CN105567605A - 一株赖氨酸芽孢杆菌及其应用、含有该赖氨酸芽孢杆菌的脱胶助剂及其制备方法 - Google Patents

一株赖氨酸芽孢杆菌及其应用、含有该赖氨酸芽孢杆菌的脱胶助剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

一株赖氨酸芽孢杆菌及其应用、含有该赖氨酸芽孢杆菌的脱胶助剂及其制备方法，属于大麻脱胶的技术领域。本发明为了解决目前大麻雨露脱胶中耗时长、纤维损伤大等问题。本发明赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus？sp.)Z39ay1<b>保藏</b>在中国微生物菌种<b>保藏</b>管理<b>委员会</b>普通微生物中心，<b>保藏</b>地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，<b>保藏</b>日期为2011年12月20日，<b>保藏</b>编号为CGMCC？No.5618。方法：一、挑取赖氨酸芽孢杆菌dqly-2及束状刺盘孢分别培养得一级种子液；二、将一级种子液分别培养得两种发酵液；三、将两种发酵液混合，加入5～8倍体积自来水。本发明用于大麻雨露脱胶。本发明具有价格低廉，起效快，无污染等优点，加快大麻雨露脱胶进程，提高大麻纤维质量及产量。

Description

一株赖氨酸芽孢杆菌及其应用、含有该赖氨酸芽孢杆菌的脱胶助剂及其制备方法
技术领域
本发明属于大麻脱胶的技术领域；具体涉及一株赖氨酸芽孢杆菌及其应用、含有该赖氨酸芽孢杆菌的脱胶助剂及其制备方法。
背景技术
大麻又称为线麻、火麻、汉麻等，属大麻科大麻属一年生草本植物，为我国古老的纤维作物之一。大麻是重要的纤维作物，其纤维性能优异，具有卫生耐用、抗菌防臭、吸汗透气、防静电及防紫外线等功能，被广泛应用于服装、汽车、建筑等行业中，是一种环保型的纤维原料，有巨大的应用前景。新鲜大麻茎需经过脱胶获得纤维后方可进行下一步加工，雨露沤麻是指大麻收割后，平铺在地上自然环境下经过雨露浸润，一些微生物开始在麻茎上生长使韧皮部与木质部之间失去粘连而分开，从而释放大麻纤维。但是，天然雨露沤麻耗时较长，生产效率低，易损伤大麻纤维的质量，这在一定程度上影响了麻类产业的发展。另外，天然雨露沤麻易受环境及气候的制约，沤麻时间越长气温越低，易出现沤麻不足或无法完成的情况，致使出麻率低，影响经济效益。因此缩短天然雨露沤麻周期，提高出麻率十分重要。
发明内容
本发明要解决目前天然雨露沤麻耗时较长，生产效率低，易损伤大麻纤维质量等问题；而提供了一株赖氨酸芽孢杆菌及其应用、含有该赖氨酸芽孢杆菌的脱胶助剂及其制备方法。本发明缩短大麻雨露脱胶周期，价格低廉，起效快，无污染，提高纤维质量，用于加快大麻雨露脱胶进程、提高大麻纤维质量及产量，促进相关产业的发展。
本发明中的一株赖氨酸芽孢杆菌为赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillussp.)Z39ay1保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2011年12月20日，保藏编号为CGMCCNo.5618。
本发明中细菌Z39ay1，从大庆石化废水中分离获得，革兰氏阴性好氧细菌，菌落圆形乳白色，表面湿润，中间凸起，四周放射状。能发酵蔗糖、葡萄糖、麦芽糖和乳糖；柠檬酸盐试验、过氧化氢酶试验、淀粉水解试验、明胶液化试验，显阳性反应。根据《伯杰细菌鉴定手册》和菌株生理生化生物学特性鉴定为赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillussp.)。果胶是大麻胶的主要成份，大麻脱胶主要指果胶的降解，本发明中赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillussp.)Z39ay1有产果胶酶活性，培养24h果胶酶活性达到170U/mL。加入大麻脱胶助剂中有助缩短大麻雨露沤麻时间，提高大麻纤维质量。
本发明赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillussp.)Z39ay1的分离方法按以下步骤进行：
一、硫化物降解菌的富集培养
取废水10mL，接入200ml初筛培养基中，30℃，培养48h静置30分钟。取上清液40mL，倒入40ml初筛培养基中，加入Na2S.9H2O(0.24g/l)1.2ml，以后每隔48h重复上述步骤，使培养液中Na2S.9H2O的含量最后增加至4.8g，然后继续培养三天，静置30min，吸取上清25ml，转入25ml新鲜的初筛培养基(含4.8gNa2S.9H2O)30℃160r/min振荡培养24h，从中取出20ml加到200ml新鲜的初筛培养基中，30℃160r/min振荡培养24h，得混合菌液。采用碘量法测定培养液中[S2-]，并将[S2-]降解率高的菌液用于硫化物耐受敏感菌的初步分离。
二、硫化物降解菌的初筛及复筛
取1mL步骤一获得的混合菌液1.0mL，注入99.0mL装有玻璃珠的无菌生理盐水中，30℃振荡30min，并按梯度稀释后取0.1mL，分别涂布于复筛培养基平板上30℃培养48h，3个重复。挑取生长快速的不同形态独立菌落，划线纯化，编号培养后进行下一步硫化物降解能力研究。
三、硫化物降解菌对硫化钠降解能力的测定
本实验的负二价硫离子测定采用国家环保总局标准HJ/T60—2000“水质硫化物的测定碘量法”，此法适用于含硫化物0.4mg/L以上的水和废水的测定。取硫化物降解效果最好的菌株，即为本发明赖氨酸芽孢杆菌Z39ay1。
初筛培养基配方(L)：蛋白胨15.0g、牛肉膏3.0g、酵母膏3.0g、KH2PO42.0g、NaCl3.0g、Na2S2O310.0g、Na2HPO42.0g、Na2S.9H2O(1.2～4.8g)、KCl0.5g、MgSO40.5g。(pH＝7.0，于121℃，0.11Mpa灭菌30min。固体培养基加琼脂粉10.0g)
复筛培养基配方(L)：牛肉膏2.0g、蛋白胨10.0g、NaCl5.0g、Na2S.9H2O1.6g。(调pH值7.0到7.2之间，于121℃，0.11Mpa灭菌30min，固体培养基加琼脂粉10.0g)对分离得到的赖氨酸芽孢杆菌Z39ay1进行分子鉴定，按以下步骤进行：
