CN110982729A - 一种降解木材加工副产物杨树皮纤维素的复合菌剂 - Google Patents

一种降解木材加工副产物杨树皮纤维素的复合菌剂 Download PDF

Info

Publication number
CN110982729A
CN110982729A CN201911011222.2A CN201911011222A CN110982729A CN 110982729 A CN110982729 A CN 110982729A CN 201911011222 A CN201911011222 A CN 201911011222A CN 110982729 A CN110982729 A CN 110982729A
Authority
CN
China
Prior art keywords
microbial inoculum
cellulose
strain
carnobacterium
wood processing
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
CN201911011222.2A
Other languages
English (en)
Inventor
王奇志
徐曙
曹妍
王碧
管福琴
单宇
严奇
陈雨
刘飞
印敏
田梅
李林蔚
靳桐
周倩
冯煦
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Botany of CAS
Original Assignee
Institute of Botany of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Botany of CAS filed Critical Institute of Botany of CAS
Priority to CN201911011222.2A priority Critical patent/CN110982729A/zh
Publication of CN110982729A publication Critical patent/CN110982729A/zh
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及微生物领域，属于工业集约化生产技术，具体是一种降解木材加工副产物杨树皮纤维素的复合菌剂。所述菌剂的活性成分为下列质量百分比的原料，产纤维素酶的肠杆菌和乳酸乳球菌55％、产β‑葡萄糖苷酶的鞘氨醇杆菌、肉杆菌和琥珀葡萄球菌45％；产纤维素酶的肠杆菌(Enterobacteriaceae bacterium KOPRI 25617)和乳酸乳球菌(Lactococcus lactis subsp.lactis strain G50)；产β‑葡萄糖苷酶的鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium sp.strain MX21)、肉杆菌(Carnobacterium maltaromaticum strain TMW 2.158和琥珀葡萄球菌(Staphylococcus succinus strain 14BME20)。本发明所述的复合菌剂能够在10℃下产酶活性无明显差别，具有较高的稳定性，纤维素降解率为68.94％、半纤维素的降解率为53.61％，适用于我国各地的自然天气。

