CN101565686A - 一种融合菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种融合菌株及其应用。本发明的融合菌株，是由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC No.1451原生质体和根瘤菌(Sinorhizobium sp.)NX2004062 CGMCC No.2883原生质体融合获得的融合子，其保藏编号为CGMCC No.2885。本发明的融合菌株CGMCC No.2885为实现高产优质牧草产业提供有效措施，对于促进苜蓿产量、改善其品质和提高其抗逆性等方面具有重要的科学意义和应用价值。将在农业可持续发展以及农业生态基地建设和区域经济的发展中发挥重要作用。

Description

一种融合菌株及其应用

技术领域

本发明涉及一种融合菌株及其应用。

背景技术

豆科植物中的紫花苜蓿被称为牧草之王，随着生态农业发展和产业结构的调整，以及国内外牧草产品市场需求的拉动，以紫花苜蓿为主的牧草种植呈现迅速发展的态势，并逐步向规模化、集约化的方向发展。但紫花苜蓿生产中存在的两个问题在一定程度上严重制约了其产量和品质的提高。其一是由于根瘤菌与其宿主间的共生有效性，筛选适宜的根瘤菌菌株接种苜蓿品种，才能获得更佳固氮效果。其二是由于苜蓿镰刀菌根腐病(Fusarium spp.)造成苜蓿根系及主根腐烂，较为严重地影响了苜蓿生产。研究结果表明，由于草地本身的特点及经济、环境和食品安全等因素，严重制约了化学农药的使用。同时采用化学防治的方法无法有效的控制土传苜蓿病害的发生(Leath，et.al.1971)。生物控制剂(BCA)以其低毒、具有在作物幼苗根际建群的能力，持效期长，有害生物不易对其产生抗药性等特点得到广泛的关注和重视，目前国际上先进的农化公司大多积极参与生物控制剂的研究和市场化，特别是有益细菌在土传和种传病害的防治中已取得了一定进展，并有系列产品得到成功的应用，取得了显著的经济和生态效益。其中芽孢杆菌属(Bacillus spp)以其分布广，易分离培养，能产生耐热耐干燥的内生孢子，贮藏期长，使用方便等特点，成为一种理想的生防微生物。芽孢杆菌属的生物防治作用在苜蓿病害防治中将扮演越来越重要的角色。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC No.1451是从黑龙江克山县大豆田间土壤中分离得到的一株具有广谱杀菌活性的生防菌株，该菌株用作土壤消毒和种子处理对土传和种传病原菌引起的根腐病具有良好防治效果。2001～2002年期间在黑龙江省大豆重迎茬田、吉林省和北京郊区根腐病发生比较严重的多个蔬菜保护地和苜蓿田进行的防治试验结果表明HL259及其代谢产物能够显著的防治由Pythium，Phytophthora，Fusarium等引起的烂种、猝倒、立枯和根腐等病害，并兼治部分细菌性病害，具有一定的增产作用，是一株理想的土传病菌生物控制菌株，在以苜蓿为代表的牧草病害防治中将发挥重要作用。

原生质体融合即细胞融合，是20世纪70年代发展起来的基因重组技术。通常用酶或机械的方法除去细胞壁，制成原生质然后用物理、化学或生物学的方法诱导遗传特性不同的两亲本原生质体融合，经染色体交换、重组而达到杂交的目的，经筛选获得集双亲优良性状于一体的稳定融合子(Pathak et al.，1971；施巧琴等，2003)。

近年来，该技术已成为细胞生物学研究领域迅速发展的方向之一。1919年Giaja用蜗牛胃液从酵母细胞分离得到原生质，特别是1953年Weibull首次用溶菌酶酶解分离Bacillus的原生质体，为微生物原生质体研究的发展奠定了基础。自Fodoret al.(1976)和Schaeffer et al.(1978)分别报道了巨大芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌种内原生质体融合，微生物原生质体融合现象得到证实，并建立起了相应的试验体系。从此，原生质体融合育种广泛的应用于霉菌、酵母菌、放线菌和细菌，并从株内株间发展到种内种间，打破了种属间的亲缘关系，实现了属间、门间甚至跨界融合。

