CN102433321B - 可利用木糖发酵乳酸且耐高温的融合乳酸菌的育种方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种针对可利用木糖的乳酸菌的育种方法。该方法根据可代谢木糖的嗜温乳杆菌能够利用木糖但不耐受高温的特性，以其利用木糖的特性作为一种遗传标记。选用一种可耐高温但不能利用木糖的乳杆菌，以其耐受高温的特性，作为该菌的遗传标记。在合适的条件下，制备两亲本的原生质体，并进行融合。以高温和木糖作为筛选压力，使两亲本的融合子在合适的条件下再生，最终获得即可利用木糖又可耐受一定高温的融合子。利用该方法获得的融合子，可在45℃温度下，分别利用40g/l的葡萄糖和木糖，乳酸的产量达到25.14g/l和20.96g/l。
Description
技术领域
本发明涉及一种乳酸菌的育种方法，特别是涉及一种能够利用木糖发酵且耐高温的融合乳酸菌的育种方法。
背景技术
乳酸在医药、食品、日用化工等领域有着广泛的应用，它是一种重要的平台化合物，可转化为多种化合物如丙烯酸、丙二醇、乙醛和乙酰丙酮。近几年来，随着乳酸及其衍生物在生物可降解塑料及绿色环保溶剂中的应用，工业上对乳酸的需求也逐渐增加。
目前，全世界的乳酸年产量约为20-25万吨，其中90％均选育特定的微生物用发酵法生产。乳酸发酵多采用大米、玉米等淀粉质原料发酵，但发酵生产成本较高。以谷物或玉米为原料大规模工业化生产乳酸作为聚乳酸合成前体会大量消耗粮食，加剧粮食与饲料资源的紧张状况。采用廉价易得，来源广泛的木质纤维素为原料来发酵生产乳酸，不仅能够降低乳酸发酵的原料成本，而且具有深远的环境与社会意义。
木质纤维素物质结构的复杂性，决定了木质纤维素乳酸工艺的复杂性。因此需要筛选和构建具有一定特性的菌种，以满足木质纤维素乳酸工艺的特殊条件如：能够同时利用葡萄糖和木糖，能够耐受木质纤维素稀酸水解液中的抑制物，能够耐高温等。一些研究报道了部分可利用木糖的乳酸菌如戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus）、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei ssp.Rhamnous)、冷凝芽孢杆菌(Bacillus coagulancs)和基因工程大肠杆菌(E.coli)利用木质纤维素水解液发酵生产乳酸的研究。但是这些菌株或者存在葡萄糖阻遏（carbon catabolic repression，CCR）效应，如干酪乳杆菌优先利用木质纤维素水解液中的葡萄糖，待葡萄糖消耗殆尽才开始缓慢利用木糖；或者存在水解液抑制物不耐受的问题。据报道，稀酸水解液中已确认的抑制物多达35种，抑制物的浓度随着预处理的水解程度的增加而增加。如当水解液中的木糖含量达到5g/l时，干酪乳杆菌的生长就因水解液中的抑制物受到抑制。冷凝芽孢杆菌虽然能够同时利用水解液中的葡萄糖和木糖，但是当水解液中的木糖含量达到35g/l时，其生长就因水解液中的抑制物而受到阻遏。尽管一些脱毒处理的方法如生物法，化学法被提出来，但是势必增加乳酸发酵的成本。而通过诱变或基因修饰的手段，虽能够改善部分木糖利用菌株如E.coli的葡萄糖阻遏效应，但其同时代谢葡萄糖与木糖的能力与不存在葡萄糖阻遏的野生型菌株相比，还是相去甚远。