CN114561327A - 一种纤维素降解复合菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种纤维素降解复合菌剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种纤维素降解复合菌剂及其制备方法，所述纤维素降解复合菌剂由蕈状芽胞杆菌、粘质沙雷氏菌、谷氨酸棒杆菌、里氏木霉和烟曲霉组成；所述复合菌剂的总活菌数大于或等于3.75×108cfu/mL。本发明提供的复合菌剂可以提高以纤维素高含量有机废弃物为发酵原料有机肥的生产效率，促进秸秆和植食性动物粪便等纤维素高含量有机废弃物的资源化利用，为高品质有机肥的生产和开发农业废弃物绿色处理方式提供技术依据。

Description

一种纤维素降解复合菌剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及微生物菌剂技术领域，具体涉及一种纤维素降解复合菌剂及其制备方法和应用。
背景技术
焚烧、还田以及畜禽饲喂等传统的处理方式不仅无法使秸秆资源得到充分利用，还会带来大气污染、养分损失甚至引发畜禽疾病等一系列不良影响。秸秆具有养分丰富和结构性良好等优点，利用生物手段加以处理生产有机肥，是这种可再生有机资源切实可行的绿色处理方式。但是，秸秆的主要成分是纤维素，是一种由β-1，4-糖苷键将多个葡萄糖分子连接而成的高分子多糖类物质，结构复杂且结晶程度高，难降解。利用纤维素酶对其进行分解，转化为小分子物质以供给于微生物进行生命活动，从而提高堆肥效率和质量，是目前最为环保有效的方法。
到目前为止，利用产纤维素微生物进行纤维素酶系的生产与构建早已在食品、造纸、生物燃料及饲料生产等多个领域进行应用，但现有菌株产酶量低和适应性差等问题已成为纤维素酶规模化生产的瓶颈。因此，筛选高效产纤维素酶菌，通过科学合理的组合方式进行复合菌系的构建，是解决问题的关键。
长久以来，大多数纤维素降解菌剂都是局限于商业化非常普遍的常见微生物进行组合的，这也就限制了许多具有高效降解能力但不常选用菌种的应用。同时，在复合菌剂的实际生产中，适宜的载体可以为菌株提供稳定的保藏条件，有利于菌株活性和产酶量的提高，还能减少不良环境对微生物的危害和菌种的流失速度。因此，在诸多微生物中挑选出不存在拮抗作用，可以进行有机组合的菌株，并为其找到成本低、来源广、固定效果优的载体。将有助于秸秆堆肥化的应用与发展，为秸秆类高纤维素植物源废弃物的资源化利用和有机肥生产提供理论依据和技术支撑。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种纤维素降解复合菌剂及其制备方法。本发明提供的复合菌剂可以提高秸秆等纤维素高含量有机废弃物为发酵原料有机肥的生产效率，为高品质有机肥的生产和开发农业废弃物绿色处理方式提供技术依据。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种纤维素降解复合菌剂，包括复合菌液，所述复合菌液由蕈状芽胞杆菌(Bacillus mycoides)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、里氏木霉(Trichoderma reesei)和烟曲霉(Aspergillus fumigatus) 组成；
所述复合菌液中的总活菌数大于或等于3.75×108cfu/mL。
优选的，所述复合菌液中，蕈状芽胞杆菌(Bacillus mycoides)的活菌数为 1.55～2.11×108cfu/mL，谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的活菌数为 0.58～0.67×108cfu/mL，粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)的活菌数为0.11～0.14×108cfu/mL，里氏木霉(Trichoderma reesei)的活菌数为1.45～1.6×108cfu/mL，烟曲霉(Aspergillus fumigatus)的活菌数为0.06～0.087×108cfu/mL。