近30年来，由于研究方法的日渐改进和研究手段的不断更新，围绕着原生质体的研究，已经形成了一整套的原生质体技术，这些技术的日益成熟和发展，使人们对微生物原生质体的研究进入到了一个崭新的阶段(孙剑秋等，2002)。实践证明，利用原生质体融合技术可以获得具有双亲优良特性的融合子，如1999年清华大学余荔华等将克氏固氮菌和枯草芽孢杆菌进行了原生质体融合，并在室内测定了融合子的生物学性状、生理生化性状以及固氮活性；2002年西北农林科技大学韦革宏等展开苜蓿中华根瘤菌和鹰嘴豆慢生根瘤菌进行原生质体融合相关研究；同年，山东大学金玉娟以及首都师范大学黄勤妮分别进行了芽孢杆菌和欧文氏菌以及大肠杆菌和枯草芽孢杆菌之间原生质体融合的研究。细菌之间的原生质体融合可以克服细菌种属间的差异而实现基因重组。

发明内容

本发明的目的是提供一种融合菌株及其应用。

本发明所提供的融合菌株，是由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259CGMCC No.1451原生质体和根瘤菌(Sinorhizobium sp.)NX2004062 CGMCC No.2883原生质体融合获得的融合子，已于2009年1月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.2885。

中华根瘤菌NX2004062是从宁夏田间分离获得并经生物学和生理生化性状鉴定确认为根瘤菌菌株，该菌的菌落为圆形，乳白色半透明，随着培养时间增长，菌落不断扩展突起，边缘整齐，菌落表面光滑，生长在其上的细胞物质易在液体中分散。光学显微镜下菌为杆状，大多数运动，鞭毛周生，菌大小为0.6-0.8×3-5μm，革兰氏染色后染色均匀，并可见菌被染成红色。中华根瘤菌NX2004062可在苜蓿根际很好地定殖，其与多种紫花苜蓿共生试验结果表明其可与多种紫花苜蓿具有较好的共生效果。

中华根瘤菌NX2004062已于2009年1月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.2883。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC No.1451是从黑龙江克山县大豆田间土壤中分离得到的一株具有广谱杀菌活性的生防菌株，该菌株用作土壤消毒和种子处理对土传和种传病原菌引起的根腐病具有良好防治效果。

枯草芽孢杆菌HL259 CGMCC No.1451和中华根瘤菌NX2004062 CGMCC No.2883菌液可以直接混合使用，但是其在田间应用时，由于二者存在的植株根际竞争和定殖等问题，影响使用效果。

本发明应用原生质体融合技术，成功地将具有高效固氮活性的中华根瘤菌NX2004062 CGMCC No.2883和具有良好生防效果的枯草芽孢杆菌HL259 CGMCCNo.1451进行原生质体融合，从中筛选出具有双亲优良特性，即同时具有固氮和生防双重功效的融合子F17 CGMCC No.2885，为实现高产优质牧草产业提供有效措施，对于促进苜蓿产量、改善其品质和提高其抗逆性等方面具有重要的科学意义和应用价值。将在农业可持续发展以及农业生态基地建设和区域经济的发展中发挥重要作用。

附图说明

图1为四分平板检测培养2天的F17 CGMCC No.2885菌落形态和菌落扩展方式。

图2为四分平板检测培养7天的F17 CGMCC No.2885菌落形态和菌落扩展方式。

图3为融合子F17 CGMCC No.2885的遗传稳定性检测。

图4为苜蓿幼苗在接种了苜蓿根腐病病菌的土壤中出现猝倒。

图5为接种融合子F17 CGMCC No.2885后60d的苜蓿固氮和防病试验结果。

图6为苜蓿植株根部生长和结瘤情况。

具体实施方式

实施例1、融合子F17 CGMCC No.2885的获得

1)中华根瘤菌NX2004062 CGMCC No.2883原生质体的制备

一、根瘤菌(Sinorhizobium sp.)NX2004062 CGMCC No.2883的分离

a、菌株的分离

方法：从宁夏市西夏区芦花镇镇北堡的苜蓿实验地中采取地上部生长旺盛的苜蓿植株，观察其根部着生的根瘤，摘取颜色为粉红色的根瘤置于小采样瓶中，瓶子底部放入无水硫酸钠作为干燥剂。将采取的根瘤带回室内后，用无菌水清洗三次，表面使用3％次氯酸钠消毒5min，然后再用无菌水清洗一次后将根瘤转移至灭菌的吸水纸上，吸干水份。将根瘤放在灭菌的研钵中捣碎，用接种环蘸其汁液，采用细菌划线的方法将其在YMA结晶紫选择培养基(含1g/100000ml结晶紫的YMA培养基)上进行划线，28℃条件下恒温培养24h，选择边缘整齐，乳白色半透明的单菌落接种到YMA(10g甘露醇，酵母粉3g，0.25g K₂HP0₄，0.25g KH₂PO₄，0.2g MgSO₄-H₂O，0.1g NaCl，3g CaCO₃，10g琼脂粉，1L蒸馏水，pH值7.2)固体培养基上。进行生物学和生理生化性状鉴定，并将获得的菌株命名为NX2004062。