Description

一种降解木材加工副产物杨树皮纤维素的复合菌剂
一、技术领域：
本发明涉及微生物领域，属于工业集约化生产技术，具体是一种降解木材加工副产物杨树皮纤维素的复合菌剂。
二、技术背景：
杨树产业是江苏省农民增收的重要渠道，主要产区在苏北的泗阳县等地区，品种主要有Ⅰ-69杨和Ⅰ-72杨等。全省以杨树为主要加工原料的企业共有6000多家，全省人造板产量达3639万立方米，占全国的17.4％，位居全国第二；地板产量1.83亿平方米，占全国的29％，居全国第一。全省年可提供杨木635万立方米，企业每年收购消耗省内枝桠材达400多万吨。2011年杨树等林板纸一体化产值达1704亿元，占全省林业总产值2291亿元的74.4％，其中木材制品出口额达33亿美元。目前全省杨树产业直接带动全省农民就业1400万人，促进主产区农民人均年增收3000元，其中仅枝桠材就帮助农民增收10亿元以上。目前全省杨树林下经济面积近500万亩，产值182亿元。
木材加工副产物杨树皮是一种具有非常大的利用空间的资源，但大部分杨树皮资源并未合理的开发利用，绝大多数被弃置田间或被焚烧，造成资源的浪费和环境的严重污染。杨树皮中含有对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、对香豆酸、阿魏酸、绿原酸、水杨酸、对羟基肉桂酸及咖啡酸等酚酸类化合物。绿原酸具有显著的抗菌、利胆、止血、升白和抗脂质过氧化的药理作用并且能增加胃肠蠕动、促进胃液和胆汁分泌，临床上用于治疗各种感染疾病及放射治疗、化学治疗所致的白细胞减少症。咖啡酸是绿原酸的水解产物，也具有升白、止血、利胆、镇咳、祛痰作用。阿魏酸和香草酸对维生素C、Fe2+/半胱氨酸诱导的肝微粒体脂质过氧化都有较好的抑制活性。此外，杨树皮中还有洋芹素、槲皮素、山柰酚等，黄酮类化合物具有多种多样的药理作用，主要对心血管疾病和气管炎有疗效；有抗炎、祛痰解热、抑制血小板聚集和提高机体免疫功能的作用，并具有一定的抗肿瘤和保肝作用，在防治高血压及动脉硬化方面是很好的辅助治疗剂；临床上用以治疗急、慢性肝炎、肝硬化及多种中毒性肝损伤、肝脓肿。
纤维素作为植物光合作用的主要多糖类产物，是地球上最为丰富的可再生资源。从可持续发展的角度出发，纤维素被彻底降解而不会对环境造成污染的一条有效途径便是利用纤维素酶的水解作用，它可使大量纤维素资源和城市纤维素废料转变成人类所需的物质，具有积极的深远意义。到目前为止，纤维素酶已广泛应用于工、农、畜、医等领域中，并取得了初步成效。我国对纤维素酶的研究虽然已有几十年的历史，但由于纤维素酶的酶系组成相当复杂，活性不高，生产成本过高而导致其应用仍受到限制，选育高活性的纤维素酶是我国酶制剂研究的一项重要任务，因此，产纤维素降解酶系的微生物逐渐进入我们的视线。目前关于纤维素酶生产菌株的研究，绝大部分集中于纤维素酶系齐全且酶活力较高的木霉上，如绿色木霉和里氏木霉等菌株，但木霉菌发酵产物中存在多种真菌毒素，有毒性嫌疑；另一方面β-葡萄糖苷酶活力很低，致使纤维二糖在反应体系中积累，最终影响酶解效率，因而其应用范围受到限制。本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种能高效降解木材加工副产物杨树皮经脱脂及提取活性酚酸类成分后的废渣(主要是纤维素)的复合菌剂。
三、发明内容
本发明目的是提供一种能高效降解木材加工副产物杨树皮经脱脂及提取活性酚酸类成分后的废渣(主要是纤维素)的复合菌剂，该方法可用于工业化生产。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种降解木材加工副产物杨树皮纤维素的复合菌剂，所述菌剂的活性成分为下列质量百分比的原料，产纤维素酶的肠杆菌和乳酸乳球菌55％、产β-葡萄糖苷酶的的鞘氨醇杆菌、肉杆菌和琥珀葡萄球菌45％。
上述一种降解木材加工副产物杨树皮纤维素的复合菌剂，所述产纤维素酶的肠杆菌(Enterobacteriaceae bacterium KOPRI 25617)和乳酸乳球菌(Lactococcus lactissubsp.Lactis strain G50)；所述产β-葡萄糖苷酶的鞘氨醇杆菌(Sphingobacteriumsp.strain MX21)、肉杆菌(Carnobacterium maltaromaticum strain TMW 2.1581)和琥珀葡萄球菌(Staphylococcus succinus strain 14BME20)。
上述一种降解木材加工副产物杨树皮纤维素的复合菌剂的制备方法，按如下步骤：
(1)将上述产纤维素酶的肠杆菌和乳酸乳球菌按照常规方式活化、培养至菌液中活菌数达到2.0×108个/克，活化的培养基为PDA培养基(马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL)；
(2)产β-葡萄糖苷酶的鞘氨醇杆菌、肉杆菌和琥珀葡萄球菌菌株活化的培养基：初始pH值4.98，葡萄糖添加量14.94g/L，蛋白胨添加量14.82g/L，Mn2+添加量1g/L，木材加工副产物杨树皮经脱脂及提取活性酚酸类成分后的纤维素粉的添加量为40g/L；
(3)将上述两种菌液按照以下质量比混合：产纤维素酶肠杆菌和乳酸乳球菌55％、产β-葡萄糖苷酶的鞘氨醇杆菌、肉杆菌和琥珀葡萄球菌45％，进行充分混合后获得复合菌剂。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明的产β-葡萄糖苷酶的鞘氨醇杆菌、肉杆菌和琥珀葡萄球菌，能够水解纤维二糖，从而提高纤维素酶的活性，与产纤维素酶的肠杆菌和乳酸乳球菌协同增效，本发明所述的复合菌剂能够在10℃下产酶活性无明显差别，具有较高的稳定性，纤维素降解率为68.94％、半纤维素的降解率为53.61％，适用于我国各地的自然天气，专用于降解废弃的木材加工副产物杨树皮经脱脂及提取活性酚酸类成分后的纤维素生产有机肥料，实现有机废弃物的资源化利用。
四、具体实施方式
实施例1
