CN1486613A - 一种大批量生产生物除草剂的方法 - Google Patents

Abstract

本发明为一种大批量生产生物除草剂的方法，属于微生物应用于农业植物保护领域。生物除草剂，真菌菌株胶孢炭疽菌(QZ－97a)、紫茎泽兰链格孢、马唐双曲孢霉属菌株以及百日草链格孢等通过液体－固体联合发酵的方法可以大批量生产获得。液体发酵及固体发酵的培养基利用的是工业下脚料的农副基础产品，原料来源广泛，价格低廉。适宜的起始含水量，有助于菌体从培养基中获得营养物质和氧的传递，转化率高。固体发酵的温度范围较宽，光照条件也很容易满足。整个培养过程简单，可操作性强，并不需要特殊的设备，是一种简便大批量生产生物除草剂的方法。

Description

一种大批量生产生物除草剂的方法

一、技术领域

本发明为一种大批量生产生物除草剂的方法，属于微生物应用于农业植物保护、防除农作物杂草的技术领域，专用于农田杂草的生物防除。

二、技术背景

目前，国内防治草害主要还是依赖于化学农药产品，而且其使用量和面积还在不断扩大。随着全球经济一体化和贸易国际化，全国农药行业正面临着严峻的挑战，新品种化学农药的高额研制开发成本阻碍了农药工业的发展和农业生产的需要。另一方面，化学农药的大量使用，已经和正在造成严重的环境污染问题，直接危害到人畜健康和影响农业的可持续发展。因此，寻求新的防治手段，降低化学农药的使用，成为一个迫在眉睫的关键。发展生物防治技术，特别是以生物农药替代化学农药，以在世界范围内形成共识，引起了大家的关注。生物农药新品的研制开发，比化学农药所需投入较少，且周期短，符合国情。生物农药的开发和利用，正成为农业现代化和农业可持续的标志性技术。展望未来，生物农药将作为一种高新技术，在保护环境，保证人类健康，在农林业可持续发展中，发挥愈来愈重要的作用。目前，作为生物农药的一个主要组成部分，国内尚没有一种产业化的生物除草剂，而绿色食品和有机食品的生产却迫切需求无污染的生物除草剂解决杂草问题。

波斯婆婆纳(Veronica persica Poir)、马唐(Digitaria sanguinalis(L.)Scop.)、紫茎泽兰(Eupatorium adenophorum Spreng.)和苍耳(Xanthium occidentale Bertol.)是世界性的恶性杂草，对农田和生态环境造成了极为严重的危害。

波斯婆婆纳是麦类、油菜等夏熟作物田的恶性杂草，对棉、玉米、大豆等幼苗生长也危害严重，蔬菜田、果园、草坪和园艺作物田中也常有发生。波斯婆婆纳的分布范围广泛，我国长江流域及华北地区均有其发生和危害的报道，另外它也是欧洲、西亚和美洲农田的恶性杂草。该杂草繁殖能力强，生长速度快，生长期长，耐药性强，人工、机械和化学防除比较困难。

马唐是玉米、棉花、甘薯、高粱、大豆、花生等秋熟旱作物田的恶性杂草，对棉花、烟草、麻类、甘蔗等幼苗生长危害严重，也是蔬菜田、果园、草坪和园艺作物田的优势杂草。甚至也是南方陆稻田的主要危害性杂草。马唐的分布范围广泛，是世界热带和温带地区广布种。该杂草繁殖能力强，生长速度快，生长期长，消耗地力，遮光，耐药性强。

紫茎泽兰入侵农田、草地、草原、路边、宅旁、经济林地和森林，以其异株克生作用的特性，较快形成优势种群，已经给农、林、牧业生产及多种经营造成极大的损失。自20世纪40年代传入我国以来，已经西南地区的云南、贵州、四川、广西和重庆广泛分布和危害，并仍在以每年大约60公里的速度，随西南风向东和向北方向传播扩散。

苍耳是旱地重要的危害性杂草，其植株高大，对作物生长造成严重影响。主要分布发生在东北、华北、华中、华东、华南和西南等地区，主要危害玉米、棉花、大豆、甘薯、蔬菜等旱地作物。