b、菌株的鉴定

①显微和超微形态观察

将菌株NX2004062在YMA固体培养基上进行培养，并观察记录。

培养48h后，菌落为圆形，乳白色半透明，随着培养时间增长，菌落不断扩展突起，边缘整齐，菌落表面光滑，生长在其上的细胞物质易在液体中分散。光学显微镜下观察到菌为杆状，大多数运动，鞭毛周生，菌大小为0.6-0.8×3-5μm，革兰氏染色后染色均匀，并可见菌被染成红色。

②生理生化鉴定

将菌株进行生理生化鉴定，鉴定结果如表1所示。

表1、菌株NX2004062鉴定项目及结果

检测项目	NX2004062	标准菌株	检测项目	NX2004062	标准菌株
						革兰氏染色	-	-	酪氨酸产黑色素	-	-
运动性	-	-	淀粉水解	-	-
						接触酶	+	+	马尿酸盐水解	-	-

V-P反应	-	-	柠檬酸盐水解	-	-
						卵黄反应	-	-	硝酸盐还原	-	-
5％氯化钠	+	+	产生吲哚	-	-
						7％氯化钠	-	-	色氨酸脱胺	-	-
10％氯化钠	-	-	酪朊分解	-	-
						葡萄糖产酸	-	-	酪氨酸分解	-	-
D-木糖产酸	+	+	石蕊牛奶	+	+
						阿拉伯糖产酸	+	+	明胶水解	+	+
甘露醇产酸	-	-	固氮能力	+	+
						葡萄糖产黑色素	-	-	结晶紫检测	+	+

注：“+”表示阳性结果；“-”表示阴性结果。

③PCR扩增共生结瘤Box的nodA基因和NifH基因进行鉴定

应用根瘤菌特异性引物，对菌株NX2004062的共生结瘤Box的nodA基因和NifH基因进行PCR扩增。

扩增NodA基因的引物序列如下：nodA-1：5’-TGCRGTGGAARNTRNNCTGGGAAA-3’，nodA-2：5’-GGNCCGTCRTCRAAWGTCARGTA-3’；扩增NifH基因的引物序列如下：nifH-1：5’-AAGTGCGTGGAGTCCGGTGG-3’，nifH-2：5’-GTTCGGCAAGCATCTGCTCG-3’。

以菌株NX2004062的菌液为模板，分别以上述引物进行PCR扩增。

PCR扩增结果表明扩增得到的NodA基因片段的大小接近700bp左右，与目的片断大小一致，扩增得到的NifH基因片段的大小接近700bp左右，与目的片断大小一致。

上述实验结果综合表明，该根瘤菌细胞无芽孢，通常为杆菌，不运动，好氧。革兰氏染色阴性，利用多种碳水化合物，在含碳水化合物培养基上生长时通常产生大量的胞外粘液。不利用柠檬酸盐，溶于氯仿。不生成3-酮基葡萄糖苷。缓慢液化明胶。不水解酪蛋白和洋菜。菌落白色或无色。不利用纤维素和淀粉。能以铵盐、硝酸盐、和大多数氨基酸作为氮源。接触酶反应阳性。

将以上菌株NX2004062的部分生理生化性状检测结果与根瘤菌标准菌株相比较，根据《一般细菌常用鉴定方法》和《根瘤菌属》中的检索表进行检索，可以确定菌株NX2004062的生理生化性状与根瘤菌相应性状较吻合。同时NodA基因和NifH基因的扩增结果，进一步确认生化鉴定结果，鉴定菌株NX2004062为根瘤菌。

二、中华根瘤菌NX2004062 CGMCC No.2883原生质体的制备

挑取活化的中华根瘤菌NX2004062 CGMCC No.2883单菌落接入液体酵母粉甘露醇培养基(YMA)培养基中，28℃，150rmp振荡培养过夜。按1％的比例重新接种于液体YMA培养基中，并加入终浓度为2％的甘氨酸，于相同条件下振荡培养至对数生长前期。向培养物中加入终浓度为0.5μg/ml的青霉素，继续培养至对数生长期。取10ml培养物于离心管中3500rpm离心15min收集菌体，制备原生质体。原生质体的制备方法如下：先用磷酸高渗缓冲溶液(0.6M NaCl，50mM磷酸缓冲液，pH7.2)洗涤菌体一次，再次将菌体悬浮于上述的磷酸高渗缓冲液中，调菌悬液浓度，使得0D₆₀₀达1.0(约1.0×10⁸～10⁹活菌/ml)，分别取等量菌悬液于若干试管中，向其中加入融菌酶，融菌酶的浓度梯度为0.2mg/ml，35℃水浴10～90min，反复冻融，于不同时段取样，镜检原生质体形成情况。镜检结果表明融菌酶浓度为1.0mg/ml，酶解时间60min时，95％以上的细胞成原生质体，此时离心终止酶反应，用磷酸高渗缓冲溶液再次悬浮，-20℃保存备用。