优选的，所述蕈状芽胞杆菌(Bacillus mycoides)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、里氏木霉(Trichoderma reesei)和烟曲霉 (Aspergillus fumigatus)均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，其中，蕈状芽胞杆菌的菌株编号为CICC21473，谷氨酸棒杆菌的菌株编号为CICC20182，粘质沙雷氏菌的菌株编号为CICC10355，里氏木霉的菌株编号为CICC2626，烟曲霉的菌株编号为 CICC41022。
进一步的，所述纤维素降解复合菌剂中还包括载体。
优选的，所述载体为麦麸；载体与复合菌液的添加比例为：每40ml复合菌液中添加10g载体。
本发明发现，通过将复合菌液与载体复配，能够有效的保持复合菌液中的活菌数，有利于复合菌液的保藏。
本发明经过大量实验研究构建了纤维素降解复合菌剂，本发明的复合菌剂综合利用了蕈状芽胞杆菌和粘质沙雷氏菌的高产纤维素酶和对碎末纤维素的降解作用，谷氨酸棒杆菌对于粗蛋白类物质的降解以及生产小分子氨基酸供给其他微生物代谢的作用，里氏木霉繁殖能力强、适应性好，促进纤维素降解和土传病害的防治作用，烟曲霉与里氏木霉的协同提高酶系活力、分泌半纤维素酶加速半纤维素降解的作用。各菌系的协同作用更好的促进了秸秆等高纤维农业废弃物的降解，解决了堆肥难的问题，很大程度上促进了纤维素的腐解利用。
本发明的第二方面，提供上述纤维素降解复合菌剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将蕈状芽胞杆菌(Bacillus mycoides)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、里氏木霉(Trichoderma reesei)和烟曲霉 (Aspergillus fumigatus)的种子液混合，得到复合种子液；
(2)将复合种子液接种至液体产酶培养基中，在35-36℃、初始pH 6.5-7.0的条件下培养4-5天，制备得到复合菌液。
优选的，步骤(1)中，将蕈状芽胞杆菌(Bacillus mycoides)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、里氏木霉(Trichoderma reesei)和烟曲霉(Aspergillus fumigatus)的种子液按体积比1:1:1:1:1混合，得到复合种子液。
优选的，步骤(2)中，所述液体产酶培养基的组成为：
羧甲基纤维素钠(CMC-Na)5.0g,(NH4)2SO4 1.4g,MgSO4·7H2O 0.3g,KH2PO4 2.0g,CaCl2 0.3g,FeSO4·7H2O 0.005g,MnSO4 0.0016g,ZnSO4·7H2O 0.0014g,CoCl2 0.002g,蛋白胨5g,蒸馏水1L。
进一步的，所述制备方法还包括：将复合菌液和载体混合的步骤。
本发明的第三方面，提供上述纤维素降解复合菌剂在如下(1)或(2)中的应用：
(1)降解秸秆中的纤维素；
(2)堆肥发酵。
上述应用中，采用本发明的复合菌剂制备的堆肥，其堆肥发酵参数、养分含量和植物促生效果均显著提高与改善。
本发明的第四方面，提供一种秸秆的降解方法，包括以下步骤：
(1)将植物秸秆用碱液浸泡处理，去除表面蜡质；将碱液浸泡处理后的植物秸秆剪成小段，用去离子水浸泡20-26h，干燥，再加入尿素调节C/N比为28-32，得到预处理后的原料；
(2)向步骤(1)预处理后的原料中接入纤维素降解复合菌剂，混合均匀后进行连续发酵12-35天。
优选的，步骤(1)中，所述碱液为质量浓度1％的NaOH溶液，浸泡处理30min。
本发明的有益效果：
(1)本发明提供一种高效降解纤维素的复合菌剂，该菌剂由蕈状芽胞杆菌、谷氨酸棒杆菌、粘质沙雷氏菌、里氏木霉、烟曲霉混合而成，具有促进纤维素和粗蛋白降解、提高发酵产品速效养分和发酵效率、增加堆肥无害化程度与作物促生效果等多重功能。其CMCase酶活达86.48U·mL-1，FPA酶活达73.5U·mL-1，β-Gase酶活达82.61U·mL-1。各类纤维素酶活力值明显大于各单一菌种酶活力值的简单加和，协同效果明显。本发明所述菌剂秸秆降解率显著优于其他处理，35d内降解率达69.2％。
