CN104805145A - 一种利用木质纤维素原料生产谷氨酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用木质纤维素原料生产谷氨酸的方法，具体步骤为：(1)对木质纤维素原料进行预处理；(2)利用液体培养基培养谷氨酸生产菌并收获细胞；(3)利用分别糖化与发酵的方式生产谷氨酸，或者利用同步糖化与发酵的方式生产谷氨酸；(4)将步骤(3)得到的谷氨酸发酵液通过固液分离、浓缩、析晶、中和、精制等工序制备谷氨酸钠。本发明的优点：以木质纤维素原料代替传统的粮食如淀粉质和糖质原料进行谷氨酸生产，有效降低谷氨酸的生产成本；同时，为农林废弃物的处理提供有效途径，为环境治理和交通安全提供保障。

Description

一种利用木质纤维素原料生产谷氨酸的方法

【技术领域】

本发明涉及生物基化学品的生物制造和生物炼制领域，具体地说，是玉米秸秆等木质纤维素原料经过糖化与发酵生产谷氨酸的方法。

【背景技术】

谷氨酸是世界上应用最广，产量最大的氨基酸，可广泛应用于食品、医药、化工和农业生产中。谷氨酸是生产味精的主要原料，国内外早已应用于工业化生产，生产技术相对成熟，目前的研究主要聚焦于节能降耗、提高收率、降低产品成本等方面。目前我国谷氨酸年产量已超过200万吨，主要用于调味品生产，而随着在化工、医药和保健食品领域需求量的增加，谷氨酸行业的发展空间还很大。玉米和糖蜜等淀粉和糖质原料是谷氨酸传统生产中的主要原料，为了满足日益增长的谷氨酸需求，而导致的粮食深加工企业规模的扩大势必引起粮食价格的大幅增加，即“与人争粮”的问题。因此，寻求价格低廉、来源广泛的谷氨酸生产原料，对于谷氨酸行业的健康发展具有十分重要的意义。

木质纤维素原料主要来源于农林业废弃物，纤维素含量丰富，价格低廉。但是由于缺乏合理的利用模式，这些木质纤维素原料通常被就地焚烧，造成了巨大的环境污染和交通安全。因此，利用储量丰富、价格低廉的木质纤维素原料，采用生物发酵的方法生产谷氨酸具有广阔的前景。

利用木质纤维素原料生产谷氨酸，一般包括原料预处理，抑制物脱除，酶水解，发酵和产品分离等工序。因为以木质纤维素为基质发酵生产谷氨酸存在许多技术难点，相关的研究和报道较少，目前的研究主要集中在利用代谢过程的手段构建可以利用多种碳源的谷氨酸发酵微生物。如Vipin Gopinath等人(Appl Microbiol Biotechnol，2011，92,985-996)利用能同时利用葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的重组型Corynebacterium glutamicum，以葡萄糖、木糖、阿拉伯糖总浓度为42g／1的稻杆水解液经100h发酵生产了14g／1谷氨酸。TakeyukiTsuchidate等(Appl Microbiol Biotechnol，2011，90，895-901)利用能分泌葡聚糖内切酶的重组谷氨酸棒杆菌以15gβ-葡聚糖为底物，发酵72h，产生178mg／1谷氨酸。本发明提供了一种以真实的木质纤维素物料为基质，利用一株具有高抑制物耐受性的谷氨酸棒杆菌，直接发酵玉米秸秆水解液生产谷氨酸的方法。

【发明内容】

本发明目的在于拓展工业用谷氨酸生产的原料，提供一种利用价格低廉、资源丰富的木质纤维素为原料生产谷氨酸的方法。

本发明的构思：以木质纤维素为原料生产谷氨酸，具体地说是首先对木质纤维素原料进行预处理；然后对谷氨酸生产菌谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum B460(购自上海市工业微生物研究所菌种保藏中心)进行液体培养；将培养好的谷氨酸棒杆菌C. glutamicum B460接入木质纤维素原料的酶解液，在30℃、pH7、200rpm的条件下进行谷氨酸的发酵生产；或者将培养好的谷氨酸棒杆菌C. glutamicum B460接入一定固体含量的木质纤维素体系中，加入纤维素酶和营养盐，在通气条件下进行同步糖化与发酵生产谷氨酸。C. glutamicum B460对木质纤维素衍生的抑制物具有较高的耐受性，因此可实现直接利用未脱毒的木质纤维素水解液的谷氨酸发酵。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种利用木质纤维素原料生产谷氨酸的方法，其具体步骤为，

(1)极低水用量的木质纤维素原料高温稀酸预处理：

取干基玉米秸秆，按2∶1的固液比(w／w)加入质量浓度为5％(w／w)的稀硫酸，搅拌均匀后，浸泡12～16小时；将预浸好的玉米秸秆装填入预处理反应器中进行预处理，温度为185℃、1.2MPa，维持3分钟；预处理结束后，迅速打开预处理反应器的排气阀，使反应器内压力迅速降至常压；然后取出物料并冷却至室温，盛入塑料袋中备用；