短乳杆菌是一种不存在碳代谢阻遏（carbon catabolic repression，CCR）效应，可同时代谢葡萄糖与木糖，而且能够耐受木质纤维素水解液抑制物的一种天然的乳酸菌，在木质纤维素的生物炼制方面具有极大应用潜力。同步糖化发酵（SSF）是实现木质纤维素生物炼制最理想的一种发酵工艺。该工艺需要菌株具备耐受45~50℃高温的特性，以配合纤维素酶的水解，使同步糖化发酵工艺的效率达到最高，从而降低纤维素酶的使用量，进而降低成本。而大部分可利用木糖的乳酸菌如短乳杆菌为嗜温菌，不耐受45~50℃高温。因此需要对短乳杆菌进行改造，提高其温度耐受性，使其更适于木质纤维素发酵的工艺条件。但是微生物的耐高温机制复杂，往往涉及多个基因，单个或少量基因的表达或缺失，不能达到提高菌株的温度耐受性。同时，目前关于短乳杆菌的遗传背景，代谢调控网络的研究尚处于起步阶段，没有建立成熟的基因改造技术，仅有少量的文章报道了关于短乳杆菌的代谢工程改造的报道，效果亦不理想。
原生质体融合杂交育种被证明是一种可以应用于乳酸菌的良好的育种技术。但是该方法一般首先需要对融合的两亲本进行诱变，以获得合适的遗传标记。但是在诱变过程中往往可能将亲本的优良性状相关的基因破坏或丢失，从而影响融合子优良基因的获得。
发明内容
有鉴于此，本发明设计了一种针对可利用木糖的乳酸菌，主要是短乳杆菌的一种育种方法。
本发明提供的关于可利用木糖的乳酸菌，如短乳杆菌的育种方法，主要包括以下步骤：
1）选择一种能够耐受45~55℃高温，不具备木糖利用能力的乳酸杆菌，制备原生质体。
2）培养可利用木糖的乳酸菌制备原生质体。
3）将上述获得的两种原生质体进行融合。
4）选择合适的原生质体再生条件，获得融合子。
上述方法中，所述可利用木糖的乳酸杆菌可为短乳杆菌，植物乳杆菌，具体可为短乳杆菌。
上述方法中所述短乳杆菌已申请专利，专利号：200910136559.6。并于2009.5.4保存于中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏号为CGMCC3051，公众可据此到中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心任意购买。
上述方法中，所述能够耐受45~55℃高温，不具备木糖利用能力的乳酸杆菌可为德氏乳杆菌，保加利亚乳杆菌，鼠李糖乳杆菌，具体可为鼠李糖乳杆菌CGMCC1.2134。
上述方法中，所述原生质体再生条件为，原生质体再生培养基：木糖20g/l、蔗糖171g/l、蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、牛肉膏4g/l、柠檬酸铵2g/l、磷酸氢二钾2g/l、无水乙酸钠3g/l、硫酸镁0.5g/l、硫酸锰0.02g/l，BAS5%、明胶25%、氯化镁25mM、氯化钙25mM,其余为水，45℃静置培养。
本发明分别制备短乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的原生质体，并融合。利用短乳杆菌可利用木糖，但不能耐受45℃高温的特性，及鼠李糖乳杆菌不能利用木糖，但是能够耐受45~55℃高温的特点。以木糖和45~55℃高温做为融合子再生的选择压力，获得能够在45℃利用木糖产乳酸的融合子。摇瓶发酵表明，采用该法获得的融合子，可在45℃发酵40g/l的木糖，生成20.96g/l的乳酸，副产物乙酸的量为7.26g/l.