(2)本发明所述菌剂的最佳保藏载体为麦麸，此载体保藏条件下，22d有效活菌数依旧高达3.12×108cfu/g。极大的提高了菌种的存活与保藏能力，并有效降低了载体成本，为复合菌剂的开发提供技术支持。
(3)本发明所述菌剂应用于高纤维含量的羊粪与秸秆堆肥中，在26d的发酵过程中，本发明菌剂处理堆体的理化性质变化明显优于CK和市售EM菌剂处理，堆肥产品养分含量显著提高，安全性与无害化程度明显增强，有利于促进植物生长。为纤维素高含量农业废弃物的资源化利用和优质有机肥的生产提供技术参考。
附图说明
图1：各菌株拮抗试验结果。
图2：各处理秸秆降解温度变化。
图3：各处理秸秆及其各成分降解率。
图4：不同载体有效活菌数变化。
图5：各处理堆体发酵过程温度变化。
图6：各处理堆体发酵过程含水率变化。
图7：各处理堆体发酵过程种子发芽指数变化。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
正如背景技术部分介绍的，大多数纤维素降解菌剂存在活性差、作用范围窄、菌株组成陈旧等问题，这也就限制了许多具有高效降解能力但不常选用菌种的发展与应用。纤维素的分离是多种酶系共同作用的结果，单个菌株无法同时满足纤维素降解所需酶系，从而导致降解不完全，造成环境污染与资源浪费。
基于此，本发明开发了一种高效降解纤维素的复合菌剂，包括复合菌液，由蕈状芽胞杆菌(Bacillus mycoides)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)和烟曲霉(Aspergillusfumigatus)组成，各菌种均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)。
在本发明的一个实施方案中，所述复合菌液中各组分体积分数分别为：蕈状芽胞杆菌20.0％，粘质沙雷氏菌20.0％，谷氨酸棒杆菌20.0％，里氏木霉20.0％和烟曲霉20.0％。总活菌数高于或等于3.75×108cfu/mL。
本发明微生物菌剂中含有的全部菌种均为CICC购买所得。经过拮抗、酶活测定和秸秆降解试验确保各菌株可联合使用并得到最优组合，接着将多种载体运用于复合菌剂保藏，通过活菌数变化挑选出最优载体并确定添加比例。最后，将复合菌剂进行纤维素高含量农业废弃物堆肥验证性试验，检测其发酵效果。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。其中：
蕈状芽胞杆菌(Bacillus mycoides)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、里氏木霉(Trichoderma reesei)和烟曲霉 (Aspergillus fumigatus)均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，其中，蕈状芽胞杆菌的菌株编号为CICC21473，谷氨酸棒杆菌的菌株编号为CICC20182，粘质沙雷氏菌的菌株编号为CICC10355，里氏木霉的菌株编号为CICC2626，烟曲霉的菌株编号为CICC41022。
CMC-Na固体培养基：CMC-Na 15.0g，NH4NO3 1.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO4 1.0g，NaCl 1.0g，蛋白胨1.0g，酵母浸粉1.0g，琼脂20g，蒸馏水1L，pH中性。
牛肉膏蛋白胨液体培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000ml；pH 7.4-7.6。
马铃薯(PDA)液体培养基：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000ml；pH自然。
液体生长培养基：CMC-Na 15.0g，NH4NO3 1.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO4 2.0 g，NaCl 1.0g，蛋白胨5g，酵母浸粉1.0g，蒸馏水1L；pH中性。
