CN109355227B - 一株高温紫链霉菌及其在纤维素降解中的应用 - Google Patents

一株高温紫链霉菌及其在纤维素降解中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一株保藏号为CGMCC NO：16559的高温紫链霉菌及其纤维素降解中的应用，该菌株属于高温放线菌，可在55℃培养条件下快速生长，可在24‑48 h内富集大量菌落，培养及保存较简单且具有稳定良好的纤维素降解功能，其对滤纸降解率可达91.60%±0.020，对秸秆的降解率可达62.30%±0.023；该菌株CMC酶活力在5d时酶活力最大，为35.487U/mL，Fpase酶活力在7d时最大，为62.383U/mL；该菌株可在促进堆肥腐熟，尤其是缩短高温期，从而减少堆肥腐熟周期中发挥重要作用，同时利于工业化高温处理固体纤维素废弃物降解及处理，对农作物废弃物资源实现变废为宝发挥重要作用，同时也大大有利于生态环境的保护和优化，因此具有良好的资源与环境的应用价值和市场潜力。

Description

一株高温紫链霉菌及其在纤维素降解中的应用
技术领域
本发明涉及农业资源与环境微生物领域，特别是一株高温紫链霉菌St-GW2及其在纤维素降解中的应用。
背景技术
随着现代社会经济的发展，能源危机以及环境问题越来越严重，秸秆、生活垃圾等大量的固体废弃物堆积造成环境压力负荷过重，能对纤维素生物质进行解决和利用，特别是将农作物废弃物如秸秆、稻草、谷壳等资源生产乙醇或高级生物燃料则能实现变废为宝，是解决未来能源和环境问题的途径之一，具有重要的意义。在纤维素降解过程中，首先需要将植物生物质尤其是植物细胞壁成分中的纤维素多糖有效的降解、释放为可被微生物利用的单糖或寡糖，再经体内代谢途径转化为乙醇、高级燃料，而选择微生物对木质纤维素进行降解，已成为近年来纤维素降解和利用的重要手段和研究热点。
目前，在降解木质纤维素的微生物中，霉菌的降解能力较细菌强，但这类菌株生长缓慢、热稳定性较差、不耐碱性等缺点。细菌来源广、生长快，纤维素降解效果较好，但最新研究表明，相比真菌及细菌，放线菌纤维素降解酶由于具有耐高温、耐PH、耐金属离子等特性，而秸秆等固体废弃物降解以及堆肥样品腐熟过程中均需要经过高温期（约55-60℃），耐高温的菌株可在高温期发挥重要作用，促使纤维素秸秆类或固体废弃物的充分腐熟或降解，大大缩短降解周期，因而具有更广阔的应用前景。目前已报道的具有纤维素降解功能的放线菌主要包括诺卡氏菌属、链霉菌属、高温放线菌属、小单胞菌属、嗜热子囊菌属等，但这些菌株均存在生长速度慢，生物量较小及降解能力较弱的问题，不宜大规模工业应用。
高温紫链霉菌（Streptomyces thermoviolaceus）是一种耗氧的革兰氏阳性菌，现有报道中该菌株可作为抗生素佐剂链霉唑林的新来源以及几丁质酶基因的分子克隆，但对于高温紫链霉菌属在纤维素降解中应用的研究还未见报道。
发明内容
针对上述问题，本申请提供一株高温紫链霉菌（Streptomyces thermoviolaceus），该菌株生长迅速且功能稳定，可在高温环境中对纤维素和秸秆类物质进行有效降解， 为实现这一发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本申请首先提供了一株高温紫链霉菌（Streptomyces thermoviolaceus），其保藏编号为CGMCC NO：16559；该菌株可在纤维素钠为唯一碳源CMC平板上生长，且经刚果红染色后菌落周围出现明显的纤维素分解透明圈；该菌株生长迅速，繁殖时间短，过夜培养即可在改良CMC或NB固体平板上形成质地致密的淡黄色圆形菌落，干燥、不透明、难以挑取；在48 h即可在滤纸条上富集有大量黄色菌落并开始启动崩解，且降解能力突出，7-10 d可使滤纸降解为糊状。
本发明同时还提供了保藏编号为CGMCC NO：16559的高温紫链霉菌在纤维素降解中的应用，特别是在降解秸秆中的应用。
进一步，本发明所述在纤维素降解中的应用是指：将纤维素加入降解培养基中，121℃高压灭菌20min；然后接种高温紫链霉菌液（含菌量为1×106CFU/mL），于55℃、150rpm摇床培养，即可实现对纤维素的降解；所述高温紫链霉菌液是这样获得的：将保藏编号为CGMCC NO：16559的高温紫链霉菌单菌落接种于改良CMC液体培养基中过夜培养，即获得菌液；所述纤维素优选滤纸或秸秆。
NB液体培养基：营养肉汤粉（青岛高科技工业园海博生物技术有限公司，编号：HB0108） 18.0g，蒸馏水1000 mL，PH自然；121℃灭菌待用。