具体而言，本发明提供了一种可利用木糖发酵乳酸且耐高温的融合乳酸菌的育种方法，其中，包括以下步骤：
步骤一、将可利用木糖发酵生成乳酸的乳酸菌进行原生质体的制备，以及将可以耐受高温的乳酸菌进行原生质体的制备；
步骤二、将上述步骤一中获得的可利用木糖发酵生成乳酸的乳酸菌的原生质体和可以耐受高温的乳酸菌的原生质体进行融合；
步骤三、将上述步骤二中获得的原生质体融合液混入再生培养基，进行再生，最终获得可利用木糖发酵乳酸且耐高温的融合乳酸菌。
优选的是，所述的可利用木糖发酵乳酸且耐高温的融合乳酸菌的育种方法中，所述可利用木糖发酵生成乳酸的乳酸菌为植物乳杆菌，戊糖乳杆菌，和/或短乳杆菌。
优选的是，所述的可利用木糖发酵乳酸且耐高温的融合乳酸菌的育种方法中，所述耐受高温的乳酸菌为德氏乳杆菌、保加利亚乳杆菌和/或鼠李糖乳杆菌。
优选的是，所述的可利用木糖发酵乳酸且耐高温的融合乳酸菌的育种方法中，利用木糖发酵生成乳酸的乳酸菌可利用木糖，但不耐受高温的特性，作为其遗传标记，利用可以耐受高温的乳酸菌可耐受高温，但不能利用木糖的特性，作为其遗传标记，以木糖的可利用性与耐受高温性作为融合乳酸菌的筛选压力，筛选融合乳酸菌。
优选的是，所述的可利用木糖发酵乳酸且耐高温的融合乳酸菌的育种方法中，可以耐受高温的乳酸菌能够耐受45~55℃的高温。
优选的是，所述的可利用木糖发酵乳酸且耐高温的融合乳酸菌的育种方法中，在所述步骤一中，将可利用木糖发酵生成乳酸的乳酸菌进行原生质体的制备的方法包括：将可利用木糖发酵生成乳酸的乳酸菌通过培养基进行培养，在光密度OD达到0.6时，收集培养物，再用Tris-LBP缓冲液重悬，使菌体量达到109，加入3~8mg/ml溶菌酶,15~25U/ml变溶菌素，在35～39℃的条件下，酶解30~60分钟，直到原生质体形成率达到90%时，收集菌体，其中，Tris-LBP缓冲液包括：Tris10mM、CaCl220mM和蔗糖0.5M，其中pH6.3。
优选的是，所述的可利用木糖发酵乳酸且耐高温的融合乳酸菌的育种方法中，在所述步骤一中，将可以耐受高温的乳酸菌进行原生质体的制备的方法包括：将可以耐受高温的乳酸菌通过培养基进行培养，在光密度OD达到0.6时，收集培养物，使菌体量达到109，再用HEPE-LBP缓冲液重悬，加入15~25mg/ml溶菌酶,180~220U/ml变溶菌素，在35～39℃的条件下，酶解60~120分钟，直到原生质体形成率达到90%时，收集菌体，其中，HEPE-LBP缓冲液包括：HEPE10mM、MgCl220mM和蔗糖0.5M，其中pH7.3。
优选的是，所述的可利用木糖发酵乳酸且耐高温的融合乳酸菌的育种方法中，在所述步骤二中，将可利用木糖发酵生成乳酸的乳酸菌的原生质体和可以耐受高温的乳酸菌的原生质体进行融合的方法包括：将两种原生质体混匀，加入900μl的促融剂振荡混匀，所述促融剂为50%的PEG缓冲溶液。
优选的是，所述的可利用木糖发酵乳酸且耐高温的融合乳酸菌的育种方法中，可利用木糖发酵生成乳酸的乳酸菌的培养基为：木糖20g/l、蔗糖171g/l、蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、牛肉膏4g/l、柠檬酸铵2g/l、磷酸氢二钾2g/l、无水乙酸钠3g/l、硫酸镁0.5g/l、硫酸锰0.02g/；和/或可以耐受高温的乳酸菌的培养基为：葡萄糖20g/l、蔗糖171g/l、蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、牛肉膏4g/l、柠檬酸铵2g/l、磷酸氢二钾2g/l、无水乙酸钠3g/l、硫酸镁0.5g/l、硫酸锰0.02g/。
本发明还提供了一种根据权利要求1~9中任一项方法育种的融合乳酸菌，其中，所述融合乳酸菌可利用木糖发酵产生乳酸，同时可耐受42~50℃的高温。
本发明利用融合双亲的特性作为筛选标记，不需要通过诱变的方式对双亲进行遗传标记，避免诱变过程中对双亲有利基因的破坏，保留了对产物有利的基因，并使之提高，是一种简便而高效的乳酸菌育种方式。
附图说明
图1示出了短乳杆菌的原生质体形态；
图2示出了鼠李糖乳杆菌的原生质体形态；