液体产酶培养基：CMC-Na 5.0g，(NH4)2SO4 1.4g，MgSO4·7H2O 0.3g，KH2PO4 2.0g，CaCl2 0.3g，FeSO4·7H2O 0.005g，MnSO4 0.0016g，ZnSO4·7H2O 0.0014g，CoCl2 0.002g，蛋白胨5g，蒸馏水1L；pH中性。
实施例1：复合菌剂的构建
菌株拮抗试验：将传代培养稳定的5株菌株蕈状芽胞杆菌(Bacillus mycoides)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、里氏木霉 (Trichoderma reesei)和烟曲霉(Aspergillus fumigatus)在CMC-Na固体培养基进行两两交叉划线，待菌株长成条带状时，观察不同菌株交叉处是否出现抑菌圈，以检测各菌株之间能否用于复合菌系的构建。结果见图1(图中自左至右依次为两株菌、三株菌、四株菌和五株菌的交叉划线结果)。各菌株交叉处均生长良好，无拮抗作用，可以进行组合复配。
复合菌系酶活测定：将上述5株无拮抗作用菌株的种子液按等体积比进行不同菌株的随机组合(组合I-组合IV)，取5％(体积分数)接种于液体产酶培养基中，30℃， 120r/min摇床培养3d，取培养液离心(5000r/min、10min)处理作为粗酶液，测定粗酶液中酶活力。由于产酶时间不同，酶活力存在较大差异，以24h为单位，连续测定各单菌株和组合7d的酶活力，并以最大酶活力值作为最终结果。
酶活测定方法：以还原糖为检测指标，采用DNS法进行测定。取1.5mL不同底物标准溶液，加入0.5mL稀释后的粗酶液，空白试管内加入煮沸灭活的粗酶液。充分摇匀后各试管加入1.5mL DNS试剂(3，5-二硝基水杨酸试剂)，沸水浴10min后快速冷却至室温以终止反应，并分别加入10mL蒸馏水摇匀静置，在540nm波长下空白调零测定吸光度，根据标准曲线计算得葡萄糖含量，进而转化为酶活力。在上述条件下1mL酶液每分钟催化底物水解生成1μg葡萄糖所需要的纤维素酶量为一个单位酶活。羧甲基纤维素酶活(CMCase)测定底物为1％CMC-Na，滤纸酶活(FPA)测定底物为无淀粉滤纸条，β-葡萄糖苷酶活(β-Gase)测定底物为1％水杨苷溶液。
酶活测定结果如表1、2所示，可以看出，各菌株组合的酶活力值明显大于各单一菌种酶活力值的简单相加，协同效果显著。组合Ⅳ的三种纤维素酶活均为最大值，为最优处理。但考虑到组合Ⅲ的酶活力值与Ⅳ差距不大，本着节约成本且减少菌株用量的目的，本发明进一步通过秸秆降解试验测定其实际效果，以确定最佳菌株组合。
表1：各菌单菌株酶活力测定结果
Figure BDA0003574399340000061
表2：各菌株组合酶活力测定结果
Figure BDA0003574399340000071
注：表中的菌株组合I是蕈状芽胞杆菌和里氏木霉的种子液按等体积比(1:1)组合；组合II是谷氨酸棒杆菌、里氏木霉和烟曲霉的种子液按等体积比(1:1:1)组合；组合III是蕈状芽胞杆菌、谷氨酸棒杆菌、粘质沙雷氏菌和里氏木霉的种子液按等体积比(1:1:1:1)组合；组合IV是蕈状芽胞杆菌、谷氨酸棒杆菌、粘质沙雷氏菌、里氏木霉和烟曲霉的种子液按等体积比(1:1:1:1:1)组合。
实施例2：复合菌剂秸秆降解效果检测
利用质量浓度为1％的NaOH溶液浸泡秸秆30min以去除表面蜡质，提高纤维素降解菌与秸秆纤维素组分的接触程度。将浸泡后的秸秆剪成5cm左右的小段，去离子水浸泡24h，以促进其中速效碳氮的溶解，并调节含水率适宜。将处理好的秸秆50℃烘箱干燥后堆置于发酵桶内，加入尿素调节C/N为30，得到预处理后的秸秆原料。
试验设4个处理，分别为：
CK处理：将与菌剂等体积的液体产酶培养基接种至预处理后的秸秆原料上，混合均匀后连续发酵。
EM处理：将EM菌剂(购买自泰安普天试剂有限公司)按5％接种量(质量分数) 接种至预处理后的秸秆原料上，混合均匀后连续发酵。
ZZ3处理：将复合菌剂Ⅲ(即表2中的菌株组合Ⅲ)按5％接种量(质量分数)接种至预处理后的秸秆原料上，混合均匀后连续发酵。