发明人在杂草生物防治的研究过程中发现这四种杂草在自然界存在自然发病的植株，对这四种杂草的寄生真菌进行筛选研究，最终分离到四种菌株，并对这四种菌种的培养条件、大批量生产方法、安全性及致病性均已进行了较为详细的研究，结果表明，这四种菌株均有潜力发展成为生物除草剂。它们分别为胶胞炭疽菌婆婆纳专化型(Colletotrichum gloeosporioides f.sp.weronicae Sheng Qiang et Qing Zeng)、紫茎泽兰链格孢(Alternaria alternata(Fr.)Keissler)、马唐双曲孢霉属(Nakataea Hara)菌株以及百日草链格孢(Alternaria zinniae Pape)菌株。

目前，国内外除针对马唐的生物真菌在美国有所报道外(与本权力要求书所指马唐生防菌株不同)，波斯婆婆纳和紫茎泽兰的生物除草剂尚未见报道。而有关这四种生防真菌大批量生产的方法更是鲜见报道。生物除草剂要实现产业化，生产成本是至关重要的因素。从经济因素方面考虑，要求培养基组分简单、价格便宜、原料可大量获得，并且生产过程易于操作，劳动量降到最低。因而，研究生物除草剂的大批量生产工艺和方法，是生物除草剂研究中的核心关键内容，一方面，一株优良生防菌株为达到商业化进程，必须能够有一套较为完整齐全的大批量生产工艺，另一方面，农业生产实践中，为了保证农产品在价格上有竞争力，要求使用的生物除草剂价格便宜。

现在已经商品化或正在生产上使用的真菌除草剂，多是经发酵技术生产的。固体发酵，生产周期相对较长，因而生物除草剂工业化生产的首选方法是液体发酵，这种方法不需要对现有的工业发酵设备做多少改进就可以直接利用标准的发酵和下游处理装置进行。北美四种商业化的生物除草剂中，Collego^、Devine^和BioMal^是通过深层液体发酵生产的。但是生物除草剂的除草活性单元往往是真菌有活力的部分，例如菌丝体、分生孢子、厚垣孢子等无性繁殖体，而通过液体发酵生产的分生孢子等真菌活性部分在发酵液中保藏，活力衰退较快。例如生物除草剂Devine^是第一个被作为生物除草剂研制的，它的侵染单元为液体发酵获得的新鲜的厚垣孢子悬浮剂，必须像新鲜牛奶一样贮藏，并且只有六个星期的货架期，致使其商业化进程被延迟，直至上个世纪80年代初才被商业化。此外，为了得到高浓度的生物除草剂，需要经过过滤浓缩、脱水干燥等一系列步骤，整个工艺流程复杂，需要专用设备，增加了成本。

与同期化学除草剂的发展速度相比较，生物除草剂的发展速度无疑缓慢，经济高效的大批量生产方法一直是阻碍生物除草剂发展的瓶颈因子。

三、发明内容

技术问题本发明的目的是一种大批量生产生物除草剂的方法，针对真菌菌株的生物学与产孢特性，通过对培养发酵方法、培养基的种类、pH和水分含量及培养时间、光照、温度等一系列研究，克服阻碍生物除草剂发展的瓶颈因子，探索最经济有效的大批量生产生物除草剂的工艺。

技术方案：一种大批量生产生物除草剂的方法，其特征在于，采用液体-固体联合发酵的方法，其具体工艺流程如下：

将生物除草剂真菌菌株接种到PDA培养基上培养生长，在15-30℃条件下，培养5-7d，获得一级种菌后；

切取一级种菌培养物小块，接种到液体培养基中，15-35℃振荡发酵培养3-10d，振摇速度为20-180转/min，待菌丝团长满后，获得二级液体种菌，即菌体悬浮液；

固体培养基由麦麸或米糠和其它一种、两种或三种农副产品组成，麦麸或米糠干重∶其它组分干重＝1∶0.1-9，按比例称取固体培养基干料后，加入干料重的0.3-3.0倍水，拌匀灭菌；