图3示出了鼠李糖乳杆菌与短乳杆菌原生质体融合的镜检图片；
图4示出了鼠李糖乳杆菌与短乳杆菌原生质体融合的又一镜检图片；
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步描述。如无特殊说明均为常规方法。所述材料和试剂如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实例一，短乳杆菌原生质体的制备，具体请见图1。
1.挑取短乳杆菌（保存于中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC3051，公众可据此到中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心任意购买）。单菌落至修饰的MRSX培养基，37℃静置过夜培养。
2.吸取适量的过夜培养物至新鲜的培养液PMRSX，使其OD达到0.2,37℃静置培养3~4h,至OD达到0.6。
3.收集培养物，Tris-LBP缓冲液洗涤3次。
4.Tris-LBP缓冲液缓冲液重悬，使菌体量达到109，加入5mg/ml溶菌酶,20U/ml变溶菌素，37℃，酶解30~60min。镜检反应体系，待原生质体形成率达到90%时（见图1），3500rpm，15min，收集菌体，HEPE-LBP缓冲液洗涤一次，终止酶反应。50uL HEPE-LBP缓冲液重悬，备用。
试验中所涉及的培养基和试剂组成如下。
MRSX：木糖20g/l、蔗糖171g/l、蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、牛肉膏4g/l、柠檬酸铵2g/l、磷酸氢二钾2g/l、无水乙酸钠3g/l、硫酸镁0.5g/l、硫酸锰0.02g/。
PMRSX：木糖20g/l、蔗糖171g/l、蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、牛肉膏4g/l、柠檬酸铵2g/l、磷酸氢二钾2g/l、无水乙酸钠3g/l、硫酸镁0.5g/l、硫酸锰0.02g/、甘氨酸1.2%。
Tris-LBP：Tris10mM、CaCl220mM、蔗糖0.5M，pH6.3
HEPE-LBP：HEPE10mM、MgCl220mM、蔗糖0.5M，pH7.3
实例二，植物乳杆菌原生质体的制备
1.挑取植物乳杆菌（保存于中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC1.556，公众可据此到中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心任意购买）落至修饰的MRSX培养基，37℃静置过夜培养。
2.吸取适量的过夜培养物至新鲜的培养液PMRSX，使其OD达到0.2,37℃静置培养3~4h,至OD达到0.6。
3.收集培养物，Tris-LBP缓冲液洗涤3次。
4.Tris-LBP缓冲液缓冲液重悬，使菌体量达到109，加入8mg/ml溶菌酶,25U/ml变溶菌素，39℃，酶解30~60min。镜检反应体系，待原生质体形成率达到90%时（见图1），3500rpm，15min，收集菌体，HEPE-LBP缓冲液洗涤一次，终止酶反应。50uL HEPE-LBP缓冲液重悬，备用。
试验中所涉及的培养基和试剂组成如下。
MRSX：木糖20g/l、蔗糖171g/l、蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、牛肉膏4g/l、柠檬酸铵2g/l、磷酸氢二钾2g/l、无水乙酸钠3g/l、硫酸镁0.5g/l、硫酸锰0.02g/。
PMRSX：木糖20g/l、蔗糖171g/l、蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、牛肉膏4g/l、柠檬酸铵2g/l、磷酸氢二钾2g/l、无水乙酸钠3g/l、硫酸镁0.5g/l、硫酸锰0.02g/、甘氨酸1.2%。
Tris-LBP：Tris10mM、CaCl220mM、蔗糖0.5M，pH6.3