ZZ4处理：将复合菌剂Ⅳ(即表2中的菌株组合Ⅳ)按5％接种量(质量分数)接种至预处理后的秸秆原料上，混合均匀后连续发酵。
各处理组每2d进行翻堆并补充水分，每天记录堆体颜色及温度变化，当发酵桶内秸秆变成黑褐色，无刺鼻气味，pH测定偏中性时，可认为腐熟。
降解结束后，利用差重法测定秸秆中纤维素和半纤维素含量变化：称取秸秆2.0g，60℃烘干至恒重W1。加入150ml 2mol/L的HCL，105℃水浴50min后过滤，依次用 95％乙醇、无水乙醇、丙酮洗涤2次。转入已恒重的坩埚(W2)中，60℃烘至恒重W3。接着，残渣中加入15mL冷却至室温的75％硫酸，25℃水解3h后，再加入135mL水，过夜，次日过滤，用蒸馏水洗残渣至滤液pH为6.5～7.0。滤渣转入已恒重的坩埚中 (W4)，在60℃烘箱中烘至恒重(W5)。平行测定样品3份。半纤维素含量＝W1-(W3- W2)；纤维素含量＝(W3-W2)-(W5-W4)。
结果如表3所示。可以看出，秸秆初始为黄绿色，随着发酵的进行颜色逐渐加深，在第6d复合菌剂Ⅳ处理的秸秆开始变为深褐色，且逐渐变软，并散发出浓郁的草香味，在第12d完全变为黑色，基本达到腐熟。而CK处理则在第10d才开始转为黄褐色，并伴随轻微酸臭味，直到第20d才开始出现黑色。复合菌剂Ⅲ和EM菌剂处理的秸秆则介于两者之间。由图2可以看出，四个处理温度变化均呈现先急剧上升后下降的趋势，但复合菌剂Ⅳ的处理温度上升最为迅速，且最高温达到了56℃，显著高于其他处理，同时菌剂Ⅳ的高温期持续时间最长(50℃以上保持4d)且最快腐熟至室温，明显优于菌剂Ⅲ。降解率结果(图3)也表明，处理35d后，CK、EM菌剂、复合菌剂Ⅲ处理的秸秆降解率分别为31％、54％、59％；菌剂Ⅳ却达到了69％，其中纤维素和半纤维素的降解率分别为57％和44％％，相比其他处理显著提升。
表3：各处理秸秆颜色变化
Figure BDA0003574399340000081
综合来看，复合菌剂Ⅲ与复合菌剂Ⅳ虽然酶活力值相差不大，但后者处理的秸秆降解升温迅速，腐熟较快，纤维素和半纤维素降解效率得到了显著的提升。这可能是谷氨酸棒杆菌的增加有利于秸秆中粗蛋白向小分子有机氮形式的转化，从而为其他纤维素降解微生物提供了更多的能源物质，进而加速了秸秆的降解进程。因此，选择复合菌剂Ⅳ进一步开发与利用。
实施例3：复合菌剂Ⅳ载体筛选实验
本发明共选取7种载体，分别为：无机材料(活性炭、沸石粉、蛭石、硅藻土)和有机材料(麦麸、秸秆粉、草炭土)。将各类材料磨碎并通过30目筛，在121℃灭菌30 min，烘干备用。接种载体之前，测定各处理菌液的初始活菌数。具体操作为：无菌条件下，将不同载体与复合菌剂Ⅳ按照10g载体添加40ml菌液的比例进行混合，然后在 30℃下培养。分别在5h、10h、24h、2d、4d、8d、14d、22d对培养载体进行取样，每次取0.2g载体，加入蒸馏水定容至5ml，120r/min摇床震荡15min后离心10min (4000r/min)，倾去上清液，在剩余沉淀中加入1ml蒸馏水，震荡后进行梯度稀释，各浓度分别取200μl涂布在冷却的营养平板培养基上，30℃倒置培养24-36h后进行计数，每个处理3次重复。在筛选得到的最佳载体基础上，进一步进行不同添加比例的研究，分别为10g麦麸添加20ml菌液、10g麦麸添加30ml、10g麦麸添加40ml、10g麦麸添加50ml，分别利用平板涂布法测定接种菌剂组合Ⅳ后载体中的活菌数，方法同上。
结果表明(图4)，在30℃保藏的情况下，菌液接种5h后，活性炭、蛭石和沸石粉载体中有效活菌数迅速下降，而硅藻土、麦麸、秸秆粉和草炭土中有效活菌数则有所上升。总体来讲，复合菌剂Ⅳ接种至各载体时，有效活菌数均有所降低。保藏22d后，各载体对于菌剂的固化能力差异较大，有效活菌数分别为：活性炭2.1×107cfu/g、沸石粉 2.6×107cfu/g、蛭石9×106cfu/g、硅藻土1.49×108cfu/g、麦麸3.12×108cfu/g、秸秆粉 2.07×108cfu/g、草炭土2.63×108cfu/g。麦麸作为复合菌剂Ⅳ载体时，活菌固化量最大，说明其最适合复合菌剂Ⅳ的保藏与固定，可以在较长时间内保持菌剂Ⅳ组成菌株活性，且来源广泛成本较低，是最佳的保藏载体。