预处理方法包括稀酸预处理、机械预处理、碱法预处理、蒸汽爆破预处理、氨纤维膨爆预处理、热水预处理、生物预处理等，优选稀酸预处理；对木质纤维素原料进行预处理可以破坏木质纤维素的固有结构，提高可酶解性。

(2)利用液体培养基培养谷氨酸生产菌Corynebacterium glutamicumB460并收获细胞

液体培养基的组成为：葡萄糖10～80g／L，玉米浆0.5～30g／L，硫酸镁0.1～10g／L，硫酸锰2mg～1g／L，硫酸亚铁2mg～1g／L，磷酸二氢钾0.1～10g／L，尿素1～10g／L。

培养条件为：温度30～50℃，转速50～500rpm，时间6～36小时，OD600值1～20；OD600值是指含有菌体的溶液在600nm波长处的吸光值；培养的谷氨酸棒杆菌用于液体或固体发酵基质的进一步培养或发酵。

所述的发酵菌种为谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum B460，谷氨酸生产菌谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum B460，其购自上海市工业微生物研究所菌种保藏中心；但本发明所涉及的菌种不限于所提供的菌种，还包括能够发酵生产谷氨酸的其他菌种，如Corynebacterium pekinense，Corynebacterium crenatum，Brevibacterium flavum等，以及通过诱变、基因工程等操作改造的上述菌株或其他菌株。

(3)糖化与发酵木质纤维素原料生产谷氨酸

将培养好的谷氨酸棒杆菌C. glutamicum B460接入木质纤维素原料的酶解液，加入营养盐，在30℃，pH7，200rpm的条件下进行谷氨酸的发酵生产；或者将培养好的谷氨酸棒杆菌C. glutamicum B460接入木质纤维素体系中，加入纤维素酶及营养盐，在通气条件下进行同步糖化与发酵生产谷氨酸。

所述的木质纤维素的固体含量为5～50％，纤维素酶为5～30FPU／g DM，糖化温度30～55℃，pH4～5.5，糖化12～96h；FPU为纤维素酶滤纸酶活，DM(Dry matter)是指木质纤维素干物质。

所述的营养盐相对于发酵罐中总的液体体积的浓度分别是玉米浆0～30g／L，硫酸镁0～10g／L，硫酸锰0～1g／L，硫酸亚铁0～1g／L，磷酸二氢钾0～10g／L，尿素0～10g／L；优选的方案为玉米浆0.5～30g／L，硫酸镁0.1～10g／L，硫酸锰2mg～1g／L，硫酸亚铁2mg～1g／L，磷酸二氢钾0.1～10g／L，尿素1～10g／L。

谷氨酸棒杆菌在发酵罐中发酵条件为：接种量1％～30％，温度30～50℃，发酵pH4～7.5，发酵时间为24～96h，通气量0.1～10vvm。

(4)利用步骤(3)得到的谷氨酸发酵液提取谷氨酸

将发酵液8000rpm离心10min分离菌体；上清液经蒸发浓缩后加硫酸调节pH，pH达到4～4.5时，有晶核形成，停止加酸；搅拌育晶2～4h，加硫酸调至pH3.0～3.2，育晶2h，冷却降温并继续搅拌16～20h；停止搅拌静置沉淀2～4h即可得谷氨酸晶体。

所述的木质纤维素原料包括玉米秸秆、玉米芯、麦秸、稻草、木屑、能源植物、林业废弃物及工业废弃物等；

所述的谷氨酸，包括游离态的谷氨酸，以及调节发酵pH所生成的谷氨酸盐，为谷氨酸钠，谷氨酸钙，谷氨酸钾。

与现有技术相比，本发明的积极效果是：

(1)本发明以木质纤维素为原料发酵生产谷氨酸，基质成本低廉，来源广泛，充分利用了可再生资源，“不与人类争粮，不与粮争地”，能够满足谷氨酸不断扩大的市场需求；

(2)本发明使用独特的发酵菌种和培养工艺，在发酵过程几乎不添加外源物质，成本低，不需脱毒过程，节省发酵时间，谷氨酸得率高，便于后续分离和纯化；

(3)本发明以木质纤维素为原料高效发酵生产谷氨酸，可以借鉴现有纤维素乙醇生产相关技术，实现基于木质纤维素的大宗化学品生物炼制。

【附图说明】

图1.实施例1发酵过程曲线图。

【具体实施方式】

以下提供本发明一种由木质纤维素生产谷氨酸的方法的具体实施方式。

实施例1

烘干的玉米秸秆与2.5％(w／w)的稀硫酸溶液以2∶1的固液比混合均匀后，预浸12～16小时；然后在185℃、1.2MPa的条件下进行预处理3分钟。然后将预处理后的木质纤维素物料加入糖化反应器中，调整固体含量为15％，加入纤维素酶15FPU／g DM，在温度50℃、150rpm、pH4.8的条件下酶解48h。酶解完成后，离心进行固液分离，上清液灭菌后过滤。然后接种培养好的Corynebacterium glutamicum B460至水解液中，于30℃、200rpm的条件下进行谷氨酸发酵。发酵过程中用20％的尿素控制pH在7.0，并通过添加200mg／1青霉素诱导其产酸。发酵72h后，谷氨酸浓度达34.2g／1，得率为69.54％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种利用木质纤维素原料生产谷氨酸的方法，其特征在于，具体步骤为，