HEPE-LBP：HEPE10mM、MgCl220mM、蔗糖0.5M，pH7.3
实例三，戊糖乳杆菌原生质体的制备
1.挑取植物乳杆菌落至修饰的MRSX培养基，37℃静置过夜培养。
2.吸取适量的过夜培养物至新鲜的培养液PMRSX，使其OD达到0.2,37℃静置培养3~4h,至OD达到0.6。
3.收集培养物，Tris-LBP缓冲液洗涤3次。
4.Tris-LBP缓冲液缓冲液重悬，使菌体量达到109，加入3mg/ml溶菌酶,15U/ml变溶菌素，35℃，酶解30~60min。镜检反应体系，待原生质体形成率达到90%时（见图1），3500rpm，15min，收集菌体，HEPE-LBP缓冲液洗涤一次，终止酶反应。50uL HEPE-LBP缓冲液重悬，备用。
试验中所涉及的培养基和试剂组成如下。
MRSX：木糖20g/l、蔗糖171g/l、蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、牛肉膏4g/l、柠檬酸铵2g/l、磷酸氢二钾2g/l、无水乙酸钠3g/l、硫酸镁0.5g/l、硫酸锰0.02g/。
PMRSX：木糖20g/l、蔗糖171g/l、蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、牛肉膏4g/l、柠檬酸铵2g/l、磷酸氢二钾2g/l、无水乙酸钠3g/l、硫酸镁0.5g/l、硫酸锰0.02g/、甘氨酸1.2%。
Tris-LBP：Tris10mM、CaCl220mM、蔗糖0.5M，pH6.3
HEPE-LBP：HEPE10mM、MgCl220mM、蔗糖0.5M，pH7.3
实例四，鼠李糖乳杆菌原生质体的制备，具体请见图2。
1.挑取鼠李糖乳杆菌（保存于中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC1.2134，公众可据此到中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心任意购买）单菌落至MRSG培养基，45度静置过夜培养。
2.吸取适量的过夜培养物至新鲜的PMRSG培养液，使其OD达到0.2,45度静置培养3~4h,使其OD达到0.6。
3.收集培养物，使其菌体量达到109，HEPE-LBP缓冲液洗涤3次。
4.HEPE-LBP缓冲液缓冲液重悬，加入20mg/ml溶菌酶,200U/ml变溶菌素，37℃，酶解60~120min。镜检反应体系，待原生质体形成率达到90%时（见图2），3500rpm，15min，收集菌体，HEPE-LBP缓冲液洗涤一次，终止酶反应。50uL HEPE-LBP缓冲液重悬，备用。
MRSX：葡萄糖20g/l、蔗糖171g/l、蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、牛肉膏4g/l、柠檬酸铵2g/l、磷酸氢二钾2g/l、无水乙酸钠3g/l、硫酸镁0.5g/l、硫酸锰0.02g/。
PMRSX：葡萄糖20g/l、蔗糖171g/l、蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、牛肉膏4g/l、柠檬酸铵2g/l、磷酸氢二钾2g/l、无水乙酸钠3g/l、硫酸镁0.5g/l、硫酸锰0.02g/、甘氨酸1.2%。
实例五，德氏乳杆菌原生质体的制备
1.挑取德氏乳杆菌（保存于中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC1.2624，公众可据此到中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心任意购买）单菌落至MRSG培养基，45度静置过夜培养。
2.吸取适量的过夜培养物至新鲜的PMRSG培养液，使其OD达到0.2,45度静置培养3~4h,使其OD达到0.6。
3.收集培养物，使其菌体量达到109，HEPE-LBP缓冲液洗涤3次。
4.HEPE-LBP缓冲液缓冲液重悬，加入15mg/ml溶菌酶,180U/ml变溶菌素，35℃，酶解60~120min。镜检反应体系，待原生质体形成率达到90%时（见图2），3500rpm，15min，收集菌体，HEPE-LBP缓冲液洗涤一次，终止酶反应。50uL HEPE-LBP缓冲液重悬，备用。
