CN113174337A - 嗜热降解纤维素的烟曲霉及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株嗜热降解纤维素的烟曲霉及其应用，该菌株命名为烟曲霉(Aspergillus fumigatus)XWS‑F1，保藏编号为CCTCC NO:M 2020569。本发明的嗜热烟曲霉可以在以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的条件下生长并产生纤维素酶，该菌产生的纤维素酶在高温条件下能保持较高的活性，具有高温纤维素酶的特点。该菌株具有稳定的纤维素降解功能，能较快的适应高温堆肥环境，快速降解纤维素等难以降解有机物，加快堆肥腐熟进程，从而在减少堆肥腐熟周期中发挥重要作用，有利于生态环境的保护和优化，具有良好的资源与环境的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一株嗜热降解纤维素的烟曲霉及其应用。
背景技术
我国是农业大国，每年有大量的农业废弃物产出，如小麦、水稻、玉米等农作物秸秆。这些秸秆主要含有纤维素，由于纤维素分子量较大而不能被植物直接利用。利用纤维素降解菌处理废弃秸秆，具有环保、节能、高效等特点，且符合可持续发展的要求。因此，从环境中筛选一些纤维素降解菌、将这些资源合理利用起来，将是我国可持续发展战略中的一个重要部分。
纤维素酶是一类可降解纤维素、木质纤维素的复合酶，主要由外切β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和内切β-葡聚糖酶等组成。纤维素酶能够高效与纤维素分子结合，破坏纤维素分子内部的化学键，将纤维素分子分解成可被动物利用的小分子糖类物质。并且在酶促反应过程中，不会产生毒害物质以及造成环境污染。微生物纤维素酶可能会是解决纤维素资源利用问题最环保的好办法。纤维素酶主要来源于细菌、放线菌、真菌及原生动物的分泌。目前，纤维素酶广泛应用于食品、纺织、酿酒和饲料加工等需要高温加工的领域，因此纤维素酶对温度的耐受程度极大地限制了纤维素酶的应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一株产纤维素酶的嗜热烟曲霉及其应用，该菌株可在高温下生长并产生纤维素酶。
为解决上述技术问题，本发明提供一株嗜热降解纤维素的烟曲霉，分类命名为烟曲霉(Aspergillus funigatus) XWS-F1，已于2020年10月5日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：武汉，武汉大学保藏中心，邮编：430072)，其保藏编号为CCTCC NO: M 2020569。烟曲霉(Aspergillus fumigatus) XWS-F1简称烟曲霉XWS-F1。
嗜热真菌(Thermophilic fungi)是指最低生长温度范围在20℃或20℃以上，最高生长温度为50℃或50℃以上大的一类特殊真菌。嗜热真菌在一定条件下可产出纤维素酶，这类酶耐高温、酶活力强，在高温发酵工业中有特殊优势。因此，来自特殊高温环境的嗜热真菌已成为筛选高效纤维素的高温纤维素酶的一个主要来源。
堆肥化过程是在微生物的作用下，将原料中较难分解的大分子物质分解为可被微生物利用的碳源。因此，加速堆肥过程中纤维素的分解是提升堆肥效率、缩短堆肥周期和提高腐殖化的关键问题之一。研究表明，堆肥高温阶段(>55℃)是木质素、纤维素和半纤维素等分子破坏、断裂和分解、病原菌灭活的重要阶段之一。因此，接种高温纤维素分解菌，可以有效缩短堆肥时间，提升效率。
本发明提供的菌株可在羧甲基纤维素钠为唯一碳源CMC平板上生长，生长温度范围为40-60℃，生长pH范围为6.0-8.0，在羧甲基纤维素钠固体培养基上培养3d后，其菌落特征为：呈落绒状或带絮状物，铺展，幼年翠绿色，成熟时变成深绿色至深褐色，表面光滑。经过刚果红染色后菌落周围出现明显的透明圈；该菌在48h即可在滤纸条上富集形成菌落并使得滤纸边缘发黄断裂，4-6d可使滤纸崩解为糊状。
本发明提供的菌株CMC酶活力在第 5d 为130.27U/mL，而Fpase酶活力在第 5d 时为20.01U/mL。
本发明还提供上述的嗜热降解纤维素的烟曲霉在制备纤维素酶中的应用。
本发明还提供一种制备纤维素酶的方法，包括：发酵上述的烟曲霉，收集发酵产物，得到纤维素酶。
优选地，所述发酵的条件如下：40-60℃、100-300r/min震荡培养4-10天。
优选地，所述发酵的条件如下：50℃、130r/min震荡培养5-6天。
优选地，在收集发酵产物后还包括如下步骤：离心所述发酵产物，收集上清液，即为含有所述纤维素酶的溶液。
本发明还提供上述方法制备得到的纤维素酶。
本发明还提供上述的嗜热降解纤维素的烟曲霉的筛选方法，其特征在于，包括：
从秸秆堆腐的土壤中称取样品，加入纤维素降解菌筛选液体培养基进行富集，在40-60℃、120-130r/min恒温摇床中培养3-9天；
吸取上述所得的培养物加入新的纤维素降解菌筛选液体培养基进行传代3-6次；