产纤维素酶的肠杆菌和乳酸乳球菌及产β-葡萄糖苷酶的鞘氨醇杆菌、肉杆菌和琥珀葡萄球菌的酶活验证。
按试剂盒规定方法提取基因组DNA，以基因组DNA为模板，通过PCR反应扩增16SrRNA基因，引物：8f(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)，1492r(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)。PCR反应条件：94℃5min；94℃40s，55℃40s，72℃2min，共30个循环；72℃5min。序列测序验证后提交到GenBank数据库，用BLAST进行相似性比较，用MEGA5软件邻接法构建进化树，从自养家蚕肠道中分离鉴定了5种菌株：产纤维素酶的肠杆菌(Enterobacteriaceaebacterium KOPRI 25617)和乳酸乳球菌(Lactococcus lactis subsp.lactis strainG50)、产β-葡萄糖苷酶的鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium sp.strain MX21)、肉杆菌(Carnobacterium maltaromaticum strain TMW 2.1581)和琥珀葡萄球菌(Staphylococcus succinus strain 14BME20)，经富集培养后，稀释104-107倍，各取50μL稀释液涂布在PDA培养基上，于20℃培养3d。
将培养得到的目标菌株，接种到初始发酵培养基中，以180r/min，20℃摇床培养。每24h取发酵液10mL于4℃，8000r/min离心10min，收集上清液，利用DNS法及P-NPG法测定纤维素酶酶活及β-葡萄糖苷酶酶活，测定上清液中的酶活力。
优化初始发酵培养基：产纤维素酶的肠杆菌和乳酸乳球菌及产β-葡萄糖苷酶的鞘氨醇杆菌、肉杆菌和琥珀葡萄球菌菌株活化的培养基为：初始pH值4.98，葡萄糖添加量14.94g/L，蛋白胨添加量14.82g/L，Mn2+添加量1g/L，木材加工副产物杨树皮经脱脂及提取活性酚酸类成分后的纤维素粉添加量为40g/L。按照此配比进行摇瓶培养，结果显示在该条件下所测得纤维素酶活力为129.324U/mL，β-葡萄糖苷酶活力103.579U/mL，得到最佳的培养条件。
实施例2
复合菌剂的制备
一种高效降解木材加工副产物杨树皮纤维素的复合菌剂，该菌剂的活性成分为下列质量百分比的原料：产纤维素酶的肠杆菌和乳酸乳球菌菌株55％、产β-葡萄糖苷酶的鞘氨醇杆菌、肉杆菌和琥珀葡萄球菌菌株45％，上述菌剂中：所述产纤维素酶的肠杆菌(Enterobacteriaceae bacterium KOPRI 25617)和乳酸乳球菌(Lactococcuslactissubsp.Lactis strain G50)从自养家蚕肠道中分离得到。所述产β-葡萄糖苷酶的鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium sp.strain MX21)、肉杆菌(Carnobacteriummaltaromaticum strain TMW 2.1581)和琥珀葡萄球菌(Staphylococcus succinusstrain 14BME20)从自养家蚕肠道中分离得到。
将上述产纤维素酶的肠杆菌和乳酸乳球菌菌株按照常规方式活化、培养至菌液中活菌数达到2.0×108个/克，活化的培养基为PDA培养基。产β-葡萄糖苷酶的鞘氨醇杆菌、肉杆菌和琥珀葡萄球菌菌株活化的培养基：初始pH值4.98，葡萄糖添加量14.94g/L,蛋白胨添加量14.82g/L，Mn2+添加量1g/L，木材加工副产物杨树皮经脱脂及提取活性酚酸类成分后的纤维素粉添加量为40g/L。
将菌液按照以下质量比混合：产纤维素酶的肠杆菌和乳酸乳球菌55％、产β-葡萄糖苷酶的鞘氨醇杆菌、肉杆菌和琥珀葡萄球菌菌株45％，进行充分混合获得复合菌剂。
实施例3
对木材加工副产物杨树皮经脱脂及提取活性酚酸类成分后纤维素、半纤维素的降解
采用三角瓶固体发酵的方法研究菌株对木材加工副产物杨树皮经脱脂及提取活性酚酸类成分后纤维素的降解效果。
每个300mL三角瓶分装烘干的、剪碎至0.5cm宽、1-2cm长的木材加工副产物杨树皮5g(经脱脂及提取活性酚酸类成分后的纤维素)，(NH4)2SO40.2g，MgSO4·7H2O 0.05g，每瓶加5mM pH 7.0的磷酸缓冲液15mL。各瓶接种0.25mL、2.0×108个/mL浓度的复合菌剂悬液，同时在对照组取等量的无菌水，混匀后置于8℃恒温培养。
定期观察秸秆的形态变化，9d后洗去测定其玉米秸秆的纤维素、半纤维素的降解率(见表1)。
用滤纸过滤发酵液，将残留物烘干称重，纤维素的分解率根据下式计算：(对照样品纤维素含量×样品重量-残体纤维素含量×残体重量)/(对照样品纤维素含量×样品重量)×100％
半纤维素的分解率的计算方法按照纤维素的计算方法进行。
同时采用相应酶检测平板对该5株菌产酶进行测定，纤维素酶和半纤维素酶刚果红平板(刚果红培养基：(NH4)2SO42 g，KH2PO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，CMC-Na 20g，NaCl0.5g，刚果红0.3g，琼脂20g，蒸馏水1L，pH 7.2-7.6)检测即可，测定发酵液中纤维素酶和半纤维素酶的活性，分别为90.16U/ml和76.79U/mL，复合菌剂能够分泌降解纤维素和半纤维素的相关酶，而且酶活力普遍较高。
表1木材加工副产物杨树皮经脱脂及提取活性酚酸类成分后的纤维素固体发酵后纤维素和半纤维素的降解率
纤维素％ 半纤维素％
对照组 10.39 9.18
复合菌剂组 68.94 53.61
由此可见，复合菌剂对木材加工副产物杨树皮经脱脂及提取活性酚酸类成分后的纤维素降解率为68.94％、半纤维素的降解率为53.61％，低温下也有较好的纤维素降解效果。