MRSX：葡萄糖20g/l、蔗糖171g/l、蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、牛肉膏4g/l、柠檬酸铵2g/l、磷酸氢二钾2g/l、无水乙酸钠3g/l、硫酸镁0.5g/l、硫酸锰0.02g/。
PMRSX：葡萄糖20g/l、蔗糖171g/l、蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、牛肉膏4g/l、柠檬酸铵2g/l、磷酸氢二钾2g/l、无水乙酸钠3g/l、硫酸镁0.5g/l、硫酸锰0.02g/、甘氨酸1.2%。
实例六，保加利亚乳杆菌原生质体的制备
1.挑取保加利亚乳杆菌（保存于中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC1.2161，公众可据此到中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心任意购买）单菌落至MRSG培养基，45度静置过夜培养。
2.吸取适量的过夜培养物至新鲜的PMRSG培养液，使其OD达到0.2,45度静置培养3~4h,使其OD达到0.6。
3.收集培养物，使其菌体量达到109，HEPE-LBP缓冲液洗涤3次。
4.HEPE-LBP缓冲液缓冲液重悬，加入25mg/ml溶菌酶,220U/ml变溶菌素，39℃，酶解60~120min。镜检反应体系，待原生质体形成率达到90%时（见图2），3500rpm，15min，收集菌体，HEPE-LBP缓冲液洗涤一次，终止酶反应。50uL HEPE-LBP缓冲液重悬，备用。
MRSX：葡萄糖20g/l、蔗糖171g/l、蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、牛肉膏4g/l、柠檬酸铵2g/l、磷酸氢二钾2g/l、无水乙酸钠3g/l、硫酸镁0.5g/l、硫酸锰0.02g/。
PMRSX：葡萄糖20g/l、蔗糖171g/l、蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、牛肉膏4g/l、柠檬酸铵2g/l、磷酸氢二钾2g/l、无水乙酸钠3g/l、硫酸镁0.5g/l、硫酸锰0.02g/、甘氨酸1.2%。
实例七，短乳杆菌与鼠李糖乳杆菌原生质体的融合及再生，具体请见图3、图4。
1.将上述制备的原生质体混匀，加入900μl的促融剂（50%PEG缓冲溶液），混匀。37℃，轻轻震荡6min，使二者融合（见图3）。
2.添加9ml的HEPE-LBP缓冲溶液至上述反应体系，3500rpm，20min，收集菌体，HEPE-LBP缓冲液洗涤一次。适量HEPE-LBP缓冲液重悬菌体。
3.将上述融合产物与RM培养基混匀，倾倒平板，45℃培养3~7天。
4.挑取单菌落至MRSX平板，45℃传代培养，获得遗传性状稳定的融合子（见图4）。
试验中所涉及的培养基和试剂组成如下。
促融剂：50%PEG于HEPE-LPB缓冲液
a.鼠李糖乳杆菌，培养条件：MRSG，45；b鼠李糖乳杆菌，培养条件：MRSX，45；
c.短乳杆菌，培养条件：MRSX，37；d短乳杆菌，培养条件：MRSX，45；
e.融合子F1-2，培养条件：MRSX
实例八，融合子45℃发酵结果
挑取45℃木糖平板上生长良好的融合子单菌落，接入木糖含量为40g/l的MRSX液体培养基，45℃/37℃，150rpm震荡培养32~48h。HPLC分析发酵液成分。以上发酵试验，每个样品做两个平行。融合子在37和45℃利用木糖发酵的结果如表1所示。
表1.部分融合子利用葡萄糖和木糖在37℃和45℃的发酵结果
glu,葡萄糖；xyl，木糖；lac，乳酸；ace，乙酸；eth，乙醇