2)枯草芽孢杆菌HL259 CGMCC No.1451原生质体的制备

挑取活化的枯草芽孢杆菌HL259 CGMCC No.1451单菌落接入液体YMA培养液中，28℃，150rpm振荡培养过夜。按1％的比例重新接入液体YMA培养液中振荡培养至对数生长期。取10ml培养物于离心管中3500rpm离心15min收集菌体，制备原生质体。原生质体的制备方法如下：先用磷酸高渗缓冲溶液洗涤菌体一次，再次将菌体悬浮于磷酸高渗缓冲液中，调菌悬液浓度，使得OD₆₀₀达1.0(约1.0×10⁸～10⁹活菌/ml)，分别取等量菌悬液置于若干试管中，向其中加入融菌酶，融菌酶的浓度梯度为0.2mg/ml，35℃水浴10～90min，于不同时段取样，镜检原生质体形成情况。镜检结果表明融菌酶浓度为0.2mg/ml，酶解时间为20min，95％以上的细胞变成原生质体，此时离心终止酶反应，用磷酸高渗缓冲溶液再次悬浮，-20℃保存备用。

3)中华根瘤菌NX2004062 CGMCC No.2883原生质体和枯草芽孢杆菌HL259 CGMCCNo.1451原生质体融合

将1ml中华根瘤菌NX2004062 CGMCC No.2883原生质体悬浮液先置于距紫外灯(15W)18cm处处理10min，使原生质体充分灭活，然后将灭活后的中华根瘤菌NX2004062 CGMCC No.2883原生质体悬浮液与1ml枯草芽孢杆菌HL259 CGMCCNo.1451原生质体悬浮液等体积混合，充分悬浮后静置5min；3500rpm离心15min收集沉淀；向沉淀中加入0.2ml磷酸高渗缓冲液悬浮，加入1.8ml PEG6000和终浓度为5mg/L的融菌酶(上海生工，产品编号LDB0308)，另外再加入新生磷酸钙(0.5％K₂HPO₄，1.0M CaCl₂，分别灭菌，等体积混合)溶液0.2ml，轻轻摇匀，充分悬浮，然后置于紫外灯下28cm处照射90s以诱导重组，37℃静置20min，3000rpm离心15min，收集沉淀，将沉淀充分悬浮于2ml磷酸高渗缓冲液中，取1ml悬浮液加到50℃的半固体再生基本培养基(10g甘露醇，酵母粉3g，0.25g K₂HPO₄，0.25g KH₂PO₄，0.2g MgSO₄-H₂O，0.1g NaCl，3g CaCO₃，5g琼脂粉，0.6M的NaCl，50mM磷酸缓冲液，1L蒸馏水，pH值7.2)中混匀，迅速倾入底层为再生基本培养基(在YMA培养基中加入终浓度为0.6M的NaCl，50mM pH 7.2磷酸缓冲液)的平板上铺平，于28℃恒温箱中培养，7d后观察。

观察结果表明，培养7d后即有单菌落生长，大多数单菌落的表型特征兼有中华根瘤菌NX2004062 CGMCC No.2883和枯草芽孢杆菌HL259 CGMCC No.1451特点，但更接近于枯草芽孢杆菌HL259 CGMCC No.1451，其菌落为圆形，乳白色不透明，随着培养时间延长，菌落变厚凸起，边缘不整齐，菌落表面有皱褶状凸起，但并不干燥，菌落产生浅桔红色的色素，菌体较易在水中分散，光学显微镜下观察为杆状菌体。

将上述单菌落转接于含氯霉素(50μg/ml)抗性平板，28℃恒温培养箱中培养3d后平板上只有部分菌落扩散生长，而且在菌落颜色等表型性状和扩散速度等方面存在很大差异。初步将表型兼有两亲本特点，扩散生长正常的单菌落初步作为中华根瘤菌NX2004062 CGMCC No.2883原生质体和枯草芽孢杆菌HL259 CGMCC No.1451原生质体融合子。