在无菌环境下将菌体悬浮液接种到灭过菌的固体培养基上，好气培养，温度15-35℃，无菌条件下固体发酵生产3-8d，获得大批量的生物除草剂。

上述的一种大批量生产生物除草剂的方法，其特征在于，二级液体种菌最好用粉碎机粉碎获得菌体悬浮液；固体培养的条件最好增加20W波长365nm黑光灯、日光灯或紫外光灯间隙照射。

上述液体培养基和固体培养基的农副产品原料为工业下脚料的农副基础产品，包括黄豆粉、麦麸、米糠、酿造酵母(酒酿渣)、亚麻子饼粉、玉米粉、蔗糖、葡萄糖、豆渣、豆粕、豆饼粉、玉米淀粉、豆饼粉、甘薯粉、花生粉、棉子饼、花生壳、玉米蛋白及多种鱼粉等多种农副产品，以及多种树木的锯末屑。

有益效果  本发明与现有技术相比，具有如下优点和积极效果：

1、比较纯固体发酵，本发明方法可诱导生产至少5倍以上的生物除草剂产品，并使固体发酵时间缩短2-7d。发明人在对生物除草剂的大批量生产研制过程中，发现有些生物除草剂能够通过液体发酵生产，有些能通过固体发酵生产获得。通过液体发酵生产的生物除草剂保存在发酵液中，活力衰退较快，六个星期后基本丧失。而要将生物除草剂从发酵液中分离出来，技术难度需求较高，需要一系列额外的高值设备，需要另行增加很大的资金。对于生物除草剂这样一项风险性较大，国内目前尚无一项研制成功先例的研究技术，研制之初，不可能找到足够的资金支持。这无疑将限制此项技术的深入研究。真菌通过固体发酵生产能够克服从发酵液中收获生物除草剂困难的缺点，但是，发酵过程相对较长，并且真菌在其中长势极不均匀，造成原材料极大的浪费。因此尝试利用液体-固体发酵相结合的培养方式，即通过液体发酵获得的液体菌种，能够均匀接种到固体培养基上，在培养基上长势均匀，能充分利用原材料物，并使固体发酵时间缩短2-7d。生物除草剂菌种在固体培养基上固态发酵的温度较宽，在15-35℃的条件下生长，均能获得大量的生物除草剂；对光照的要求不严格，在自然光照、全光照及全黑暗条件下，均能正常生长获得生物除草剂，并在特殊光源(黑光灯、紫外灯)照射下可诱导生产至少5倍以上的生物除草剂产品。

2、本发明所选用的培养基的营养全面。本发明所用的液体和固体培养基为工业下脚料的农副基础产品，包括黄豆粉、麦麸、米糠、酿造酵母(酒酿渣)、亚麻子饼粉、玉米粉、蔗糖、葡萄糖、豆渣、豆粕、玉米淀粉、豆饼粉、甘油、甘薯粉、花生粉、棉子饼、花生壳、玉米蛋白及多种鱼粉等多种农副产品，以及多种树木的残屑锯末。这些发酵培养基价格低廉，来源充足，被转化为产品的效率高。所选用的培养基的营养全面，含有丰富的粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、无氮浸出物、粗灰分以及钙、磷等元素。在制备发酵培养基时合理配制能够满足菌种生长、繁殖。

3、适宜的起始含水量，使得培养基有合适的疏松度，颗粒间存在一定空隙，有助于菌体从培养基获得营养物质和氧的传递，从而促进生长繁殖。过高的含水量会导致培养基黏结成团，多孔性降低，影响氧的传递；含水量过低，则使培养基膨胀程度降低，水的活度低，从而抑制菌体生长。真菌在适宜的环境下先进行营养生长，然后在条件不适宜时进行生殖生长。因此，在配制培养基时要掌握好水分的加入量，水分加入过少，湿度过小，真菌的营养生长不充分，生殖生长有限。但是培养基湿度过大时，又容易造成培养基通气差，在发酵过程中受细菌污染，真菌的营养生长同样受抑，也不利于生殖生长的进行。而在加水适宜时，真菌的营养生长充分，将不利于细菌生长导致污染。研究发现，固体发酵培养基按比例称取干料并拌匀，再按干料重量∶水的重量＝1∶0.3-3的比例加水拌匀，能够得到松紧适宜的固体培养基，适合菌种生长。