由表1可以看出，融合子在45℃利用葡萄糖和木糖产乳酸的能力，与出发菌株s3f4相比，具有很大的提高。当以40g/l木糖为碳源，45℃发酵48h，融合子f1-3可利用75%的木糖，乳酸产量达到20.96g/l，而出发菌株的发酵液中仍有31.91g/l的残糖量，乳酸的产量仅达到10.18g/l。当以40g/l葡萄糖为碳源，45℃发酵48h，融合子f1-3可在18小时内完全消耗葡萄糖，乳酸产量达到25.14g/l，而出发菌株发酵32小时，仍有16.83g/l的残糖，乳酸产量仅达到13.77g/l。融合子在37℃利用葡萄糖和木糖的能力与出发菌株s3f4相比也有较大提高。在37℃下发酵，融合子培养18小时左右就完全消耗掉40g/l的葡萄糖，基本消耗40g/l的木糖，乳酸产量分别达到24.77g/l与29.89g/l。而出发菌株完全消耗葡萄糖需要32h左右，当以木糖为碳源时，培养48小时，仍然有11.92g/l的残糖。
最后需要强调的是：以上实施例仅用以说明本实用新型的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本实用新型进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本实用新型的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本实用新型的权利要求范围当中。
Claims (5)
1.一种可利用木糖发酵乳酸且耐高温的融合乳酸菌的育种方法，其中，包括以下步骤：
步骤一、将可利用木糖发酵生成乳酸的短乳杆菌进行原生质体的制备，以及将可以耐受高温的鼠李糖乳杆菌进行原生质体的制备；
步骤二、将上述步骤一中获得的可利用木糖发酵生成乳酸的短乳杆菌的原生质体和可以耐受高温的鼠李糖乳杆菌的原生质体进行融合；
步骤三、将上述步骤二中获得的原生质体融合液混入再生培养基，进行再生，最终获得可利用木糖发酵乳酸且耐高温的融合乳酸菌；
其中，所述再生培养基的组成成分为：木糖20g/l、蔗糖171g/l、蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、牛肉膏4g/l、柠檬酸铵2g/l、磷酸氢二钾2g/l、无水乙酸钠3g/l、硫酸镁0.5g/l、硫酸锰0.02g/l，BSA5％、明胶25％、氯化镁25mM、氯化钙25mM，其余为水；
且利用木糖发酵生成乳酸的短乳杆菌可利用木糖，但不耐受高温的特性，作为其遗传标记，利用可以耐受高温的鼠李糖乳杆菌可耐受高温，但不能利用木糖的特性，作为其遗传标记，以木糖的可利用性与耐受高温性作为融合乳酸菌的筛选压力，筛选融合乳酸菌。
2.根据权利要求1所述的可利用木糖发酵乳酸且耐高温的融合乳酸菌的育种方法，其中，可以耐受高温的鼠李糖乳杆菌能够耐受45～55℃的高温。
3.根据权利要求1所述的可利用木糖发酵乳酸且耐高温的融合乳酸菌的育种方法，其中，在所述步骤一中，将可利用木糖发酵生成乳酸的短乳杆菌进行原生质体的制备的方法包括：将可利用木糖发酵生成乳酸的短乳杆菌通过培养基进行培养，在光密度OD达到0.6时，收集培养物，再用Tris-LBP缓冲液重悬，使菌体量达到109，加入3～8mg/ml溶菌酶，15～25U/ml变溶菌素，在35～39℃的条件下，酶解30～60分钟，直到原生质体形成率达到90％时，收集菌体，其中，Tris-LBP缓冲液包括：Tris10mM、CaCl220mM和蔗糖0.5M，其中pH6.3。
4.根据权利要求1所述的可利用木糖发酵乳酸且耐高温的融合乳酸菌的育种方法，其中，在所述步骤二中，将可利用木糖发酵生成乳酸的短乳杆菌的原生质体和可以耐受高温的鼠李糖乳杆菌的原生质体进行融合的方法包括：将两种原生质体混匀，加入900μl的促融剂振荡混匀，所述促融剂为50％的PEG缓冲溶液。
5.根据权利要求3所述的可利用木糖发酵乳酸且耐高温的融合乳酸菌的育种方法，其中，可利用木糖发酵生成乳酸的短乳杆菌的培养基的组成为：木糖20g/l、蔗糖171g/l、蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、牛肉膏4g/l、柠檬酸铵2g/l、磷酸氢二钾2g/l、无水乙酸钠3g/l、硫酸镁0.5g/l、硫酸锰0.02g/l。
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