4)中华根瘤菌NX2004062 CGMCC No.2883原生质体和枯草芽孢杆菌HL259 CGMCCNo.1451原生质体融合子的筛选

中华根瘤菌NX2004062 CGMCC No.2883对氯霉素有抗性，而枯草芽孢杆菌HL259CGMCC No.1451则没有，即使含量很低(5μg/ml)时枯草芽孢杆菌HL259 CGMCCNo.1451也不生长。因此可用氯霉素筛选融合子。

将含氯霉素50μg/ml平板分成4份，分别接种中华根瘤菌NX2004062 CGMCCNo.2883、枯草芽孢杆菌HL259 CGMCC No.1451和GFP标记的枯草芽孢杆菌HL259和初步鉴定的融合子进行培养。

培养2d和7d后结果如图1和2所示，初步鉴定的融合子在菌落形态和菌落扩展方式等方面与两亲本均有相似和差异。培养2d后，初步鉴定的融合子的菌落形态和颜色与中华根瘤菌NX2004062 CGMCC No.2883相似，但随着培养时间的延长，菌落表面呈现一定程度的皱缩但并不干燥，而亲本中华根瘤菌NX2004062 CGMCCNo.2883单菌落表面光滑。

图1为培养2d后枯草芽孢杆菌HL259 CGMCC No.1451，中华根瘤菌NX2004062CGMCC No.2883及其融合子F17，GFP标记的枯草芽孢杆菌HL259在氯霉素(50μg/ml)抗性平板上的培养性状比较。其中“A”代表枯草芽孢杆菌HL259 CGMCC No.1451；“B”代表融合子F17；“C”代表GFP标记的枯草芽孢杆菌HL259；“D”代表中华根瘤菌NX2004062 CGMCC No.2883。

图2为培养7d后枯草芽孢杆菌HL259 CGMCC No.1451，中华根瘤菌NX2004062CGMCC No.2883及其融合子F17，GFP标记的枯草芽孢杆菌HL259在氯霉素(50μg/ml)抗性平板上的培养性状比较。其中“A”代表枯草芽孢杆菌HL259 CGMCC No.1451；“B”代表融合子F17；“C”代表GFP标记的枯草芽孢杆菌HL259；“D”代表中华根瘤菌NX2004062 CGMCC No.2883。

GFP标记的枯草芽孢杆菌HL259的构建方法如下：

(1)挑取新长出的HL-259单菌落于5ml LB培养液的试管中，加入18μl 1MMgSO4·7H2O溶液，于33℃，180rpm过夜摇培；将过夜培养物以1∶20的比例接入HL259感受态细胞培养基GE中继续摇培。培养基GE的组份为：葡萄糖50.5μM、谷氨酸钾9.8μM、pH7.0的磷酸缓冲液100mM、柠檬酸三钠3mM、MgSO4·7H2O 3mM、柠檬酸铁铵45μM、色氨酸245μM，补足重蒸水100ml。

(2)开始摇培3.5hr时第一次取0.5mlGE摇培液于1.5ml eppendorf管中，之后每15min取样一次，共取四次，备用。

(3)分别使用以上不同时间段制备好的0.5mlGE新鲜感受态细胞，加入90μlpGFP22质粒(绿色荧光蛋白基因标记野生型生防枯草芽孢杆菌的研究，生物工程学报，2003年19卷5期，页码：P551-556，作者：姚震生，陈中义等)(中国农业大学)的ddH2O溶液于其中，并向1.5ml eppendorf管再加入0.8ml LB培养液，上下颠倒充分混匀，置于37℃水浴中30min。

(4)将0.2ml混合物涂布于含5μg/ml氯霉素(购自北京友谊中联生物科技工程公司)的抗性YMA平板上，33℃培养过夜，观察菌落生长情况；采用365nm UV激发，肉眼直接进行HL259菌株发光表型观察，进行转化子的酶切鉴定后确认gfp基因已经成功转化至HL259上，命名带有绿色荧光标记的菌株为GFP-HL259，该菌株可以在含有5μg/ml的氯霉素YMA平板上正常生长。

5)中华根瘤菌NX2004062 CGMCC No.2883原生质体和枯草芽孢杆菌HL259 CGMCCNo.1451原生质体融合子遗传稳定性测定

原生质体融合过程中，在形成融合子的同时也会产生一些异核体或二倍体，它们会在融合子检出与筛选时产生假阳性现象。用普通YMA平板继代培养和氯霉素抗性平板筛选检测其遗传稳定性。将初步鉴定的融合子在无抗性(不含氯霉素)平板上连续继代培养10代，然后在抗性平板上进行检测，能正常生长的被认为具有遗传稳定性。