Claims (2)

1.一种降解木材加工副产物杨树皮纤维素的复合菌剂，其特征在于，所述菌剂的活性成分为下列质量百分比的原料，产纤维素酶的肠杆菌和乳酸乳球菌55％、产β-葡萄糖苷酶的的鞘氨醇杆菌、肉杆菌和琥珀葡萄球菌45％。
2.如权利要求1所述的一种降解木材加工副产物杨树皮纤维素的复合菌剂，其特征在于，所述产纤维素酶的肠杆菌(Enterobacteriaceae bacterium KOPRI 25617)和乳酸乳球菌(Lactococcus lactis subsp.lactis strain G50)；所述产β-葡萄糖苷酶的鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium sp.strain MX21)、肉杆菌(Carnobacterium maltaromaticum strainTMW 2.1581)和琥珀葡萄球菌(Staphylococcus succinus strain 14BME20)。
CN201911011222.2A 2019-10-23 2019-10-23 一种降解木材加工副产物杨树皮纤维素的复合菌剂 Withdrawn CN110982729A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911011222.2A CN110982729A (zh) 2019-10-23 2019-10-23 一种降解木材加工副产物杨树皮纤维素的复合菌剂

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911011222.2A CN110982729A (zh) 2019-10-23 2019-10-23 一种降解木材加工副产物杨树皮纤维素的复合菌剂

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110982729A true CN110982729A (zh) 2020-04-10

Family

ID=70082381

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911011222.2A Withdrawn CN110982729A (zh) 2019-10-23 2019-10-23 一种降解木材加工副产物杨树皮纤维素的复合菌剂

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110982729A (zh)