采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株DNA，采用以下引物，以菌株DNA为模板进行PCR扩增，引物序列如下：
上游引物F(5–AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3)，
下游引物R(5–AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3)。
PCR反应条件：94℃变性3min后进入循环；94℃变性45s；55℃退火45s，72℃延伸90s，30个循环后72℃终延伸5min。
PCR产物电泳结果如图1所示。测序工作委托上海生工生物工程技术有限公司完成。
赖氨酸芽孢杆菌Z39ay1的16SrDNA序列长度为1439bp测序结果与GenBank中的16SrDNA序列进行同源性比对，BLAST对比结果如表1，构建的系统发育树如图2所示，以确定菌株的种属关系。
同源性分析结果表明，该序列与赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillussp)内各种之间有极高的同源性，相似度可达100％。通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果确定赖氨酸芽孢杆菌Z39ay1属于赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillussp)。
表1BLAST对比结果
本发明中赖氨酸芽孢杆菌的脱胶助剂是由赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillussp.)Z39ay1和束状刺盘孢(Colletotrichumdematium)制成的；所述的束状刺盘孢(Colletotrichumdematium)购于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，菌种编号3.2947，烟草低头病的致病菌，培养温度为25～28℃，菌种历史：中国科学院微生物研究所-山东益都农科院烟草研究所；具体制备方法是按下述步骤进行的：
步骤一、挑取权利要求1所述的赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillussp.)Z39ay1接种到100mL牛肉膏蛋白胨培养基中，在120r/min、28℃条件下培养16～24h，获得一级种子液1，将束状刺盘孢(Colletotrichumdematium)接种到100mL液体马铃薯葡萄糖培养基中，在28℃条件下静止培养4～5d，获得一级种子液2。
步骤二、将步骤一获得的一级种子液1，按体积百分含量0.5％～1.0％的接种量加入到牛肉膏蛋白胨发酵培养基中，于120～140r/min、28℃培养24～48h，得发酵液1；将步骤一获得的一级种子液2，按体积百分含量1.0％～2.0％的接种量加入到发酵培养基中，于28℃，静止培养4～5d，得发酵液2；
步骤三、将步骤二获得的发酵液1和发酵液2按体积比1：1～1.5比例混合，得混合物，向混合物中加入5～8倍(v/v)自来水，混合均匀后即得到大麻雨露脱胶助剂。
步骤二中制备发酵液2的发酵培养基的配方为：蛋白胨5g/L，葡萄糖20g/L，硝酸铵1g/L，七水硫酸镁0.5g/L，磷酸氢二钾1g/L，加蒸馏水定容至1L，pH为7.0。
本发明可采用蔗糖或可溶性淀粉替换发酵液2的发酵培养基中的葡萄糖。
步骤三中发酵液1中赖氨酸芽孢杆菌的活菌数为109～1011个/mL。
含有该赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillussp.)Z39ay1的脱胶助剂的使用方法是将其直接喷施于收割后平铺于地面的大麻茎表面，地面平铺大麻茎的厚度最好低于10cm，若高于10cm则需将麻茎翻开喷施以确保底层麻茎可以接种到助剂，施用量为500～800mL/m2。
东北地区大麻收获期为9～10月份气温偏低。本发明中采用的赖氨酸芽孢杆菌和束状刺盘孢均可在20～25℃环境下生长，对环境适应能力强，易于大面积田间推广。
天然沤麻中，大麻脱胶菌需要先从空气或土壤中接种到大麻茎上才能开始沤麻，本发明将脱胶菌直接接种到大麻茎上，省略了第一步天然接种过程且菌密度高，能够缩短雨露沤麻时间(7d～12d即可完成大麻雨露沤麻过程)，可以避免纤维素降解菌的大面积生长，且大大提高生产效率，同时保证了大麻纤维的质量，本发明公开的助剂可使大麻纤维更加柔软，纤维强度增加，得麻率提高。
本发明中大麻雨露脱胶助剂以牛肉膏，蛋白胨，葡萄糖，N，P，K等作为主要成份，具有易降解，无二次污染，可同时提高土壤肥力等优点。
附图说明
图1是赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillussp.)Z39ay1的16SrDNA的电泳照片，其中M为2000bpmaker，泳道1-6为PCR产物；
图2是赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillussp.)Z39ay1的系统发育树。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式中采用两种菌株，具体如下：其中一种菌株为赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillussp.)Z39ay1保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2011年12月20日，保藏编号为CGMCCNo.5618。
另一种菌株为束状刺盘孢(Colletotrichumdematium)购于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种编号3.2947。
本实施方式中含有赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillussp.)Z39ay1的脱胶助剂的具体制备方法是按下述步骤进行的：