添加比例试验结果见表4。
表4：载体与菌液不同添加比例有效活菌数测定结果
Figure BDA0003574399340000091
结果表明：随着菌液体积的增加，载体中有效活菌数呈先上升后下降的趋势。当每10g载体接种40ml复合菌剂Ⅳ时，有效活菌数达到最大峰值，随后开始缓慢下降，代表达到了载体所能固定微生物的最大值，因此，复合菌剂Ⅳ与最佳载体麦麸的添加比例为：每10g麦麸载体对应40ml菌液。
实施例4：纤维素降解复合菌剂的制备
(1)将斜面保藏的蕈状芽胞杆菌(Bacillus mycoides)、粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基，里氏木霉(Trichoderma reesei)和烟曲霉(Aspergillus fumigatus)接种至马铃薯(PDA)液体培养基。30℃、180rpm摇床培养24h得到一代菌株，将活化后的菌种按1％接种量分别接种至液体生长培养基摇瓶，30℃、120rpm摇床培养24h得到种子液。各菌株的种子液按等体积比混合(各占20％)，得到复合种子液；
(2)将复合种子液按照5％的接种量接种至液体产酶培养基中，在35-36℃、初始pH 6.5-7.0的条件下培养4-5d，制备得到复合菌液。
(3)将复合菌液与麦麸按40ml：10g的比例混合，即制备得到纤维素降解复合菌剂。
实施例5：堆肥发酵试验
为检测本发明的纤维素降解复合菌剂的实际应用效果，采用静态好氧堆肥的方法，测定肥料发酵效果及养分含量变化。具体步骤为：分别取纤维素高含量畜禽粪便羊粪18kg和玉米秸秆8kg(干基质量比1：1)，添加少量木屑调节堆体碳氮比为25：1，初始含水率60％，pH适宜，将其作为发酵材料。
试验共3个处理，分别为：
CK：不添加菌剂处理。
EM：将EM菌剂(购买自泰安普天试剂有限公司)按照1％接种量(湿重)接种至发酵材料中，混合均匀。
ZZ4：将实施例4制备的纤维素降解复合菌剂按照1％接种量(湿重)接种至发酵材料中，混合均匀。
每天观察并记录堆体温度和含水率变化，分别于堆肥0、6、16和26d采用四分法取样，测定其相应养分含量。并检测堆肥样品各时期种子发芽指数(参照《有机肥料》 (NY/T525-2021)的方法进行测试)，以表征产品腐熟效果及安全性。
结果如图5、6所示，与EM和CK处理相比，ZZ4处理的堆体温度上升迅速，高温期长且降温腐熟彻底，含水率下降幅度也最大，有利于提高堆体温度，达到了快速发酵的效果。同时由表5可知，发酵结束时，复合菌剂Ⅳ处理的全氮含量显著高于其他处理，同时易于植物吸收利用的无机氮(硝铵态氮总和)以及小分子有机态氮(碱解有机氮)含量相比CK也大幅度增加，容易以氨气形式挥发损失的铵态氮含量则低于CK，说明本发明的纤维素降解复合菌剂对于提高堆肥养分含量，减少氮素损失意义重大，可能与其促进纤维素降解提供大量能源物质，促进了堆体中土著固氮菌的繁殖有关。相对于常见EM菌剂，本发明的纤维素降解复合菌剂能更好的作用于高纤维含量的堆肥材料，减少养分损失，促进氮素转化，有利于养分的保持与发酵产物的腐熟，对于纤维素的降解与小分子氮的形成均具有明显的效果。
表5：各处理堆体发酵过程氮含量变化
Figure BDA0003574399340000111
同时，由图7可知，ZZ4处理种子发芽指数明显优于CK和EM处理，在第15d和 21d就率先超过60％和80％，表明本发明的纤维素降解复合菌剂的施用可以有效缩短堆肥腐熟时间。相比市售EM菌剂处理，本发明的纤维素降解复合菌剂堆体提前3d达到无害化标准(GI＞80％)，促生效果明显，有利于作物生长。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种纤维素降解复合菌剂，其特征在于，包括复合菌液，所述复合菌液由蕈状芽胞杆菌(Bacillus mycoides)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、里氏木霉(Trichoderma reesei)和烟曲霉(Aspergillusfumigatus)组成；
所述复合菌液中的总活菌数大于或等于3.75×108cfu/mL。