4、本发明所选用的液体和固体培养基均可大量获得，价廉、操作方便、产孢效率高，利于生产成本的控制。固态发酵试验的基质采用麸皮、米糠等农业副产品。麸皮为小麦面粉加工的副产物，含有丰富的碳水化合物和含氮化合物，并含有多种维生素，质地疏松，利于通气，是微生物生长繁殖的优良基质；且原料来源广泛，价格低廉。

5、工艺简单易行。液体-固体联合发酵方法结合了液体发酵和固体发酵两种发酵方法的长处，省却了一系列从液体发酵液中收获生物除草剂接种体所需的繁复工艺和固态发酵时间较长的缺点，液体发酵种菌均匀接种于固体培养基上，使发酵原料转化为生物除草剂的比例增高，减少了原料的浪费，缩短了整个发酵的周期。而且，生产出来的分生孢子吸附在干燥的固体培养基基质中，后处理工艺简单易行，制剂容易存放。

四、具体实施方式

实施例1胶孢炭疽菌婆婆纳专化型菌株QZ-97a(专利申请号为00112506.0)，它的除草活性成分为该菌的分生孢子。具体实施方法如下：菌株QZ-97a在PDA培养基上培养7d，接种到玉米粉黄豆粉蔗糖液体培养基中培养5-7d，用粉碎机粉碎获得菌体悬浮液。固体培养基由麦麸、黄豆粉和甘薯粉按干重比7∶2∶1称取后，加入干料重的1.5倍水，拌匀灭菌。在无菌环境下将菌体悬浮液接种到灭过菌的固体培养基上，在自制的培养箱中好气培养3-7d，房间的温度用空调控制20℃，每克干物质生产的孢子量可达到7.8×10⁹个/克以上，过筛后，能获得孢子量在10¹⁰个/克以上的孢子粉。这个数量足以满足在大田使用的同时，保证产品的生产成本保持低廉。液-固体联合发酵较纯固体发酵产孢量至少多出5倍，且固体发酵时间缩短2-7d。上述实施方法中固体培养基、发酵周期、不同水分含量试验及结果如下：

配制10组固体培养基，1.麦麸50克；2.麦麸25克+豆粕25克；3.麦麸25克+米糠25克；4.麦麸35克+玉米粉15克；5.米糠50克；6.米糠15克+豆粕35克；7.麦麸30+锯末15克+鱼粉5克；8.锯末15克+豆粕35克；9.麦麸35克+豆渣15克；10.麦麸35克+黄豆粉10克+甘薯粉5克。每组培养基中各加入碳酸钙1.5克、蔗糖1.5克、水40ml混匀灭菌，接种二级液体种菌后进行产孢。固体培养基产孢完毕后，于30℃烘箱中烘干，取0.1g加入100ml水，用碾钵充分磨碎后，计数孢子数(表1)。

表1固体培养基对菌株QZ-97a产孢的影响

                      产孢量                 显著水平

培养基

                     10⁹个/克           Significance level

Solid media

                   Conidia yields          0.05     0.01

麦麸+玉米粉          6.67±0.30              b       BC

麦麸+锯末+鱼粉       7.41±1.20              a       A

麦麸                 6.99±0.42              b       AB

麦麸+米糠            6.76±0.54              b       B

麦麸+豆饼粉          6.38±0.45              c       BC

米糠                 5.79±0.53              d       D

米糠+豆饼粉          7.24±0.79              a       A

锯末+豆饼粉          5.46±0.26              d       D

麦麸+豆渣            6.12±0.75              b       C

麦麸+黄豆粉+甘薯粉   7.80±0.65              a       A

表1结果表明，胶孢炭疽菌QZ-97a在供试的10种固体培养基上生长都能够得到大量的分生孢子，最大的产孢量出现在麦麸黄豆粉甘薯粉固体培养基中，发酵结束后每克干物质孢子量达到7.8×10⁹个。

固体培养基(麦麸35克、黄豆粉10克、甘薯粉5克、碳酸钙1.5克、蔗糖1.5克)，接种菌丝体悬浮液后，固体分别培养生长2、3、4、5、6、7、8天。产孢完毕后，于30℃烘箱中烘干，取0.1g加入100ml水，用碾钵充分磨碎后，计数孢子数(表2)。