取传代后所得的培养物在刚果红平板上划线分离，得到嗜热降解纤维素的烟曲霉。
优选地，所述纤维素降解菌筛选培养基成分为：每1L去离子水中含有羧甲基纤维素钠3.0-5.0 g，磷酸二氢钾0.8-1.0 g，硫酸镁0.1-0.3g，氯化钠0.1-0.2g，氯化钙0.1-0.2g，三氯化铁0.01-0.03 g，硝酸钠2.0-2.5 g，1％孟加拉红水溶液2.0-3.3 mL，1％链霉素溶液0.03-0.05 mL，pH7-7.2。
优选地，所述刚果红固体培养基成分为：每1L去离子水中含有羧甲基纤维素钠3.0-5.0 g，硫酸铵1.0-1.2 g，磷酸二氢钾0.5-1.0 g，硫酸镁0.3-0.5 g，氯化钠0.1-0.3g，氯化钙0.1-0.3 g，硫酸锰2.0-2.5 mg，硫酸亚铁6.0-7.5 mg，刚果红0.2-0.4g，琼脂15-20 g，pH6.0-7.0。
本发明所达到的有益效果： 本发明的嗜热烟曲霉可以在以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的条件下生长并产生纤维素酶，该菌产生的纤维素酶在高温条件下能保持较高的活性，能在50-60℃温度范围内生长，具有高温纤维素酶的特点。该菌株具有稳定的纤维素降解功能，能较快的适应高温堆肥环境，快速降解纤维素等难以降解有机物，加快堆肥腐熟进程，从而在减少堆肥腐熟周期中发挥重要作用，有利于生态环境的保护和优化，具有良好的资源与环境的应用价值。
附图说明
图1是烟曲霉XWS-F1在CMC固体培养后进行刚果红染色图；
图2是烟曲霉XWS-F1 在CMC固体培养基上生长及形成的菌落图；
图3是烟曲霉XWS-F1在滤纸条培养基中崩解示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
下列实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下列实施例中所用地实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1 菌株的筛选与鉴定
将10g土壤样品加入装有90mL无菌水和玻璃珠的250mL锥形瓶中震荡摇匀然后移取10mL菌悬液于灭菌的90mL富集培养基(每升富集培养基中加1%孟加拉红水溶液3.3mL一起灭菌，临用时每100mL加1%链霉素溶液0.3mL)锥形瓶中，50℃，130rpm培养3d，传代富集3次。
上述富集培养基成分为：羧甲基纤维素钠3.0-5.0 g，磷酸二氢钾(KH2PO4) 0.8-1.0 g，硫酸镁(MgSO4) 0.1-0.3g，氯化钠0.1-0.2g，氯化钙0.1-0.2 g，三氯化铁0.01-0.03g，硝酸钠2.0-2.5 g，1％孟加拉红水溶液2.0-3.3 mL，1％链霉素溶液0.03-0.05 mL，pH7-7.2，去离子水1000mL，pH7.0-7.2；121℃灭菌待用。
将上述培养基以梯度稀释法制成10-3，10-5，10-7的稀释度，取0.1 mL涂布于初筛羧甲基纤维素筛选培养基，50℃倒置培养1-3d，待长出单菌落后，记录直径d和透明圈直径D，计算H=D/d值，其在CMC固体培养基上生长的情况如图1所示。将生长良好的单菌落于筛选培养基上划线分离纯化，形成的菌落情况如图2所示。
菌株在固体培养基的菌落特征为：呈落绒状或带絮状物，铺展，幼年翠绿色，成熟时变成深绿色至深褐色，表面光滑。
经鉴定该菌株属于烟曲霉(Aspergillus fumigatus)。
上述刚果红固体培养基成分为：每1L去离子水中含有羧甲基纤维素钠3.0-5.0 g，硫酸铵1.0-1.2 g，磷酸二氢钾(KH2PO4) 0.5-1.0 g，硫酸镁(MgSO4) 0.3-0.5 g，氯化钠0.1-0.3 g，氯化钙0.1-0.3 g，硫酸锰2.0-2.5 mg，硫酸亚铁6.0-7.5 mg，刚果红0.2-0.4g，琼脂15-20 g，pH6.0-7.0。
将初筛得到的菌株接种于滤纸崩解培养基中，50℃，摇床培养，以未添加菌的滤纸条崩解培养基作为对照，观察并记录滤纸崩解情况，未添加菌的滤纸降解率<0.3％，添加菌的滤纸降解率达85％以上，具体崩解情况如图3(其中图3(A)为未添加菌的滤纸崩解培养基，(B)为添加菌的滤纸培养基)。
上述滤纸条崩解培养基成分为:1cm×7cm滤纸条、磷酸二氢钾(KH2PO4) 0.5-1.0g，硫酸镁(MgSO4) 0.3-0.5 g，氯化钠0.1-0.3 g，氯化钙0.1-0.3 g，三氯化铁0.01-0.03g，硝酸钠2.0-2.5 g，pH7.0-7.2；121℃灭菌待用。
实施例2 菌株的纤维素酶活测定
为测定菌株的酶活力变化曲线，将烟曲霉XWS-F1接种至产酶发酵培养基中，50℃，130 rpm培养5 d后，取发酵液经4000r/min离心10min，取上清液即为待测粗酶液，用DNS法测定菌株的纤维素酶活。
上述酶活定义：每分钟1毫升酶液催化底物水解生成1 μg葡萄糖酶量，为1个酶活为单位U。
烟曲霉XWS-F1菌株CMC酶活力在5d时为130.27U/mL，而Fpase酶活力在5d时为20.01U/mL。
