CN102286572A

CN102286572A - 一种以秸秆为原料制备可发酵糖液的方法

Info

Publication number: CN102286572A
Application number: CN201110170721A
Authority: CN
Inventors: 林辉; 周启发; 赵宇华
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2011-06-23
Filing date: 2011-06-23
Publication date: 2011-12-21

Abstract

本发明公开了一种以秸秆为原料制备可发酵糖液的方法，该方法采用木质纤维素混合菌对秸秆和麸皮的混合物进行发酵；将抽提获得的粗酶溶液直接用于预处理秸秆的水解，无需进行酶分离和浓缩，最后获得的可发酵糖液是纤维素酶和混合糖的混合物；其中预处理秸秆的制备原料为抽提后的固体残值，提高原料利用率；该方法获得的糖液适用于同时有木糖和葡萄糖发酵能力菌株的发酵；本方法作为一个连续的过程，其酶系具有较高的水解效率，同时可以降低过程成本，提高原料利用率。

Description

一种以秸秆为原料制备可发酵糖液的方法

技术领域

本发明属于生物化工领域，特别涉及一种将木质纤维素酶制备、粗酶溶液收集和秸秆水解糖液生产整合成一个连续的过程，用以生产可发酵糖溶液的方法。

背景技术

我国具有丰富的木质纤维素物质资源，如小麦秸秆、稻草秸秆、玉米秸秆、蔗渣等。利用木质纤维素来生产可再生的清洁能源及化工产品已成为化工领域一个重要的方向。要达到利用木质纤维素生产能源及化工产品的目的，能否快速、有效得将木质纤维素中的粗纤维转化为可发酵糖类是关键因素。然而，可发酵糖液制备过程中高成本的纤维素酶，繁琐的处理过程及较低的水解效率使得木质纤维素原料的利用停滞不前，无法大规模应用。

目前，可发酵糖液的制备途径主要为分步法：1、购买现成的纤维素酶。这些纤维素酶通常为木霉所生产，经过浓缩、干燥获得。2、在水解反应器中加入预处理的秸秆、水解缓冲液和纤维素酶，进行水解。3、直接以糖液为培养基，或者浓缩处理后配制成培养基，接入菌株进行发酵。在这个过程中，纤维素酶往往为单一组分的酶。而越来越多的研究者发现，单一组分的纤维素酶或者单一一类纤维素酶无法将结构紧密、组分复杂的木质纤维素有效水解成可发酵单糖。多种木质纤维素降解酶的混合物，即完整的降解酶系，往往能达到好的水解效果，因为研究发现不同纤维素酶可以通过协同作用增强水解效果。混菌发酵是目前生产完整的木质纤维素降解酶系的一种有效方案。分步法中，纤维素酶的生产与后期的水解是完全分开的过程，每个过程都需要较高的生产成本。而事实上，纤维素酶的生产原料和纤维素酶的水解底物往往可以是同一种材料。例如，以小麦秸秆为培养基生产纤维素酶，发酵结束后，培养基中的小麦秸秆有很大一部分是没有被完全利用的；这些没有被利用的小麦秸秆通过预处理，又可以成为纤维素酶的水解底物。

发明内容

本技术发明的目的是为了解决现有技术中存在的问题，提供一种以秸秆为原料制备可发酵糖液的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种以秸秆为原料制备可发酵糖液的方法，包括以下步骤：

（1）固态浅层发酵用于木质纤维素酶的生产：将秸秆和麸皮加入Mandel培养液中，灭菌，配制固态发酵培养基，其中，秸秆和麸皮质量比为3：1，秸秆和麸皮的总量与Mandel培养液的质量体积比为1：1；然后在固态发酵培养基中接入木质纤维素酶生产复合真菌的孢子悬液，使用的木质纤维素酶生产复合真菌可以是木霉、米曲霉和黄孢原毛平革菌的组合，木霉、米曲霉和黄孢原毛平革菌的孢子浓度（个/ml）优选配比为94：6.7：1.3；复合真菌在28度进行封闭式静止发酵，培养4天后获得发酵物。

（2）粗酶溶液的制备：按柠檬酸缓冲液与步骤（1）获得的发酵物的体积质量比为20：1，在发酵物中加入柠檬酸缓冲液，得第一混合物；柠檬酸缓冲液的浓度为0.05M，pH为4.8，第一混合物在37度下进行抽提，抽提过程中不停搅拌或者摇晃；固液分离后，液体即为粗酶溶液；

（3）秸秆水解糖液制备：收集发酵抽提物固液分离后剩下的残渣；加入V/V比为2.5%、pH为11.5的过氧化氢水溶液，得第二混合物，残渣与过氧化氢水溶液的质量体积比为10：100；第二混合物在37度，180rpm处理24h后，清水洗至pH为中性；烘干，获得预处理秸秆；将步骤（2）获得的粗酶溶液加入预处理秸秆，在50度下酶解反应20-72h；固液分离后，液体即为可发酵糖液；直接用于发酵，或者浓缩后储存。