表2  发酵周期对炭疽菌QZ-97a固体发酵产孢的影响

               产孢量       显著水平

发酵周期(d)

              10⁸个/ml   0.05    0.01

     7       4.35±0.70    a       A

     9       4.20±0.19    ab      A

     8       4.08±0.35    ab      A

     6       3.99±0.32    b       AB

     5       3.57±0.44    c       B

     4       2.59±0.30    d       C

     3       1.18±0.62    e       D

     2       0.68±0.25    f       E

表2结果表明，产孢量随着时间延长，产孢量增大，固体发酵至第7天时产孢量达到最大。延长发酵时间，产孢量之间差异不显著，因此，在培养时，固体培养7天即可结束培养，这样至少可以缩短固体培养时间3天。

固体培养基(麦麸35克、黄豆粉10克、甘薯粉5克、碳酸钙1.5克、蔗糖1.5克)，分别加水5、15、25、35、45、55、65、75、85、95ml，接种菌丝体悬浮液后，生长5天检测孢子数(表3)。

表3不同水分含量对固体培养基产孢的影响

水分含量                     显著水平

           产孢量10⁹个/克

 (ml)                     0.05      0.01

  95         5.3±0.70    b         BC

  85         7.2±0.63    ab        A

  75         7.3±0.80    a         A

  65         6.4±0.50    b         AB

  55         6.3±0.31    b         AB

  45         6.1±0.61    b         AB

  35         5.5±0.56    c         BC

  25         4.7±0.49    c         BC

  15         4.3±0.41    c         C

   5         3.1±0.51    d         C

培养基含水量是决定固体培养产孢的一个重要因子。表3中，产孢量随着含水量增加而增大，在加水量为75ml时产孢量达到最大值，加水量继续增大时，产孢量出现下降的趋势。因此，在配制固体培养基时，掌握好固体培养基的含水量至关重要，以加入干料重的1.5倍时最佳。

实施例2  紫茎泽兰链格孢菌利用粗代谢产物控制杂草，具体实施方法如下：链格孢菌株(专利申请号为00112560.5)在PDA培养基上培养7天，接种到黄豆粉玉米粉蔗糖液体培养基中培养7天，用粉碎机粉碎获得菌丝体悬浮液。固体培养基由玉米粉豆饼按干重比1∶1称取后，加入干料重的0.33倍水，拌匀灭菌。在无菌环境下将菌体悬浮液接种到灭过菌的固体培养基上，用保鲜袋密封后，适当打孔，控温25℃培养10天。培养结束后风干制备粗毒素，稀释后用针刺法测试生物活性，产毒能力用显微测微尺测量病斑直径大小(mm)表示。按此法培养显著提高产毒量，可使叶片致病病斑直径达4.63mm以上，固体发酵时间较纯固体发酵缩短2-7d。

上述实施方法中固体培养基、发酵周期、不同水分含量试验及结果如下：

分别用1∶1质量比的米糠+麦麸、玉米粉+麦麸、米糠+豆饼、玉米粉+豆饼、玉米粉+黄豆粉、豆渣+甘薯粉、花生壳+花生粉、酒酿渣+棉子饼和玉米淀粉+亚麻子饼粉配制固体培养基。接种摇瓶振荡培养的链格孢菌丝体，按实施例于适宜条件下固体生长产毒。固体培养结束后，风干按流程制备粗毒素，稀释后用针刺法测试生物活性，重复5次(表4)。

     表4固体培养介质对链格孢产毒量的影响

                      病斑直径      显著水平

  培养基                (mm)      0.05     0.01

玉米粉+豆饼          2.49±0.23    a        A

玉米粉+麦麸          1.70±0.14    b        B

米糠+豆饼            0.51±0.15    d        D

米糠+麦麸            0.55±0.10    d        D

玉米粉+黄豆粉        0.88±0.16    c        C

豆渣+甘薯粉          0.65±0.13    d        D

花生壳+花生粉        1.63±0.12    b        B

酒酿渣+棉子饼        1.32±0.08    b        B

玉米淀粉+亚麻子饼粉  1.25±0.11    b        B

几种固体培养介质对链格孢产毒量的比较表明，多数固体介质可以用来产毒，但链格孢在玉米粉和豆饼复配的固体培养基中产毒最高，可使叶片致病病斑直径达2.49mm。因此，选用玉米粉豆饼作为链格孢产毒的最佳培养介质。