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050158292A1 (en) * 2003-11-28 2005-07-21 Noriko Tsuji Lactic acid bacteria and their cellular components inducing immunoregulatory function, and method of obtaining the same
CN107446834A (zh) * 2016-06-17 2017-12-08 内蒙古工业大学 一种肠杆菌新菌株、获取方法及应用
KR101919756B1 (ko) * 2017-05-22 2018-11-19 경기대학교 산학협력단 신규한 미생물, 이를 포함하는 스타터 조성물 및 이로 발효된 발효물
WO2019023555A1 (en) * 2017-07-28 2019-01-31 Evelo Biosciences, Inc. POLYMER COMPOSITIONS
CA3075268A1 (en) * 2017-09-08 2019-03-14 Evelo Biosciences, Inc. Bacterial extracellular vesicles
CN109797119A (zh) * 2019-03-11 2019-05-24 大连大学 一种降解秸秆纤维素的复合菌剂
KR102186420B1 (ko) * 2019-10-17 2020-12-03 고려대학교 산학협력단 스타필로코커스 석시너스 14bme20 균주를 유효성분으로 포함하는 알레르기 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050158292A1 (en) * 2003-11-28 2005-07-21 Noriko Tsuji Lactic acid bacteria and their cellular components inducing immunoregulatory function, and method of obtaining the same
CN107446834A (zh) * 2016-06-17 2017-12-08 内蒙古工业大学 一种肠杆菌新菌株、获取方法及应用
KR101919756B1 (ko) * 2017-05-22 2018-11-19 경기대학교 산학협력단 신규한 미생물, 이를 포함하는 스타터 조성물 및 이로 발효된 발효물
WO2019023555A1 (en) * 2017-07-28 2019-01-31 Evelo Biosciences, Inc. POLYMER COMPOSITIONS
CA3075268A1 (en) * 2017-09-08 2019-03-14 Evelo Biosciences, Inc. Bacterial extracellular vesicles
CN109797119A (zh) * 2019-03-11 2019-05-24 大连大学 一种降解秸秆纤维素的复合菌剂
KR102186420B1 (ko) * 2019-10-17 2020-12-03 고려대학교 산학협력단 스타필로코커스 석시너스 14bme20 균주를 유효성분으로 포함하는 알레르기 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SEVIM A 等: "The internal bacterial diversity of stored product pests", 《ANN MICROBIOL》 *
夏晓峰: "小菜蛾中肠微生物多样性及其功能研究", 《万方学位论文》 *
李争明等: "纤维素酶产生菌的筛选、鉴定及发酵产酶条件优化", 《生物技术通报》 *
王翠艳等: "绿色木霉纤维二糖水解酶基因的克隆及其在乳酸菌中的表达与鉴定", 《食品科学》 *
陈士喻 等编: "《食用菌栽培新技术》", 30 September 1996, 中国农业出版社 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Chandra et al. Optimization of cellulases production by Trichoderma citrinoviride on marc of Artemisia annua and its application for bioconversion process
Vassilev et al. Unexploited potential of some biotechnological techniques for biofertilizer production and formulation
Ali et al. Symbiotic cellulolytic bacteria from the gut of the subterranean termite Psammotermes hypostoma Desneux and their role in cellulose digestion
Eida et al. Isolation and characterization of cellulose-decomposing bacteria inhabiting sawdust and coffee residue composts
Stackebrandt et al. The family cellulomonadaceae
Chen et al. Complete genome sequence of Bacillus velezensis 157 isolated from Eucommia ulmoides with pathogenic bacteria inhibiting and lignocellulolytic enzymes production by SSF
Charrier et al. Isolation and characterization of cultivable fermentative bacteria from the intestine of two edible snails, Helixpomatia and Cornu aspersum (Gastropoda: Pulmonata)
Zhang et al. Exploring dynamics and associations of dominant lignocellulose degraders in tomato stalk composting
Sajith et al. Production and partial purification of cellulase from a novel fungus, Aspergillus flavus BS1
CN109161495B (zh) 一种高效降解秸秆纤维素的复合菌剂
CN102180729A (zh) 一种含锶有机微生物肥料及其制备方法
CN102061280B (zh) 产薯蓣皂甙元的枯草芽孢杆菌swb8
CN108048097B (zh) 一种海藻类土壤有益微生物促进剂
Panda et al. Pectinolytic and cellulolytic activity of soil fungal isolates from similipal bioreserve forest
CN104593269A (zh) 一种芽枝状枝孢霉及木质纤维素酶制剂
Photphisutthiphong et al. Dyadobacter and Sphingobacterium isolated from herbivore manure in Thailand and their cellulolytic activity in various organic waste substrates
CN104031860B (zh) 一种高产耐高温木聚糖酶的球状芽孢杆菌及其应用
Sudheep et al. Fascinating fungal endophytes role and possible beneficial applications: an overview
CN110982729A (zh) 一种降解木材加工副产物杨树皮纤维素的复合菌剂
Turaeva et al. Isolation and identification of bacteria with cellulolytic activity from the microflora of animal juice
Silva et al. Biotechnological potential of the Brazilian Caatinga biome
Kumar et al. Isolation, screening, identification, and optimization of xylanase producing bacteria from forests of Western Ghats, India
Kaur et al. Optimization of cellulase produced by fungus isolated from water
CN105567605A (zh) 一株赖氨酸芽孢杆菌及其应用、含有该赖氨酸芽孢杆菌的脱胶助剂及其制备方法
Fatema et al. Isolation, identification and cellulase production by Bacillus brevis from the Acacia forest soil

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WW01 Invention patent application withdrawn after publication
WW01 Invention patent application withdrawn after publication

Application publication date: 20200410