步骤一、挑取权利要求1所述的赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillussp.)Z39ay1接种到100mL牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl5g，定容至1L，pH7.0)中，在120r/min、28℃条件下培养20h，获得一级种子液1，将束状刺盘孢(Colletotrichumdematium)接种到100mL液体马铃薯葡萄糖培养基(马铃薯洗净去皮，称量200g切碎，加水1L煮沸半个小时，纱布过滤，再加20g葡萄糖，定容至1L，天然pH)中，在28℃条件下静止培养4d，获得一级种子液2。
步骤二、将步骤一获得的一级种子液1，按体积百分含量0.5％的接种量加入到牛肉膏蛋白胨发酵培养基中，于120r/min、28℃培养20h，得发酵液1；将步骤一获得的一级种子液2，按体积百分含量1.0％的接种量加入到发酵培养基(蛋白胨5g/L，葡萄糖20g/L，硝酸铵1g/L，七水硫酸镁0.5g/L，磷酸氢二钾1g/L，加蒸馏水定容至1L，pH为7.0)中，于28℃，静止培养4d，得发酵液2；
步骤二中发酵培养基配方：蛋白胨5g/L，葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖中任一种20g/L，磷酸氢二钾1g/L，硝酸铵1g/L，七水硫酸镁0.1g/L，pH7.0。
步骤三、将步骤二获得的发酵液1(赖氨酸芽孢杆菌的活菌数为109个/mL，和发酵液2按1：1(v/v)比例混合，得混合物，向混合物中加入5倍(v/v)自来水，混合均匀后即得到大麻脱胶助剂。
采用下述试验验证发明效果：
对照组：收割后的大麻原茎平铺于地面，面积约为5m2，厚度约为10cm，在大麻茎上均匀喷洒自来水，施用量为500～800mL/m2，在天然环境下沤麻。
实验组：收割后的大麻原茎平铺于地面，面积约为5m2，厚度约为10cm，均匀喷施上述大麻脱胶助剂，施用量为500～800mL/m2，在天然环境下沤麻。
对照组和实验组大麻均由同一片种子田收割，沤麻环境完全相同。
沤麻完成后，记录沤麻完成时间、测定大麻纤维强度及大麻得麻率。
得麻率计算公式为：
结果见表1：
表1
由表1可知，使用具体实施方式一的助剂沤麻，大麻纤维强度高于对照组23.88％，保证了大麻纤维的质量。
使用具体实施方式一的助剂沤麻更加彻底，可以提高2.17％得麻率。
<110>黑龙江省科学院大庆分院
<120>一株赖氨酸芽孢杆菌及其应用、含有该赖氨酸芽孢杆菌的脱胶助剂及其制备方法
<160>3
<210>1
<211>1439
<212>DNA
<213>赖氨酸芽孢杆菌属（Lysinibacillussp）
<220>
<223>赖氨酸芽孢杆菌Z39ay1的16srDNA序列
<400>1
atacatgcaagtcgagcgaacagagaaggagcttgctcctttgacgttagcggcggacgg60
gtgagtaacacgtgggcaacctaccttatagtttgggataactccgggaaaccggggcta120
ataccgaataatctgtttcacctcatggtgaaatattgaaagacggtttcggctgtcgct180
ataggatgggcccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcgacga240
tgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcc300
tacgggaggcagcagtagggaatcttccacaatgggcgaaagcctgatggagcaacgccg360
cgtgagtgaagaaggatttcggttcgtaaaactctgttgtaagggaagaacaagtacagt420
agtaactggctgtaccttgacggtaccttattagaaagccacggctaactacgtgccagc480
agccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagcgcgcgc540
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ctgggagacttgagtgcagaagaggatagtggaattccaagtgtagcggtgaaatgcgta660
gagatttggaggaacaccagtggcgaaggcgactatctggtctgtaactgacactgaggc720
gcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatga780
gtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcattaagcactccg840
cctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcg900
gtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcccg960
ttgaccactgtagagatatggtttccccttcgggggcaacggtgacaggtggtgcatggt1020
tgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgat1080
cttagttgccatcatttagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaa1140
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ttgtaacacccgaagtcggtgaggtaacctttggagccagccgccgaaggggaataagg1439
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物F
<400>2
agagtttgatcctggctcag20
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物R
<400>3
aaggaggtgatccagccgca20