(1)极低水用量的木质纤维素原料高温稀酸预处理：

取干基玉米秸秆，按2∶1的固液比(w／w)加入质量浓度为5％(w／w)的稀硫酸，搅拌均匀后，浸泡12～16小时；将预浸好的玉米秸秆装填入预处理反应器中进行预处理，温度为185℃、1.2MPa，维持3分钟；预处理结束后，迅速打开预处理反应器的排气阀，使反应器内压力迅速降至常压；然后取出物料并冷却至室温，盛入塑料袋中备用；

(2)利用液体培养基培养谷氨酸生产菌Corynebacterium glutamicumB460并收获细胞

(3)糖化与发酵木质纤维素原料生产谷氨酸

将培养好的谷氨酸棒杆菌C.glutamicum B460接入木质纤维素原料的酶解液，加入营养盐，在30℃，pH7，200rpm的条件下进行谷氨酸的发酵生产；或者将培养好的谷氨酸棒杆菌C.glutamicum B460接入木质纤维素体系中，加入纤维素酶及营养盐，在通气条件下进行同步糖化与发酵生产谷氨酸。

(4)利用步骤(3)得到的谷氨酸发酵液提取谷氨酸

将发酵液8000rpm离心10min分离菌体；上清液经蒸发浓缩后加硫酸调节pH，pH达到4～4.5时，有晶核形成，停止加酸；搅拌育晶2～4h，加硫酸调至pH3.0～3.2，育晶2h，冷却降温并继续搅拌16～20h；停止搅拌静置沉淀2～4h即得谷氨酸晶体。

2.如权利要求1所述的一种利用木质纤维素原料生产谷氨酸的方法，其特征在于，在所述的步骤(1)中，预处理方法包括稀酸预处理、机械预处理、碱法预处理、蒸汽爆破预处理、氨纤维膨爆预处理、热水预处理、生物预处理等，优选稀酸预处理。

3.如权利要求1所述的一种利用木质纤维素原料生产谷氨酸的方法，其特征在于，在所述的步骤(2)中，液体培养基的组成为：葡萄糖10～80g／L，玉米浆0.5～30g／L，硫酸镁0.1～10g／L，硫酸锰2mg～1g／L，硫酸亚铁2mg～1g／L，磷酸二氢钾0.1～10g／L，尿素1～10g／L。

4.如权利要求1所述的一种利用木质纤维素原料生产谷氨酸的方法，其特征在于，在所述的步骤(2)中，培养条件为：温度30～50℃，转速50～500rpm，时间6～36小时，OD600值1～20；OD600值是指含有菌体的溶液在600nm波长处的吸光值；培养的谷氨酸棒杆菌用于液体或固体发酵基质的进一步培养或发酵。

5.如权利要求1所述的一种利用木质纤维素原料生产谷氨酸的方法，其特征在于，在所述的步骤(2)中，所述的发酵菌种为谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum B460，谷氨酸生产菌谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum B460，其购自上海市工业微生物研究所菌种保藏中心；但本发明所涉及的菌种不限于所提供的菌种，还包括能够发酵生产谷氨酸的其他菌种，如Corynebacterium pekinense，Corynebacterium crenatum，Brevibacterium flavum等，以及通过诱变、基因工程等操作改造的上述菌株或其他菌株。

6.如权利要求1所述的一种利用木质纤维素原料生产谷氨酸的方法，其特征在于，在所述的步骤(3)中，所述的木质纤维素的固体含量为5～50％，纤维素酶为5～30FPU／g DM，糖化温度30～55℃，pH4～5.5，糖化12～96h；FPU为纤维素酶滤纸酶活，DM(Dry matter)是指木质纤维素干物质。

7.如权利要求1所述的一种利用木质纤维素原料生产谷氨酸的方法，其特征在于，在所述的步骤(3)中，所述的营养盐相对于发酵罐中总的液体体积的浓度分别是玉米浆0～30g／L，硫酸镁0～10g／L，硫酸锰0～1g／L，硫酸亚铁0～1g／L，磷酸二氢钾0～10g／L，尿素0～10g／L。

8.如权利要求1所述的一种利用木质纤维素原料生产谷氨酸的方法，其特征在于，在所述的步骤(3)中，谷氨酸棒杆菌在发酵罐中发酵条件为：接种量1％～30％，温度30～50℃，发酵pH4～7.5，发酵时间为24～96h，通气量0.1～10vvm。

9.如权利要求1所述的一种利用木质纤维素原料生产谷氨酸的方法，其特征在于，在所述的步骤(4)中，所述的木质纤维素原料包括玉米秸秆、玉米芯、麦秸、稻草、木屑、能源植物、林业废弃物及工业废弃物。

10.如权利要求1所述的一种利用木质纤维素原料生产谷氨酸的方法，其特征在于，在所述的步骤(4)中，所述的谷氨酸，包括游离态的谷氨酸，以及调节发酵pH所生成的谷氨酸盐，为谷氨酸钠，谷氨酸钙，谷氨酸钾。