试验结果如图3所示，表明初步鉴定的融合子在普通YMA平板上生长正常，生长速度和菌落表型性状等方面没有表现出很大差异。继代培养10代后，将这些单菌落转接到含有氯霉素的抗性平板上培养5d后观察，各个菌落之间在菌落表型特征上呈现出差异：一部分单菌落能够正常生长扩展，另一部分生长扩展缓慢，还有一部分不能生长扩展成菌落。在氯霉素抗性选择平板上生长缓慢或者不能正常生长扩展的菌落，可能是异核体或二倍体，不是融合子；能正常生长扩展为单菌落的进一步确定为融合子，并认为具有稳定的遗传特性，试验获得有稳定的遗传特性融合子F17、F18、F21、F22和F24。

6)融合子F17的鉴定

细菌的菌落形态、菌落扩展方式、革兰氏染色、芽孢染色及其各项生理生化测定指标都是确定其分类地位的重要依据。16S rRNA序列在属水平上具有很高的保守性，是目前细菌分类的重要参考标准。全细胞可溶性蛋白是其基因表达的产物，电泳图谱在一定程度上能反映细菌之间的亲缘关系。

本发明根据《一般细菌常用方法》、《芽孢杆菌属》及《革兰氏阴性杆菌编码鉴定手册》中提供的检测方法对供试菌中华根瘤菌NX2004062 CGMCC No.2883和枯草芽孢杆菌HL259 CGMCC No.1451以及它们的融合子F17的多项生理生化指标进行了测定进一步确定融合子F17的分类地位。

枯草芽孢杆菌为有芽孢椭圆形或柱状、中生或偏中生、运动，革兰氏阳性，接触酶试验阳性，V-P试验阳性，质量百分含量为5％-10％氯化钠中生长，在葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和甘露醇产酸，水解淀粉，利用柠檬酸盐作为碳源，还原硝酸盐成亚硝酸盐，分解酪素，石蕊牛奶产碱胨化，卵黄反应阴性，在葡萄糖和酪氨酸洋菜上不形成黑色素，不水解马尿酸盐，不利用丙酸盐和不分解酪氨酸。

生理生化指标实验结果表明，融合子F17的各项生理生化性状中大多与枯草芽孢杆菌HL259 CGMCC No.1451相同，而在固氮培养液生长和结晶紫培养基检测试验中与中华根瘤菌NX2004062 CGMCC No.2883表现相同，在V-P试验中F17反应呈现出介于二亲本之间的浅红色反应现象。

全细胞可溶性蛋白定性分析结果表明，融合子F17的聚丙烯酰氨凝胶电泳图谱与枯草芽孢杆菌HL259 CGMCC No.1451更为相似。

枯草芽孢杆菌HL259 CGMCC No.1451、中华根瘤菌NX2004062 CGMCC No.2885及融合子F17的16S rRNA序列分析试验结果表明：融合子F17的16S rRNA序列为序列表中的序列3，枯草芽孢杆菌HL259 CGMCC No.1451的16S rRNA序列为序列表中的序列1，中华根瘤菌NX2004062 CGMCC No.2883的16S rRNA序列为序列表中的序列2。融合子F17和枯草芽孢杆菌HL259 CGMCC No.1451有较近的亲缘关系，16SrRNA序列同源性达89.68％；而融合子F17与中华根瘤菌NX2004062 CGMCC No.2883的16S rRNA序列同源性仅为62.44％。16SrRNA基因序列进行同源性比较结果表明，枯草芽孢杆菌HL259 CGMCC No.1451和融合子F17分别与GenBank中芽孢杆菌Bacilius subtilis strain 1.504的16S rRNA基因序列同源性达到99.52％和92.56％，初步确定融合子F17为芽孢杆菌属(Bacillus)。

枯草芽孢杆菌HL259和根瘤菌NX2004062原生质体融合菌F17已于2009年1月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCCNo.2885。