进一步地，所述步骤（1）中，所述Mandel培养液的pH为6.0，成分为：NaNO₃ 2g/L，KH₂PO₄ 1.5 g/L，CaCl₂ 0.3 g/L，MgSO₄· 7H₂O 0.3 g/L，FeSO₄· 7H₂O 0.005 g/L，MnSO₄· H₂O 0.0016 g/L，ZnSO₄· H₂O 0.0014 g/L，CoCl₂ 0.0005 g/L。

进一步地，所述步骤（1）中，所述秸秆可以是小麦秸秆、水稻秸秆或玉米秸秆。

本发明的有益效果在于：

1、本发明将纤维素酶酶系制备、粗酶溶液收集和秸秆水解糖液生产整合成一个连续的过程，过程成本降低；

2、木质纤维素酶系由混菌发酵生产，酶系水解效率高；

3、秸秆可以同时用于纤维素酶的生产和纤维素酶的水解，提高原料利用率。

具体实施方式

本发明通过将纤维素酶酶系制备、粗酶溶液收集和秸秆水解糖液生产整合成一个连续的过程，来提高纤维素酶系的水解效率和秸秆的利用效率，同时简化可发酵性混合糖液的生产工艺。该方法制备获得的糖液主要是葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的混合糖，适用于同时有木糖和葡萄糖发酵能力菌株的发酵。

本发明以秸秆为原料制备可发酵糖液的方法，包括以下步骤：

1、固态浅层发酵用于木质纤维素酶的生产：将秸秆和麸皮加入Mandel培养液中，灭菌，配制固态发酵培养基，其中，Mandel培养液的pH为6.0，成分为：NaNO₃ 2g/L，KH₂PO₄ 1.5 g/L，CaCl₂ 0.3 g/L，MgSO₄· 7H₂O 0.3 g/L，FeSO₄· 7H₂O 0.005 g/L，MnSO₄· H₂O 0.0016 g/L，ZnSO₄· H₂O 0.0014 g/L，CoCl₂ 0.0005 g/L；秸秆和麸皮质量比为3：1，秸秆和麸皮的总量与Mandel培养液的质量体积比为1：1；秸秆可以是小麦秸秆、水稻秸秆或玉米秸秆；然后在固态发酵培养基中接入木质纤维素酶生产复合真菌的孢子悬液，使用的木质纤维素酶生产复合真菌可以是木霉、米曲霉和黄孢原毛平革菌的组合，木霉、米曲霉和黄孢原毛平革菌的孢子浓度（个/ml）优选配比为94：6.7：1.3；复合真菌在28度，不控湿的情况下，进行封闭式静止发酵，培养4天后获得发酵物。

2、粗酶溶液的制备：按柠檬酸缓冲液与步骤1获得的发酵物的体积质量比为20：1，在发酵物中加入柠檬酸缓冲液，得第一混合物；柠檬酸缓冲液的浓度为0.05M，pH为4.8，第一混合物在37度下进行抽提，抽提过程中不停搅拌或者摇晃；固液分离后，液体即为粗酶溶液；

3、秸秆水解糖液制备：收集发酵抽提物固液分离后剩下的残渣；加入V/V比为2.5%、pH为11.5的过氧化氢水溶液，得第二混合物，残渣与过氧化氢水溶液的质量体积比为10:100；第二混合物在37度，180rpm处理24h后，清水洗至pH为中性；烘干，获得预处理秸秆；将步骤2获得的粗酶溶液全部加入预处理秸秆，在50度下进行酶解反应20-72h；固液分离后，液体即为可发酵糖液；直接用于发酵，或者浓缩后储存。

本发明不仅是一个发酵、酶抽提和水解制备过程的简单整合，其通过过程的整合保持纤维素酶酶系对底物的最优酶解效果；此外本发明采用自制的复合菌生产的酶系，其水解效率比普通单菌生产的酶系高；同时本发明更是原材料的整合，粗酶抽提后的残渣中未完全利用的秸秆在水解制备过程中再次被利用，提高了原料利用率；本发明制备获得的发酵性糖液适用于同时有木糖和葡萄糖发酵能力菌株，随着越来越多的同时有木糖和葡萄糖发酵能力菌株的发现和构建，通过连续过程转化秸秆制备可发酵糖液将成为一种有效的方法。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明的方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明范围，若未特殊指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟悉的常规手段。

实施例1：木质纤维素酶生产复合菌的获得

本案例中的木质纤维素酶生产复合菌必须能分泌具有比较完整酶系的木质纤维素酶系统，即酶系统中不仅要有纤维素酶，还有存在适量的

Figure 2011101707213100002DEST_PATH_IMAGE001

-葡萄糖苷酶、木聚糖酶及木质素降解酶系。

该木质纤维素酶生产复合真菌可以通过富集驯化方法从自然界直接获得，这种复合真菌的成分未知且复杂，里面不仅有真菌，还可能有细菌。

该木质纤维素酶生产复合真菌人工设计方法获得。即，将已有的几种纤维素酶生产菌混合，筛选能生产具有较高糖化能力的酶系的混合组合。单一的纤维素酶生产菌可以是木霉、曲霉、青霉、酵母，这些菌株可以从中国微生物菌种保藏管理委员会葡萄微生物中心或者工业微生物菌种保藏中心获得，也可以通过酸性、有机碳丰富的林地土壤中筛选获得。