NB固体培养基：营养肉汤粉18.0g，琼脂 15.0g，蒸馏水1000 mL，PH自然；121℃灭菌后冷却至60℃倒平板待用。
改良CMC培养基： CMC-Na 15.0 g，KH2PO4 1.0 g，(NH4)3P04 1.0 g，MgSO4·7H2O0.5 g，酵母提取物 1.0 g，蒸馏水1000 mL，PH自然；121℃灭菌待用。
降解培养基：KH2PO4 2 g，(NH4)3PO4 1.4 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，CaCl2 0.3 g，酵母提取物 1.0 g，FeSO4·7H2O 5 mg，MnSO41.6 mg，ZnCl2 1.7 mg，CoCl2 1.7 mg，蒸馏水1000mL，pH 自然；121℃灭菌待用。
进一步，本发明所述在纤维素降解中的应用是指：将滤纸加入降解培养基，121℃灭菌20min；然后接种1mL含菌量为1×106CFU/mL的高温紫链霉菌液， 55℃、150rpm 摇床培养，即可实现对滤纸的降解；或者将稻草秸秆加入降解培养基，121℃灭菌20min；然后接种1mL含菌量为1×106CFU/mL的高温紫链霉菌液，55℃、150rpm 摇床培养，即可实现对稻草秸秆的降解。
申请人在研究中，从中药渣堆肥中筛选获得一株菌株，分子生物学鉴定该菌株与链霉菌属高温紫链霉菌亚种阿彭格斯DSM41392 (T) (Streptomycesthermoviolaceussub sp. Apingens DSM 41392(T))亲缘关系最近，序列相似性为99.85%，属于高温紫链霉菌（Streptomyces thermoviolaceus），申请人将其自命名为St-GW2。该菌株属于高温放线菌，可在55℃培养条件下快速生长，可在24-48 h内富集大量菌落，培养及保存较简单且具有稳定良好的纤维素降解功能，特别是对秸秆有效进行降解。
在试管滤纸条实验中，菌株St-GW2在48 h时有大量黄色菌落富集于滤纸条上，并开始启动崩解。6 d时滤纸条明显溃烂，8 d 左右将其崩解成为浆糊状。经检测，菌株St-GW2在10 d可将 0.2 g滤纸基本降解完毕，对滤纸降解率可91.60 %±0.020；在14 d可将0.5 g稻草的大部分降解为粉末，对秸秆的降解率可达62.30%±0.023；对菌株St-GW2进行CMC与Fpase 酶活力测定，该菌株CMC酶活力在5 d时酶活力最大，为35.487 U/mL， Fpase 酶活力在7 d时最大，为62.383 U/mL。该高温紫链霉菌可在促进堆肥腐熟，尤其是缩短高温期（约55-60℃），从而减少堆肥腐熟周期中发挥重要作用，同时利于工业化高温处理固体（约50-140℃）纤维素废弃物（如稻草秸秆、小麦秸秆、玉米秸秆等）降解及处理，对农作物废弃物资源实现变废为宝发挥重要作用，同时也大大有利于生态环境的保护和优化，因此具有良好的资源与环境的应用价值和市场潜力。
附图说明
图1为菌株St-GW2在改良CMC固体培养后进行刚果红染色照片。
图2为菌株St-GW2在NB固体培养基上生长及形成的菌落照片。
图3为菌株St-GW216srRNA序列测定后MEGA7.0分子进化树分析示意图。
图4为高温紫链霉菌St-GW2纤维素酶活力测定结果示意图。
图5 为菌株St-GW2在试管滤纸条培养基中菌落富集、启动崩解及滤纸崩解为糊状的过程示意图。
图6为高温紫链霉菌St-GW2在50 mL摇瓶培养中对滤纸的降解情况示意图。
图7为高温紫链霉菌St-GW2在50 mL摇瓶培养中对稻草秸秆的降解情况示意图。
具体实施方式
实施例中所涉及的培养基：
改良CMC液体培养基：CMC-Na 15.0 g，KH2PO4 1.0 g，(NH4)3P04 1.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，酵母提取物 1.0 g，蒸馏水1000 mL，PH自然；121℃灭菌待用。
改良CMC固体培养基：CMC-Na 15.0 g，KH2PO4 1.0 g，(NH4)3P04 1.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，酵母提取物 1.0 g，蒸馏水1000 mL，琼脂 15.0g，PH自然；121℃灭菌待用。
产酶发酵培养基：CMC-Na 10g，KH2PO4 2 g，(NH4)3PO4 1.4 g，Mg-SO4·7H2O 0.3g，CaCl2 0.3 g，酵母提取物 1.0 g ，FeSO4·7H2O 5 mg，MnSO41.6 mg，ZnCl2 1.7 mg，CoCl21.7 mg，蒸馏水 1000 mL，pH 自然；121℃灭菌待用。