配制玉米粉∶豆饼质量比为1∶1的固体培养基，干物质与水的比例分别为4∶1、3∶1、2∶1、1∶1，按实施例接种培养风干后制备粗毒素，稀释针刺测试活性。

                表5培养基含水量对链格孢产毒的影响

                  病斑直径      显著水平

 干物质重∶水重     (mm)      0.05     0.01

 4∶1            2.31±0.19    c        C

 3∶1            4.63±0.24    a        A

 2∶1            3.06±0.25    b        B

 1∶1            1.80±0.23    d        D

培养基含水量决定了链格孢在固体培养基上的产毒大小，在干物质重∶水重＝3∶1时，产毒量达到4.63mm，为最大值。含水量继续增大，产毒量下降。

按实施例配制质量比1∶1的玉米粉+豆饼固体培养基，接种后于适宜条件下分别培养5、10、15、20天后取样，风干后制备粗毒素。稀释针刺测试活性。

    表6培养时间对链格孢产毒量的影响

                           显著水平

培养时间(d)    病斑直径

                          0.05  0.01

    5         4.35±0.70    b    B

    10        5.57±0.44    a    A

    15        5.59±0.30    a    A

    20        6.18±0.62    a    A

固体培养10天，产毒量能够达到最大值，进一步增加培养时间，对毒素的增大效果不显著，掌握这一点，利于在实践中把握好固体发酵的时间，省时省力。

实施例3  马唐双曲孢霉属的除草活性成分为该菌的分生孢子。具体实施方法如下：菌株QZ-2000(专利申请号为011340020.9)，在PDA培养基上培养5天，接种到玉米粉黄豆粉蔗糖液体培养基中培养5-7天，用粉碎机粉碎获得菌丝体悬浮液。固体培养基由黄豆粉+棉子饼按干重比2∶1称取后，加入干料重的0.6倍水，拌匀灭菌。在无菌环境下将菌体悬浮液接种到灭过菌的固体培养基上，在自制的培养箱中好气培养3-8天，置于20W黑光灯(波长365nm)下、日光灯照射1-3天、或紫外光灯间隙照射共计1-10小时，房间的温度用空调控制在28℃。每克干物质最大产孢量达到8.6×10⁸个/克，较纯固体发酵产孢量至少多出5倍，且固体发酵时间缩短2-7d。

上述实施方法中固体培养基、光照及不同水分含量试验及结果如下：

配制质量比2∶1的固体培养基(麦麸单用)，所选择的锯末木材有杉树、杨树、松树及栎树，按照干料重量∶水重量＝1∶0.8配制固体培养基。按实施例于适宜条件下固体生长产孢，待菌丝铺满培养基，置于黑光灯下照射2天后测量产孢量。

               表7固体培养基对菌株QZ-2000产孢的影响(10⁸个/g^*)

            杉树    杨树      松树    麦      杉锯+    杨锯+    松锯+     栎锯+

  培养基

            锯末    锯末      锯末    麸      麦麸     麦麸     麦麸      麦麸

平均产孢量  2.5c    3.4c      3.6c    6.0ab   6.6ab    6.9a     6.1ab     5.8b

                                                                          花生壳

            黄豆粉+ 甘薯粉+   米糠+   花生粉+ 鱼粉+棉  豆渣+    玉米粉+

                                                                          +玉米

  培养基

            棉子饼  花生壳    玉米粉  棉子饼  子饼     杨锯     豆饼粉

                                                                          蛋白

平均产孢量  7.1a    5.2b      6.1b    4.9b    4.8b     6.4ab    3.6b      2.66c

注^*：数据后跟不同字母的为差异显著(p＜0.05)。

表7结果表明，多种树材的锯末以及多种农副产品都可以用来生产QZ-2000的分生孢子，转化率较高，其中又以黄豆粉+棉子饼混用产孢量最大，每克干物质最大产孢量达到7.1×10⁸个/克。

