方法。因此，微生物法降解木质纤维素这一思路吸引了国内外学者的广泛关注。
发明内容
本发明的目的是为了解决木质纤维素难降解、利用率低的问题，提供一种实施例提供一种具有纤维素降解能力的肠杆菌新菌株、获取方法及应用。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种肠杆菌新菌株，其特征是：在羧甲基纤维素-刚果红培养基上菌落形成透明圈直径比（D/d）为6～8，呈圆形、表面湿润、光滑、乳白色且不透明、边缘不整齐，质地均匀且呈扁平状；细胞呈革兰氏阴性杆状；生理生化特性：该菌株在37～39℃范围内，pH为7.0时生长状态良好，能发酵甘油、半乳糖、硝酸盐、甘露醇、卫矛醇、蛋白冻水、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、葡萄糖、七叶灵、阿拉伯糖、果糖、乳糖、蜜二糖、鼠李糖、木糖、麦芽糖、山梨醇和水杨酸，不能发酵纤维二糖、棉籽糖、蔗糖、硫化氢、明胶、淀粉、尿素、西蒙氏柠檬酸盐、苯丙氨酸，具有运动性，兼性厌氧。
所述肠杆菌新菌株命名为ZH-4，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所。保藏名称为ZH-4，分类命名为Enterobacter sp.保藏号是CGMCC NO.12427，保藏日期为2016年5月10日。
上述新菌株的获取方法，包括以下步骤：
（1）取样：直接从刚被屠宰牛的瘤胃中取出未完全消化的食糜，快速放入灭菌的保温瓶中，装满，带回实验室并用匀浆机匀浆10 s，将附着在食糜上的菌株震动下来，再用纱布进行过滤，将滤液注入灭菌且去除O2的西林瓶中，制成菌种 ；
（2）富集：配制1000 mL培养基A：NaHCO3 10.0 g、蛋白胨 2 g、酵母提取粉 2.0 g、KH2PO4 3.0 g、NH4)2SO4 3.0 g、NaCl 6.0 g、CaCl2•2H2O 0.4 g、MgSO4•7H2O 0.58 g、无细胞瘤胃液 170mL、余量为蒸馏水；每30 mL培养基A分装到一个100 mL西林瓶中，封口压盖，抽真空后，121 ℃高压灭菌30 min；洁净工作台紫外杀菌30 min后，步骤1的菌种按照接种量15%接种于西林瓶中，置于37 ℃，180 r/min摇床中培养，培养期间观测纤维素和滤纸的降解程度，连续传代接种3次，淘汰不能利用纤维素和滤纸的菌株后，制成富集菌液；
（3）初筛：配制1000 mL培养基B：NaHCO3 10.0 g、蛋白胨 2 g、酵母提取粉 2.0 g、KH2PO4 3.0 g、(NH4)2SO4 3.0 g、NaCl 6.0 g、CaCl2•2H2O 0.4 g、MgSO4•7H2O 0.58 g、琼脂20.0 g、刚果红0.4 g、羧甲基纤维素钠5.0 g、无细胞瘤胃液 170mL、余量为蒸馏水；每5 ml培养基B分装到Hungate滚管中，封口压盖，抽真空后，121℃高压灭菌30 min；洁净工作台紫外杀菌30 min后，准备烧杯装入50℃以上的热水并将滚管中培养基完全浸没在热水中；将步骤2的富集菌液按照10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7和10-8体积比浓度用灭菌蒸馏水梯度稀释，将稀释后的富集菌液接种以5%的接种量接种于Hungate滚管中，每个浓度梯度3个平行样，迅速滚管，确保培养基充分、平滑、均匀的铺在管滚内壁，置于37 ℃摇床中，180r/min 培养，并观察菌落生长情况，记录菌落生长时间并确定最适浓度梯度；
（4）复筛：挑取菌落密度分布均匀的滚管用作菌种分离纯化，记录菌落的特征，包括具有透明圈的菌落并计算透明圈直径与菌落直径的数值，该数值的大小可以反应其纤维素降解能力的大小，将挑取的单菌落接种到培养基A中培养，每组3个平行样，将不接种菌种的对照组和实验组同时放到37 ℃，180 r/min的培养箱中进行培养，观测纤维素的减少量及滤纸条崩溃程度，选出纤维素减少量快或滤纸条崩溃程度高的菌落即为新菌株。