降解培养基：KH2PO4 2 g，(NH4)3PO4 1.4 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，CaCl2 0.3 g，酵母提取物 1.0 g，FeSO4·7H2O 5 mg，MnSO41.6 mg，ZnCl2 1.7 mg，CoCl2 1.7 mg，蒸馏水 1000mL，pH 自然；121℃灭菌待用。
改良试管滤纸条培养基：向直径 1.5 cm、长 15 cm 试管中加入降解培养基5 mL，加 1 条6cm×1cm滤纸条直立于试管中，121℃ 20 min灭菌待用；
改良摇瓶滤纸培养基：向锥形瓶中加入50 mL降解培养基，同时在其中加入0.2 g滤纸，121℃ 20 min灭菌待用。
摇瓶稻草秸秆培养基：向锥形瓶中加入50 mL降解培养基，同时在其中加入0.5g稻草秸秆，121 ℃ 灭菌待用。
实施例中的滤纸为Whatman新华双圈定量滤纸(直径11cm)，购自于通用电气生物科技（杭州）有限公司，其主要成分为纤维素，灰分为0.01%，自行裁剪为统一规格为（6 cm×1 cm）的滤纸条。
实施例1 高温紫链霉菌St-GW2菌株改良CMC固体培养及刚果红染色实验
针对不同采样时期的中药渣堆肥样品（来源于江苏省连云港市东海县中药渣堆肥），取5g 加入50 mL 灭菌超纯水中混匀，55 ℃ 150 rpm 离心30 min，取1mL悬浊液依次梯度稀释，稀释后的悬液取100 µl 涂布于改良CMC固体培养基， 55℃培养箱中培养3 d，将改良CMC固体培养基上的菌落进行划线纯化，纯化后的单菌株在改良CMC固体培养基上过夜培养后进行刚果红染色，1 mol/L NaCl冲洗后，在平板上有透明圈出现的为可能的高温纤维素降解菌。
申请人筛选到一株出现明显的纤维素降解透明圈的菌株，其在改良CMC固体培养基上刚果红染色如图1所示，其在NB固体培养基上生长及产生的菌落如图2所示。
申请人将该菌株自命名为St-GW2。分子生物学鉴定该菌株与链霉菌属高温紫链霉菌亚种阿彭格斯DSM41392 (T) (Streptomycesthermoviolaceus subsp. Apingens DSM41392(T))亲缘关系最近，序列相似性为99.85%，属于高温紫链霉菌（Streptomyces thermoviolaceus），其MEGA7.0分子进化树分析如图3所示。
申请人于2018年10月10日将该菌株保藏于中国普通微生物保藏管理中心(CGMCC), 地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所，邮编100101；保藏编号CGMCC NO：16559。
实施例2 高温紫链霉菌St-GW2菌株纤维素酶活力测定
为测定菌株的酶活力变化曲线，将高温紫链霉菌St-GW2接种至产酶发酵培养基中，55℃，150 r/min 培养14 d，并分别在1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 d时取样进行纤维素酶活力测定。
酶活力检测方法如下： CMCase测定：取0.5mL 粗酶液于容量瓶中，加入1.5mL含0.5%CMC-Na 的0.5mol/L、pＨ5.0的柠檬酸缓冲液，于50℃水浴锅中准确作用30min，再加入1.5mL 3,5－二硝基水杨酸（DNS）溶液，沸水浴5min后立即用流水冷却。测其在540nm处的OD值，并通过萄萄糖标准曲线求葡萄糖含量。空白对照为于100℃水浴锅中灭活10min的粗酶液。
FPase测定；将新华1号滤纸条（1cmｘ6cm）折成M型，放入盛有1.5mL （0.05mol/L,PH5.0）HAC-NaAC缓冲液的试管底部，加入0.5mL粗酶液后充分摇勾，使落液完全浸泡滤纸。于50℃水浴锅中准确作用60min，按DNS法测还原糖。
上述酶活定义：每min每mL酶液催化底物水解生成１µg葡萄糖的酶量，为1个酶活为单位U。
上述检测方法也可参见文献“纤维素降解细菌的筛选及其酶活测定，蒋明星等，中国农学通报，2015，31（36）：161-164”中公开的方法。
高温紫链霉菌St-GW2酶活力检测结果如图4所示，该菌株的CMC酶活力在5 d时达到最高值，为35.487 U/mL，而Fpase 酶活力在7 d时最大，为62.383 U/mL。
实施例3 高温紫链霉菌St-GW2菌株对滤纸纤维素降解能力