上述液体发酵产酶培养基成分为：羧甲基纤维素钠3.0-5.0 g，磷酸二氢钾(KH2PO4) 4.0-5.0 g，硫酸镁(MgSO4) 0.3-0.5 g，氯化钠0.5-0.6 g，氯化钙0.1-0.3 g，酵母膏0.5-0.6 g，蛋白胨3.0-0.5 g，去离子水1000mL，pH7.0-7.2；121℃灭菌待用。
实施例3 菌株在堆肥中的应用
以醋糟作为堆肥主料，实验设计2个处理，每个处理3个重复，分别将相同质量混合均匀的堆肥材料装入堆肥装置中，处理组按照一定的菌液接种量接入，对照组加入等量培养基；单个堆体总质量为 20 kg，通风方式为每天上午 10 点和 17 点进行翻堆方式，实验周期为 30 天。
堆肥过程中接种处理组和对照组的堆肥温度变化趋势相同，与未接种菌剂的对照组相比，接种微生物菌剂的处理组在第 3d 温度达到了 50℃ ，高温持续时间为 9d，在第6d 达到最高温度 58℃，而未接种菌剂的对照组从第 4d 才达到 50℃ ，高温持续时间为8d，在第 7d 达到最高温度 55℃。接种微生物菌剂的处理组的纤维素总降解率为 48％，未接种菌剂的对照组的纤维素总降解率为 38.2％。
结果说明，在堆肥过程中接种该菌株，能够迅速升高堆肥温度、高温阶段持续时间长、纤维素降解率高。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 常州大学
<120> 嗜热降解纤维素的烟曲霉及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 569
<212> DNA
<213> 烟曲霉(Aspergillus fumigatus)
<400> 1
atatgcttaa gttcagcggg tatccctacc tgatccgagg tcaaccttag aaaaataaag 60
ttgggtgtcg gctggcgccg gccgggccta cagagcaggt gacaaagccc catacgctcg 120
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acggcgggcc cgccgaagca acaaggtacg atagacacgg gtgggaggtt ggacccagag 540
ggccctcact cggtaatgat ccttccgca 569
Claims (10)
1.嗜热降解纤维素的烟曲霉，其特征在于，分类命名为烟曲霉(Aspergillus funigatus) XWS-F1，已于2020年10月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO: M 2020569。
2.根据权利要求1所述的嗜热降解纤维素的烟曲霉在制备纤维素酶中的应用。
3.一种制备纤维素酶的方法，其特征在于，包括：发酵权利要求1所述的烟曲霉，收集发酵产物，得到纤维素酶。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵的条件如下：40-60℃、100-300r/min震荡培养4-10天。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵的条件如下：50℃、130r/min震荡培养5-6天。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在收集发酵产物后还包括如下步骤：离心所述发酵产物，收集上清液，即为含有所述纤维素酶的溶液。
7.权利要求3-6中任一所述方法制备得到的纤维素酶。
8.根据权利要求1所述的嗜热降解纤维素的烟曲霉的筛选方法，其特征在于，包括：
从秸秆堆腐的土壤中称取样品，加入纤维素降解菌筛选液体培养基进行富集，在40-60℃、120-130r/min恒温摇床中培养3-9天；
吸取上述所得的培养物加入新的纤维素降解菌筛选液体培养基进行传代3-6次；
取传代后所得的培养物在刚果红平板上划线分离，得到嗜热降解纤维素的烟曲霉。
9.根据权利要求8所述的筛选方法，其特征在于，所述纤维素降解菌筛选培养基成分为：每1L去离子水中含有羧甲基纤维素钠3.0-5.0 g，磷酸二氢钾0.8-1.0 g，硫酸镁0.1-0.3g，氯化钠0.1-0.2 g，氯化钙0.1-0.2 g，三氯化铁0.01-0.03 g，硝酸钠2.0-2.5 g，1％孟加拉红水溶液2.0-3.3 mL，1％链霉素溶液0.03-0.05 mL，pH7-7.2。
10.根据权利要求8所述的筛选方法，其特征在于，所述刚果红固体培养基成分为：每1L去离子水中含有羧甲基纤维素钠3.0-5.0 g，硫酸铵1.0-1.2 g，磷酸二氢钾0.5-1.0 g，硫酸镁0.3-0.5 g，氯化钠0.1-0.3 g，氯化钙0.1-0.3 g，硫酸锰2.0-2.5 mg，硫酸亚铁6.0-7.5 mg，刚果红0.2-0.4g，琼脂15-20 g，pH6.0-7.0。
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