上述新菌株的应用包括：（1）用于木质纤维素的降解；（2）用于葡萄糖、木糖、或葡萄糖和木糖混合物的分解；（3）用于内切葡聚糖苷酶、外切葡聚糖苷酶和β-葡萄糖苷酶的制造。
本发明的优点是：能够降解木质纤维素，为有效利用木质纤维素废物提供了新的途径。
具体实施方式
实施例1：本发明菌株的分离与鉴定
（1）取样
菌种取自内蒙古呼和浩特市西口子屠宰场肉食牛瘤胃，随机选取3头牛的瘤胃进行取样，直接从刚被屠宰牛的瘤胃中取出未完全消化的食糜，快速放入灭菌的保温瓶中，装满（去除氧气），带回实验室并用匀浆机匀浆10 s，将附着在食糜上的菌株震动下来，再用纱布进行过滤，将滤液注入灭菌且去除O2的西林瓶中，制成菌种，于-20℃储藏备用。
（2）富集
配制1000 mL培养基A：NaHCO3 10.0 g、蛋白胨 2 g、酵母提取粉 2.0 g、KH2PO4 3.0 g、(NH4)2SO4 3.0 g、NaCl 6.0 g、CaCl2•2H2O 0.4 g、MgSO4•7H2O 0.58 g、无细胞瘤胃液170mL、余量为蒸馏水； 每30 mL培养基A分装到一个100 mL西林瓶中，封口压盖，抽真空（0.06Mpa）后，121 ℃高压灭菌30 min。洁净工作台紫外杀菌30 min后，将保存的菌种按照接种量15%接种于西林瓶中， 置于37 ℃，180 r/min摇床中培养，培养期间观测纤维素和滤纸的降解程度。连续传代接种3次，淘汰不能利用纤维素和滤纸的菌株后，制成富集菌液。
（3）初筛
配制1000 mL培养基B： NaHCO3 10.0 g、蛋白胨 2 g、酵母提取粉 2.0 g、KH2PO4 3.0g、(NH4)2SO4 3.0 g、NaCl 6.0 g、CaCl2•2H2O 0.4 g、MgSO4•7H2O 0.58 g、琼脂20.0 g、刚果红0.4 g、羧甲基纤维素钠5.0 g、无细胞瘤胃液 170mL、余量为蒸馏水；每5 ml培养基B分装到Hungate滚管中，封口压盖，抽真空（0.06Mpa）后，121℃高压灭菌30 min。洁净工作台紫外杀菌30 min后，准备烧杯装入50℃以上的热水并将滚管中培养基完全浸没在热水中，以防止滚管中的琼脂凝固。
将富集菌液按照10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7和10-8体积比浓度梯度用灭菌蒸馏水稀释，将稀释后的富集菌液接种以5%的接种量接种于温度适宜的Hungate滚管中，每个浓度梯度3个平行样，迅速滚管，确保培养基充分、平滑、均匀的铺在管滚内壁，置于37 ℃摇床中，180 r/min 培养，并观察菌落生长情况，记录菌落生长时间并确定最适浓度梯度。
（4）复筛
挑取菌落密度分布均匀的滚管用作菌种分离纯化，记录菌落的特征，包括具有透明圈的菌落并计算透明圈直径与菌落直径的数值，该数值的大小可以反应其纤维素降解能力的大小。将挑取的单菌落接种到培养基A中培养，每组3个平行样，将不接种菌种对照组和实验组同时放到37 ℃，180 r/min的培养箱中进行培养，观测纤维素的减少量及滤纸条崩溃程度。
以上菌种筛选过程均需在厌氧条件下进行。
（5）菌种鉴定
新菌株ZH-4 16S rDNA基因的PCR扩增和序列分析
以ZH-4 DNA为模板，用16S rDNA 基因的通用引物进行PCR扩增，PCR产物进行电泳检测，将扩增片段回收、测序，并与GenBank中的序列进行比对，与大肠杆菌的同源性最高，为99%，菌株ZH-4的16S rDNA的长度为1444 bp，其序列详见序列表。
实施例2：新菌株ZH-4性能
（1）菌种纤维素降解特性
微晶纤维素降解率及玉米秸秆中纤维素、半纤维素降解率计算方法：利用高效液相色谱得到单糖的峰面积，并利用以下公式计算：