实施例2、F17 CGMCC No.2885的防病和固氮效果

1)F17 CGMCC No.2885的抑菌作用

牛津杯法测定枯草芽孢杆菌HL259 CGMCC No.1451和融合子F17 CGMCC No.2885对12种植物病原真菌和6株植物病原细菌的抑菌作用。12种植物病原真菌为番茄叶霉病菌(Cladosporium fulvum)、番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)、苹果腐烂病菌(Valsa mali)、苹果轮纹病菌(Physalospora piricola)、玉米弯孢菌叶斑病(Curvularia lunata)、棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae)、棉花枯萎病菌(F.oxysporum f.sp.vasinfectum)、小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealia)、水稻稻瘟菌(Piricularia oryzae)、茄病镰刀菌(Fusarium solani)、苜蓿根腐病镰刀菌(Fusarium avenaceam)和番茄早疫病菌(Alternaria solani)。6株植物病原细菌为马铃薯软腐病菌(Erwinia carotovora)，根癌病菌(Agrobacteriumrhizogene)，黄瓜角斑病菌(Pseudomonas syringae)，棉花角斑病菌(Xanthomonasmalvacearum)，番茄溃疡病(Clavibacter michiganensis subsp.Michiganensis，简称Cmm)，茄青枯病菌Ralstonia solanacearum.

牛津杯法的具体步骤如下：

A.融合子F17 CGMCC No.2885对真菌和卵菌的抑菌作用

采用平板培养法，融合子F17在LB培养基斜面28℃下活化，培养48h后，用0.85％生理盐水制成菌悬液，用麦克比浊法确定最终菌悬液浓度为10⁹cfu/mL，备用。供试真菌在PDA平板上25℃活化5d，使其形成一定直径菌落，用打孔器(Φ5mm)制取菌饼，将菌丝面朝下接菌于PDA平板中央。将高温灭菌的牛津杯(Φ8.5mm)分别均匀摆放在PDA平板上，并在每个牛津杯内加入100μL的菌悬液，以牛津杯内加入100μL的无菌水的PDA平板为对照，每皿4个，距离均匀，每个处理4次重复，25℃下黑暗培养4、5、6d、7d后分别测量真菌菌落扩展直径(菌落扩展直径＝菌落直径-菌饼直径)，并计算抑制生长率。

测定实验结果见表1，枯草芽孢杆菌HL259 CGMCC No.1451和融合子F17 CGMCCNo.2885对番茄叶霉病菌，番茄灰霉病菌，棉花黄萎病菌和苜蓿根腐病镰刀菌均有很好的抑制作用，抑制率均在在70％以上；对小麦纹枯病菌，棉花枯萎病菌，玉米弯孢菌，苹果轮纹病菌的抑制率均大于50％；对番茄早疫病菌，水稻稻瘟菌，苹果腐烂病菌，茄病镰刀菌的抑制率在39-48％。上述结果表明枯草芽孢杆菌HL259 CGMCCNo.1451和融合子F17 CGMCC No.2885均具有广谱杀菌活性。

表1.牛津杯法测定亲本菌株HL259和融合子F17对供试病原真菌的抑制效果

B.融合子F17 CGMCC No.2885对细菌的抑菌作用

将融合子F17和靶标细菌活化48h后制成菌悬液，用麦克比浊法将菌悬液调整到1.5×10⁹cfu/mL，吸取0.1mL靶标菌菌悬液加到培养基平板上用涂布铲铺平。将牛津杯放在培养基上，在每个牛津杯内加入100μL的菌悬液，以牛津杯内加入100μL的无菌水的平板为对照，每皿4个，距离均匀，每个处理4次重复。培养皿在4℃下保存16h后，移至28℃培养箱内，在黑暗条件下培养24h~48h，测量抑菌圈直径。

测定实验结果见表2，表明，融合子F17及其亲本菌株HL259均对马铃薯软腐、水稻白叶枯、K27这三种病原细菌有较好的抑制效果；对番茄溃疡、茄青枯、番茄疮痂、棉花角斑有效果，但抑制不明显。对黄瓜角斑几乎无效。

表2.亲本菌株HL259和融合子F17对供试病原细菌的抑制作用

注：牛津杯的直径为0.85m；

2)F17 CGMCC No.2885对苜蓿根腐病的防治

将沙子、田间自然土壤和草炭分别进行灭菌处理，然后按沙∶土∶草炭＝6∶2∶1的比例充分混合，制成混合土壤。将已接种苜蓿镰刀根腐病菌的玉米沙在25℃-28℃的条件下培养7d后，按照1∶20(玉米沙∶混合土壤的比例，将其充分与上述土壤混匀。加入3/4体积的接种苜蓿镰刀根腐病菌的混合土壤于容积13cm×13cm×13cm的塑料花盆中。挑选发芽一致的已分别经浓度为10⁹cfu/mL的枯草芽孢杆菌HL259 CGMCC No.1451、融合子F17、中华根瘤菌NX2004062 CGMCCNo.2883菌悬液浸种30min后的苜蓿种子(品种为CW787)，用无菌镊子夹取，植入装有混合土壤的花盆中，每盆种植10粒发芽一致的种子。分别再向其中加入相应菌液(枯草芽孢杆菌HL259 CGMCC No.1451、融合子F17或中华根瘤菌NX2004062CGMCC No.288)5mL，使各个处理每个重复中含菌量达到5.0×10¹⁰cfu。并设置无菌水浸种的处理作为对照，每个处理设3个重复。接种完毕将其转入温室条件下生长培养，播种7d后统计紫花苜蓿CW787不同接种处理的出苗率和发病率。