1、试管滤纸条降解
将实施例1筛选获得的高温紫链霉菌St-GW2单菌落接种于改良试管滤纸条培养基中，并以不加菌落的滤纸条作为对照（K），与初筛温度相同条件培养，观察滤纸条的溃烂情况。
菌株St-GW2在试管滤纸条培养基中菌落富集、启动崩解及滤纸崩解为糊状的过程示意图如图5所示，图5中，A、B、C依次为培养48h、4d、8d的试管图片，可见，在第48h时，菌落大量富集并启动崩解（图5A）；第4d时，滤纸条已经溃烂分解为数段（图5B）；第8d时，滤纸已经基本为糊状（图5C）；而对照组（K）滤纸条一直无明显变化。可见，菌株St-GW2在改良试管滤纸条培养基中表现了优秀的滤纸条崩解能力。
2、摇瓶滤纸的降解
将高温紫链霉菌St-GW2单菌落接种于改良CMC液体培养基中，55 ℃ 150 rpm摇床中过夜培养后；次日转接1 mL菌液(菌含量约1×106 CFU/mL)于50 mL 改良摇瓶滤纸培养基中，并以不加菌液的滤纸条作为对照（K）；降解10d后附图6所示。
图6中，A、B为同一对照组/St-GW2组不同角度的图片，可见，St-GW2菌株在55 ℃改良滤纸培养基中培养10 d后，0.2 g滤纸已经基本降解完毕，只在瓶底有少量滤纸碎屑存在，摇瓶中液体变为淡黄色悬浊液，而对照组滤纸片完整无破损。
将图6中St-GW2组摇瓶中的滤纸降解物过20目及60目网纱，过滤后的网纱在55℃的烘箱中进行烘干24 h，烘干后的样品用万分之一天平进行称量。根据降解物的质量计算其降解率，降解率=（滤纸初始质量-（烘干后20目网纱上滤纸过滤物的质量）/滤纸初始质量+烘干后60目网纱滤纸过滤物的质量/滤纸初始质量）；经过网纱过滤后烘干称重，计算得该菌对滤纸降解率为91.60 % ± 0.020。
实施例4 高温紫链霉菌 St-GW2菌株对稻草的降解能力
本实施例进一步验证高温紫链霉菌St-GW2对稻草秸秆的降解功能。
将该高温紫链霉菌 St-GW2单菌落接种于改良CMC液体培养基中，55℃ 150 rpm摇床中过夜培养后，转接1 mL菌液于50 mL 摇瓶稻草秸秆培养基中，并以不加菌液的滤纸条作为对照（K）,图7为培养后14d后对照组与St-GW2摇瓶图片，图7中，A、B为同一对照组/St-GW2组不同角度的图片。由图7可见，St-GW2菌株在55℃ 摇瓶稻草秸秆培养基中培养14 d后，0.5 g稻草已大部分降解完毕，瓶底存在很多稻草粉末，长杆状的稻草少见，而对照组稻草基本无变化。经过20目及60目网纱过滤后烘干称重，计算得该菌对稻草降解率为62.30 %± 0.023。

Claims (3)

1.一株高温紫链霉菌（Streptomyces thermoviolaceus），其保藏编号为CGMCC NO：16559。
2.如权利要求1所述高温紫链霉菌在降解纤维素中的应用，其特征在于，将纤维素加入降解培养基，灭菌后接种高温紫链霉菌液，于55℃、150rpm 摇床培养，即可实现对纤维的降解；
所述降解培养基配方如下：KH2PO4 2 g，(NH4)3PO4 1.4 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，CaCl20.3 g，酵母提取物 1.0 g，FeSO4·7H2O 5 mg，MnSO41.6 mg，ZnCl2 1.7 mg，CoCl2 1.7 mg，蒸馏水 1000 mL，pH 自然；121℃灭菌待用；
所述高温紫链霉菌液为这样获得：将保藏编号为CGMCC NO：16559的高温紫链霉菌单菌落接种于改良CMC液体培养基中过夜培养，即获得高温紫链霉菌液；
所述改良CMC培养基配方如下：CMC-Na 15.0 g，KH2PO4 1.0 g，(NH4)3P04 1.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，酵母提取物 1.0 g，蒸馏水1000 mL，PH自然；121℃灭菌待用；
所述纤维素包括滤纸或秸秆中的至少一种。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述高温紫链霉菌液的含菌量为1×106CFU/mL 。
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CN105567608A (zh) * 2016-03-03 2016-05-11 北京林业大学 一株耐高温园林废弃物分解菌st1及其应用

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