（1）C单糖=（S单糖×C标样）÷S标样
（2）m葡聚糖=m葡萄糖×（162/180）
m木聚糖=m木糖×（132/150）
（3）糖损失率=（m加硫酸后糖的质量/m加硫酸前糖的质量）×100%；
实验方法：按照5%和10%的接种比例将菌株ZH-4分别接种至以微晶纤维素（5 g/L）和玉米秸秆（15 g/L）为单一碳源的培养基A中，每组3个平行样，置于37 ℃，180 r/min培养箱中培养，培养时间为7天和14天，计算菌株纤维素降解率和玉米秸秆中纤维素、半纤维素降解率。
实验结果：当以微晶纤维素为底物时，ZH-4的纤维为素降解率为29.10%±0.47（P<0.01）；当以玉米秸秆为底物时，其纤维素降解率为14.30%±0.48（P<0.01），半纤维素降解率为11.39%±0.28（P<0.01）
（2）菌株ZH-4对葡萄糖及木糖利用效率
实验方法：将葡萄糖和木糖按照1:1的重量比例作为培养基A中的共同底物，接种ZH-4，接种量为5%，培养条件为37 ℃，180 r/min。利用高效液相色谱每隔一段时间检测ZH-4对葡萄糖和木糖的利用效率。
实验结果：菌株ZH-4在1.5 h时葡萄糖的利用率为18.7%，低于木糖的利用率35.57%，但在6 h时的葡萄糖利用率达到100%，且木糖的利用率也呈上升趋势在12 h时木糖的利用率达到70.07%；ZH-4在培养的初始阶段对木糖的利用效率较高，但在3 h之后葡萄糖的利用效率更高。
（3）菌株ZH-4酶活力测定
外切葡聚糖苷酶活力测定
取6支试管，每3支一组，一组作为实验组，另一组作空白对照，在空白组中依次加入底物溶液（0.5at%微晶纤维素溶液）2mL，DNS试剂1 mL，粗酶液1mL，沸水浴5 min，然后冰浴终止反应，加入16 mL蒸馏水，使试管内液体混合均匀，用紫外可见分光光度计于波长550 nm处测其吸光度。在实验组中依次加入菌液1 mL，底物溶液2 mL，然后将试管置于50 ℃水浴锅中反应1 h，反应结束后立即向试管中加入1 mL DNS溶液并沸水浴5 min，反应结束立刻冰浴终止反应，加16 mL蒸馏水混匀后测其在波长550 nm处的吸光度。
内切葡聚糖苷酶活力测定
方法同上，将底物溶液换成0.5 at %羧甲基纤维素钠溶液，且反应时间为30 min。
β-葡萄糖苷酶活力测定
方法同上，需将底物溶液换成0.5 at %水杨苷溶液，反应时间为10 min。
滤纸酶活力测定
方法同上，需将底物溶液换成0.5 at %滤纸溶液，反应时间1 h。
实验结果：菌株在厌氧条件下培养时，当缓冲液pH=7.8时，菌株具有一定量的外切葡聚糖苷酶活力为9.13μg/mL•min、内切葡聚糖苷酶活力5.31 μg/mL•min，β-葡萄糖苷酶活力为7.27 μg/mL•min和总酶活力为0.41 μg/mL•min，当缓冲液的pH偏酸性时，酶活力相对较低，且总酶活力为0；菌株在好氧条件下培养时，当缓冲液的pH=7.8时，菌株具有一定量的外切葡聚糖苷酶活力为5.35 μg/mL•min、内切葡聚糖苷酶活力0.32 μg/mL•min，β-葡萄糖苷酶活力为2.15 μg/mL•min，且总酶活力为0，当缓冲液偏酸性时，酶活力明显减小，当缓冲液的pH=5.8时，没有酶分泌。
通过以上实例表明，新菌株ZH-4具有一定的纤维素降解能力且具有内切葡聚糖苷酶、外切葡聚糖苷酶和β-葡萄糖苷酶活力，对葡萄糖和木糖的利用效率相当。
新菌株ZH-4 16S rDNA基因序列表：
KU058643
1444 bp
16S rDNA
1 ccaatgcgca gcctacacat gcagtcgaac ggtaacagaa agcagcttgc tgctttgctg
61 acgagtggcg gacgggtgag taatgtctgg gaaactgcct gatggagggg gataactact