配制质量比为2∶1的黄豆粉+棉子饼固体培养基，加水使得含水量分别是固体培养基干重的30％、40％、50％、60％和70％，按照实施例接种后待菌丝铺满培养基，置于黑光灯下照射2天，检测孢子量(表8)。

     表8不同含水量对固体培养基产孢的影响(10⁸个/g^*)

  含水量      30％     40％     50％     60％     70％

平均产孢量    3.19d    5.25c    7.25b    7.64a    5.75c

注^*：数据后跟不同字母的为差异显著(p＜0.05)。

表8结果表明，随着含水量增加，产孢量增大。含水量60％的固体培养基产孢量最大，产孢量为7.64×10⁸个/g。培养基含水量增大到70％时，产孢量显著降低。因此，在固体发酵时要掌握好水分的加入量。

配制质量比为2∶1的黄豆粉+棉子饼固体培养基，含水量为固体培养基干重的60％。按照实施例接种后待菌丝铺满培养基时，1.加盖置于黑光灯、紫外灯、日光灯下连续光照、12h光暗交替；距离25cm；2.去盖置于以上各条件下；3.连续黑暗条件下处理。以室内自然光照作为对照，室温为25-28℃，2d后计数孢子产生的数量(表9)。每个处理5个重复。

               表9光照对菌株QZ-2000产孢的影响

       自然           连续光照               12h光暗交替       完全

处理

       光照    紫外灯  黑光灯  日光灯  紫外灯   黑光灯 日光灯  黑暗

覆盖

      0.48^*H  8.0B    7.3C    3.4FG    7.9C    5.4E    2.6G

光照

                                                               0.23H

敞开

      0.53H    0       8.6A    3.9F       0     6.6D    2.8FG

光照

*表内数据为孢子数量(×10⁸/克)

注：在行、列中数据后大写字母的表示有极显著差异和显著差异(P＝0.01)

表9的试验结果显示，固体培养的后期光照可以极大促进产孢，连续光照对产孢的增效大于12h光暗交替，而三种光照方式进行比较，又以黑管灯光照对产孢的促进作用最为明显。最大产孢量8.6×10⁸个/克出现在固体培养基敞开黑光灯连续光照的小组中。

实施例4  百日草链格孢菌株利用真菌分生孢子杀死杂草，生产的具体实施方式如下：百日草链格孢菌株(公知公用，强胜、郭爱民、Bruce A.Auld等，大批量生产百日草链孢菌孢子的技术，1997.中国生物防治13(4)：169-172)在PDA培养基上培养7天，接种到玉米粉黄豆粉蔗糖碳酸钙液体培养基中培养3～4天，菌体开始沉积黑色色素时，将菌体取出过滤，并用无菌水洗去菌体代谢产物及剩余营养物，用粉碎机将菌丝体粉碎。固体培养基以麦麸或米糠干重∶锯末屑干重＝1∶7称取，再按干料重量∶水的重量＝1∶2.0的比例加水拌匀。将菌丝体悬浮液接种于固体培养基上，随即置于20W黑光灯(波长365nm)下40cm处进行12小时循环光照，室温条件下诱导产孢，在自制的培养箱中好气培养3-8天。每克干物质生产的孢子量最大值达到3.11×10⁷个/克，较纯固体发酵产孢量至少多出5倍，且固体发酵时间缩短2-7d。

上述实施方法中的光照启始时间以及液体培养基中氮含量对百日草链格孢菌产孢量的试验及结果如下：

用每升含玉米粉17g、豆粉1g、CaCO₃3g的液体发酵培养基进行菌丝体发酵所得菌丝体经过滤、洗涤、粉碎等处理后，接种在以麦麸干重∶锯末屑干重＝1∶7，再按干料重量∶水的重量＝1∶2.0的比例加水拌匀的固体培养基上。分4组，每组的3个平皿，分别经0、3、6、9小时黑暗后用黑光灯诱导产孢。