实施例2：固态浅层发酵用于木质纤维素酶的生产

1、固态发酵培养基的配制：机械粉碎小麦秸秆至20目左右。在9cm的平板中，加入3g粉碎的秸秆和1g的麸皮，然后加入4ml的Mandel培养液，121度灭菌20分钟。其中Mandel培养液成分为：NaNO₃ 2g/L，KH₂PO₄ 1.5 g/L，CaCl₂ 0.3 g/L，MgSO₄· 7H₂O 0.3 g/L，FeSO₄· 7H₂O 0.005 g/L，MnSO₄· H₂O 0.0016 g/L，ZnSO₄· H₂O 0.0014 g/L，CoCl₂ 0.0005 g/L调节pH至6.0。

2、接种物的制备及发酵：使用的木质纤维素酶生产复合真菌是木霉、黄孢原毛平革菌和米曲霉的混菌组合，比例为94：6.7：1.3。分别在PDA平板上单独培养木霉、黄孢原毛平革菌和米曲霉三种菌；然后分别用0.1％的Tween80将3种菌的孢子分别从PDA平板上洗下来；计数3种菌的孢子浓度，用无菌水配制成总孢子浓度为3×10⁶个/ml，其中木霉孢子占94％，黄孢原毛平革菌孢子占6.7％，米曲霉孢子占1.3％；在28度，不控湿的情况下，进行封闭式静止发酵，4天培养后获得发酵物。通过该法进行发酵，1g发酵物中含有FPA酶9.48IU，CMC酶44.56IU，－葡萄糖苷酶49.28IU及木聚糖酶51.55IU。

实施例3：粗酶溶液的制备

在按实施例2获得的发酵物中加入80ml柠檬酸缓冲液（0.05M，pH 4.8）；37度下振荡2小时；按照常规的固液分离法获得约80ml清澈的酶液，固态残渣烘干用于预处理秸秆制备。

实施例4：过氧化氢预处理秸秆的制备（一）

收集经实施例3处理后的固态残渣，加入过氧化氢的水溶液（2.5%，pH 11.5），其中固液比为10％；37度下180rpm振荡24h，清水洗涤pH至中性；烘干获得预处理秸秆，以此秸秆为底物用于酶液的水解。

实施例5：过氧化氢预处理秸秆的制备（二）

收集经实施例3处理后的固态残渣，与新的小麦秸秆以1：1的比例混合；加入过氧化氢的水溶液（2.5%，pH 11.5），其中固液比为10％；37度下180rpm振荡24h，清水洗涤pH至中性；烘干获得预处理秸秆，以此预处理秸秆为底物用于酶液的水解。

实施例6：秸秆水解糖液制备

将按实施例3获得的80ml酶液加入含有2g碱预处理秸秆的250ml锥形瓶中；在50度下振荡；固液分离后，液体即为可发酵糖液。经20小时的酶水解，1g预处理秸秆可以产生805.12mg的混合糖，其主要成分为木糖、葡萄糖和阿拉伯糖。

Claims

1.一种以秸秆为原料制备可发酵糖液的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）固态浅层发酵用于木质纤维素酶的生产：将秸秆和麸皮加入Mandel培养液中，灭菌，配制固态发酵培养基，其中，秸秆和麸皮质量比为3：1，秸秆和麸皮的总量与Mandel培养液的质量体积比为1：1；然后在固态发酵培养基中接入木质纤维素酶生产复合真菌的孢子悬液，使用的木质纤维素酶生产复合真菌可以是木霉、米曲霉和黄孢原毛平革菌的组合，木霉、米曲霉和黄孢原毛平革菌的孢子浓度（个/ml）优选配比为94：6.7：1.3；复合真菌在28度进行封闭式静止发酵，培养4天后获得发酵物；

2.根据权利要求1所述以秸秆为原料制备可发酵糖液的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，所述Mandel培养液的pH为6.0，成分为：NaNO₃ 2g/L，KH₂PO₄ 1.5 g/L，CaCl₂ 0.3 g/L，MgSO₄· 7H₂O 0.3 g/L，FeSO₄· 7H₂O 0.005 g/L，MnSO₄· H₂O 0.0016 g/L，ZnSO₄· H₂O 0.0014 g/L，CoCl₂ 0.0005 g/L。

3.根据权利要求1所述以秸秆为原料制备可发酵糖液的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，所述秸秆可以是小麦秸秆、水稻秸秆或玉米秸秆。