121 ggaaacggta gctaataccg cataacgtcg caagaccaaa gagggggacc ttcgggcctc
181 ttgccatcgg atgtgcccag atgggattag cttgttggtg gggtaacggc tcaccaaggc
241 gacgatccct agctggtctg agaggatgac cagccacact ggaactgaga cacggtccag
301 actcctacgg gaggcagcag tggggaatat tgcacaatgg gcgcaagcct gatgcagcca
361 tgccgcgtgt atgaagaagg ccttcgggtt gtaaagtact ttcagcgggg aggaagggag
421 taaagttaat acctttgctc attgacgtta cccgcagaag aagcaccggc taactccgtg
481 ccagcagccg cggtaatacg gagggtgcaa gcgttaatcg gaattactgg gcgtaaagcg
541 cacgcaggcg gtttgttaag tcagatgtga aatccccggg ctcaacctgg gaactgcatc
601 tgatactggc aagcttgagt ctcgtagagg ggggtagaat tccaggtgta gcggtgaaat
661 gcgtagagat ctggaggaat accggtggcg aaggcggccc cctggacgaa gactgacgct
721 caggtgcgaa agcgtgggga gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac
781 gatgtcgact tggaggttgt gcccttgagg cgtggcttcc ggagctaacg cgttaagtcg
841 accgcctggg gagtacggcc gcaaggttaa aactcaaatg aattgacggg ggcccgcaca
901 agcggtggag catgtggttt aattcgatgc aacgcgaaga accttacctg gtcttgacat
961 ccacagaact ttccagagat ggattggtgc cttcgggaac tgtgagacag gtgctgcatg
1021 gctgtcgtca gctcgtgttg tgaaatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctta
1081 tcctttgttg ccagcggtcc ggccgggaac tcaaaggaga ctgccagtga taaactggag
1141 gaaggtgggg atgacgtcaa gtcatcatgg cccttacgac cagggctaca cacgtgctac
1201 aatggcgcat acaaagagaa gcgacctcgc gagagcaagc ggacctcata aagtgcgtcg
1261 tagtccggat tggagtctgc aactcgactc catgaagtcg gaatcgctag taatcgtgga
1321 tcagaatgcc acggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc acaccatggg
1381 agtgggttgc aaaagaagta ggtagcttaa ccttcgggag ggcgctacca cttgatcttt
1441 gccg。

Claims (4)