Claims (9)

1.一株赖氨酸芽孢杆菌，其特征在于该菌株为赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillussp.)Z39ay1保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2011年12月20日，保藏编号为CGMCCNo.5618。
2.如权利要求1所述的一株赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillussp.)Z39ay1在制备用于大麻脱胶的助剂中的应用。
3.一种含有权利要求1所述的赖氨酸芽孢杆菌的脱胶助剂，其特征在于该脱胶助剂是由权利要求1所述的赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillussp.)Z39ay1和束状刺盘孢制成的；所述的束状刺盘孢(Colletotrichumdematium)购于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种编号3.2947。
4.如权利要求3所述脱胶助剂的制备方法，其特征在于该制备方法是按下述步骤进行的：
步骤一、挑取权利要求1所述的赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillussp.)Z39ay1接种到100mL牛肉膏蛋白胨培养基中，在120r/min、28℃条件下培养16～24h，获得一级种子液1，将束状刺盘孢(Colletotrichumdematium)接种到100mL液体马铃薯葡萄糖培养基中，在28℃条件下静止培养4～5d，获得一级种子液2；
步骤二、将步骤一获得的一级种子液1，按体积百分含量0.5％～1.0％的接种量加入到牛肉膏蛋白胨发酵培养基中，于120～140r/min、28℃培养24～48h，得发酵液1；将步骤一获得的一级种子液2，按体积百分含量1.0％～2.0％的接种量加入到发酵培养基中，于28℃，静止培养4～5d，得发酵液2；
步骤三、将步骤二获得的发酵液1和发酵液2按体积比1：1～1.5比例混合，得混合物，向混合物中加入5～8倍(v/v)自来水，混合均匀后即得到大麻雨露脱胶助剂。
5.根据权利要求4所述脱胶助剂的制备方法，其特征在于步骤二中制备发酵液2的发酵培养基的配方为：蛋白胨5g/L，葡萄糖20g/L，硝酸铵1g/L，七水硫酸镁0.5g/L，磷酸氢二钾1g/L，加蒸馏水定容至1L，pH为7.0。
6.根据权利要求5所述脱胶助剂的制备方法，其特征在于采用蔗糖或可溶性淀粉替换葡萄糖。
7.根据权利要求4所述脱胶助剂的制备方法，其特征在于步骤三中发酵液1中赖氨酸芽孢杆菌的活菌数为109～1011个/mL。
8.根据权利要求4所述脱胶助剂的制备方法，其特征在于步骤三中发酵液1和发酵液2按体积比1：1比例混合。
9.根据权利要求4所述脱胶助剂的制备方法，其特征在于权利要求4方法制备的脱胶助剂的使用方法是将其直接喷施于收割后平铺于地面的大麻茎表面，施用量为(500～800)mL/m2。
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CN201610093740.3A Pending CN105567605A (zh) 2016-02-19 2016-02-19 一株赖氨酸芽孢杆菌及其应用、含有该赖氨酸芽孢杆菌的脱胶助剂及其制备方法

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