表10近紫外光照射的启始时间对百日草链格孢菌产孢量(10⁷/g^*)的影响

 启始时间       0        3        6        9

平均产孢量    3.11a    2.73b    2.43c    2.27c

注：数据后跟不同字母的为差异显著(p＜0.05)。

表10结果显示，菌丝体悬浮液接种到固体培养基上后随即采用20W黑光灯(波长365nm)下40cm处进行12小时循环光照的孢子产量较分别间隔3、6和9个小时再施加光照的孢子产量显著增加，并且间隔时间越短，产孢量越大。

液体培养基中氮含量对固体培养基百日草链格孢菌产孢量的影响：在液体培养基中，豆粉所含氮量占培养基中氮含量的绝大部分，豆粉的含量可近似看作与培养基中氮含量成正比。在保持培养基干物质总量不变，即玉米粉加豆粉为15g/L，CaCO₃含量为3g/L的情况下，分别将豆粉的含量变为0(多加玉米粉3g/L)、3、6、9g/L4种含量。接种按实例配制的固体培养基上产孢，最后比较每克干物质的产孢量。

    表11不同豆粉含量培养基的百日草链格孢菌孢子产量(10⁶/g^*)

培养基中豆粉含量      0g/L           3g/L          6g/L          9g/L

   平均产孢量    22.12±1.034a  17.08±1.560b  16.12±0.225b  5.36±0.149c

注：^*为每克干物质，数据后跟不同字母的为差异显著(p＜0.05)。

表11结果表明，液体培养基豆粉含量增大，即氮含量增大，固体培养基的产孢量显著下降。因此，为增大固体培养基的产孢量，在配制液体培养基时要控制其中的氮含量。

采用本发明上述方法培养其他生物除草剂如利用炭疽菌、链格孢等真菌能够达到同样的效果，是本领域技术人员所熟悉的。

Claims (5)

1、一种大批量生产生物除草剂的方法，其特征在于，采用液体-固体联合发酵的方法，其具体工艺流程如下：

将生物除草剂真菌菌株接种到PDA培养基上培养生长，在15-30℃条件下，培养5-7d，获得一级种菌后；

切取一级种菌培养物小块，接种到液体培养基中，15-35℃振荡发酵培养3-10d，振摇速度为20-180转/min，待菌丝团长满后，获得二级液体种菌，即菌体悬浮液；

固体培养基由麦麸或米糠和其它一种、两种或三种农副产品组成，麦麸或米糠干重∶其它组分干重＝1∶0.1-9，按比例称取固体培养基干料后，加入干料重的0.3-3.0倍水，拌匀灭菌；

在无菌环境下将菌体悬浮液接种到灭过菌的固体培养基上，好气培养，温度15-35℃，无菌条件下固体发酵生产3-8d，获得大批量的生物除草剂。

2、根据权利要求1所述的一种大批量生产生物除草剂的方法，其特征在于，二级液体种菌最好用粉碎机粉碎获得菌体悬浮液。

3、根据权利要求1或2所述的一种大批量生产生物除草剂的方法，其特征在于，上述固体培养的条件最好增加20W波长365nm黑光灯、日光灯或紫外光灯间隙照射。

4、根据权利要求1或2所述的一种大批量生产生物除草剂的方法，其特征在于，上述液体培养基和固体培养基的农副产品原料为工业下脚料的农副基础产品，包括黄豆粉、麦麸、米糠、酿造酵母(酒酿渣)、亚麻子饼粉、玉米粉、蔗糖、葡萄糖、豆渣、豆粕、豆饼粉、玉米淀粉、豆饼粉、甘薯粉、花生粉、棉子饼、花生壳、玉米蛋白及多种鱼粉等多种农副产品，以及多种树木的锯末屑。

5、根据权利要求3所述的一种大批量生产生物除草剂的方法，其特征在于，上述液体培养基和固体培养基的农副产品原料为工业下脚料的农副基础产品，包括黄豆粉、麦麸、米糠、酿造酵母(酒酿渣)、亚麻子饼粉、玉米粉、蔗糖、葡萄糖、豆渣、豆粕、豆饼粉、玉米淀粉、豆饼粉、甘薯粉、花生粉、棉子饼、花生壳、玉米蛋白及多种鱼粉等多种农副产品，以及多种树木的锯末屑。