2.根据权利要求1所述的纤维素降解复合菌剂，其特征在于，所述复合菌液中，蕈状芽胞杆菌(Bacillus mycoides)的活菌数为1.55～2.11×108cfu/mL，谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的活菌数为0.58～0.67×108cfu/mL，粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)的活菌数为0.11～0.14×108cfu/mL，里氏木霉(Trichodermareesei)的活菌数为1.45～1.6×108cfu/mL，烟曲霉(Aspergillus fumigatus)的活菌数为0.06～0.087×108cfu/mL。
3.根据权利要求1或2所述的纤维素降解复合菌剂，其特征在于，所述蕈状芽胞杆菌(Bacillus mycoides)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、里氏木霉(Trichoderma reese)和烟曲霉(Aspergillusfumigatus)均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，其中，蕈状芽胞杆菌的菌株编号为CICC21473，谷氨酸棒杆菌的菌株编号为CICC20182，粘质沙雷氏菌的菌株编号为CICC10355，里氏木霉的菌株编号为CICC2626，烟曲霉的菌株编号为CICC41022。
4.根据权利要求1或2所述的纤维素降解复合菌剂，其特征在于，所述纤维素降解复合菌剂中还包括载体。
5.根据权利要求4所述的纤维素降解复合菌剂，其特征在于，所述载体为麦麸；载体与复合菌液的添加比例为：每40ml复合菌液中添加10g载体。
6.权利要求1-5任一项所述的纤维素降解复合菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将蕈状芽胞杆菌(Bacillus mycoides)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、里氏木霉(Trichoderma reesei)和烟曲霉(Aspergillus fumigatus)的种子液混合，得到复合种子液；
(2)将复合种子液接种至液体产酶培养基中，在35-36℃、初始pH 6.5-7.0的条件下培养4-5天，制备得到复合菌液。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，将蕈状芽胞杆菌(Bacillus mycoides)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、里氏木霉(Trichoderma reesei)和烟曲霉(Aspergillusfumigatus)的种子液按体积比1:1:1:1:1混合，得到复合种子液。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述液体产酶培养基的组成为：
CMC-Na 5.0g,(NH4)2SO4 1.4g,MgSO4·7H2O 0.3g,KH2PO4 2.0g,CaCl2 0.3g,FeSO4·7H2O 0.005g,MnSO4 0.0016g,ZnSO4·7H2O 0.0014g,CoCl2 0.002g,蛋白胨5g,蒸馏水1L。
9.权利要求1-5任一项所述的纤维素降解复合菌剂在如下(1)或(2)中的应用：
(1)降解秸秆中的纤维素；
(2)堆肥发酵。
10.一种秸秆的降解方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将植物秸秆用碱液浸泡处理，去除表面蜡质；将碱液浸泡处理后的植物秸秆剪成小段，用去离子水浸泡20-26h，干燥，再加入尿素调节C/N比为28-32，得到预处理后的原料；
(2)向步骤(1)预处理后的原料中接入权利要求1-5任一项所述的纤维素降解复合菌剂，混合均匀后进行连续发酵12-35天。
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