1.一种肠杆菌新菌株，其特征是：在羧甲基纤维素-刚果红培养基上菌落形成透明圈直径比（D/d）为6～8，呈圆形、表面湿润、光滑、乳白色且不透明、边缘不整齐，质地均匀且呈扁平状；细胞呈革兰氏阴性杆状；生理生化特性：该菌株在37～39℃范围内，pH为7.0时生长状态良好，能发酵甘油、半乳糖、硝酸盐、甘露醇、卫矛醇、蛋白冻水、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、葡萄糖、七叶灵、阿拉伯糖、果糖、乳糖、蜜二糖、鼠李糖、木糖、麦芽糖、山梨醇和水杨酸，不能发酵纤维二糖、棉籽糖、蔗糖、硫化氢、明胶、淀粉、尿素、西蒙氏柠檬酸盐、苯丙氨酸，具有运动性，兼性厌氧。
2.根据权利要求1所述的肠杆菌新菌株，其特征是：所述肠杆菌新菌株命名为ZH-4，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏名称为，ZH-4，保藏号是CGMCCNO.12427，保藏日期为2016年5月10日。
3.一种根据权利要求1、2所述的肠杆菌新菌株的获取方法，其特征是：包括以下步骤：
（1）取样：直接从刚被屠宰牛的瘤胃中取出未完全消化的食糜，快速放入灭菌的保温瓶中，装满，带回实验室并用匀浆机匀浆10 s，将附着在食糜上的菌株震动下来，再用纱布进行过滤，将滤液注入灭菌且去除O2的西林瓶中，制成菌种；
（2）富集：配制1000 mL培养基A：NaHCO3 10.0 g、蛋白胨 2 g、酵母提取粉 2.0 g、KH2PO4 3.0 g、NH4)2SO4 3.0 g、NaCl 6.0 g、CaCl2•2H2O 0.4 g、MgSO4•7H2O 0.58 g、无细胞瘤胃液 170mL、余量为蒸馏水；每30 mL培养基A分装到一个100 mL西林瓶中，封口压盖，抽真空后，121 ℃高压灭菌30 min；洁净工作台紫外杀菌30 min后，步骤1的菌种按照接种量15%接种于西林瓶中，置于37 ℃，180 r/min摇床中培养，培养期间观测纤维素和滤纸的降解程度，连续传代接种3次，淘汰不能利用纤维素和滤纸的菌株后，制成富集菌液；
（3）初筛：配制1000 mL培养基B：NaHCO3 10.0 g、蛋白胨 2 g、酵母提取粉 2.0 g、KH2PO4 3.0 g、(NH4)2SO4 3.0 g、NaCl 6.0 g、CaCl2•2H2O 0.4 g、MgSO4•7H2O 0.58 g、琼脂20.0 g、刚果红0.4 g、羧甲基纤维素钠5.0 g、无细胞瘤胃液 170mL、余量为蒸馏水；每5 ml培养基B分装到Hungate滚管中，封口压盖，抽真空后，121℃高压灭菌30 min；洁净工作台紫外杀菌30 min后，准备烧杯装入50℃以上的热水并将滚管中培养基完全浸没在热水中；将步骤2的富集菌液按照10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7和10-8体积比浓度用灭菌蒸馏水梯度稀释，将稀释后的富集菌液接种以5%的接种量接种于Hungate滚管中，每个浓度梯度3个平行样，迅速滚管，确保培养基充分、平滑、均匀的铺在管滚内壁，置于37 ℃摇床中，180r/min 培养，并观察菌落生长情况，记录菌落生长时间并确定最适浓度梯度；
（4）复筛：挑取菌落密度分布均匀的滚管用作菌种分离纯化，记录菌落的特征，包括具有透明圈的菌落并计算透明圈直径与菌落直径的数值，该数值的大小可以反应其纤维素降解能力的大小，将挑取的单菌落接种到培养基A中培养，每组3个平行样，将不接种菌种的对照组和实验组同时放到37 ℃，180 r/min的培养箱中进行培养，观测纤维素的减少量及滤纸条崩溃程度，选出纤维素减少量快或滤纸条崩溃程度高的菌落即为新菌株。
4.一种根据权利要求1、2所述的肠杆菌新菌株的应用，其特征是：用于木质纤维素的降解，用于葡萄糖、木糖、或葡萄糖和木糖混合物的分解，或用于内切葡聚糖苷酶、外切葡聚糖苷酶和β-葡萄糖苷酶的制造。
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