防治效果结果表明，融合子F17 CGMCC No.2885以及亲本枯草芽孢杆菌HL259CGMCC No.1451对苜蓿根腐病有很好的防治效果，对照的出苗率仅在70％左右，而融合子F17 CGMCC No.2885和枯草芽孢杆菌HL259 CGMCC No.1451处理的苜蓿出苗率都在100％；对照和中华根瘤菌NX2004062 CGMCC No.2883处理的苜蓿幼苗猝倒率分别为33.3％和32.7％，融合子F17 CGMCC No.2885和枯草芽孢杆菌HL259 CGMCCNo.1451处理幼苗生长健康，无猝倒现象；收获时对照和中华根瘤菌NX2004062CGMCC No.2883处理苜蓿根部呈现不同程度的变褐发病状况，而融合子F17 CGMCCNo.2885和枯草芽孢杆菌HL259 CGMCC No.1451处理的苜蓿根部几乎没有病害发生，表明融合子F17 CGMCC No.2885和枯草芽孢杆菌HL259 CGMCC No.1451均具有良好的防病保苗效果。

图4所示为对照出苗率低以及幼苗出现猝倒。

3)融合子F17 CGMCC No.2885与苜蓿共生的温室盆栽试验

沙子、田间自然土壤和草炭分别进行灭菌处理，然后按沙∶土∶草炭＝6∶2∶1的比例充分混合均匀，制成混合土壤，将已接种苜蓿镰刀根腐病菌的玉米沙在25℃-28℃的条件下培养7d后，按照1∶20(玉米沙∶混合土壤)的比例，将其充分与上述土壤混匀。在容积30cm×30cm×30cm的塑料花盆中加入3/4体积的接种苜蓿镰刀根腐病菌的混合土壤。紫花苜蓿种子(品种为CW787)分别用浓度为10⁹cfu/mL的枯草芽孢杆菌HL259 CGMCC No.1451、融合子F17、中华根瘤菌NX2004062 CGMCCNo.2883菌悬液浸种30min后进行接种处理，并设置不接种任何菌的处理作为对照，每个处理设3个重复。挑选发芽一致的苜蓿种子，用无菌镊子夹取，植入装有无菌混合土壤的花盆中，每盆种植25粒。分别再向其中加入相应菌液(枯草芽孢杆菌HL259 CGMCC No.1451、融合子F17或中华根瘤菌NX2004062 CGMCC No.288)15mL，使各个处理每个重复中含菌量达到5×10¹⁰cfu/mL。接种完毕将其转入田间自然条件下生长培养。

播种45d后测定各个处理的叶绿素含量；播种60d后收获，测量各处理植株的株高、根长、观察根部发育状况，测量地上部分和地下部分生物量，测量固氮酶活性，明确供试融合子的防病和促生效果。

叶绿素含量测定：盆栽试验至45d时，随机从每个处理摘取24片叶，每个重复8片。称量叶片的鲜重后立即装入含有95％乙醇的10mL螺口刻度试管中。在85℃水浴中处理0.5h-1h至叶片完全失绿，然后定容至10mL，以95％乙醇做参比液，分别测定它们在645nm和663nm处的吸光值，根据公式，可以计算出叶片叶绿素C的含量：

固氮酶活性测定：将一个重复的所有植株根部(包括所有根瘤)剪下，用水冲洗干净，并用吸水纸吸干。立即置入100mL玻璃瓶中，将橡皮塞塞紧；用注射器抽出10mL空气，然后注入10mL乙炔，28℃下反应1h。反应完成后，同时用注射器抽出10mL反应气体注入备好的小瓶中备用。立即将所有的根瘤剪下，统计瘤数，测量鲜重。用微量进样器吸取反应后气体100uL在气相色谱仪上测定乙烯峰值。在同样条件下按照以下比例：纯乙炔；纯乙炔和纯乙烯按体积比10000∶1混合；纯乙炔和纯乙烯按体积比1000∶1混合；纯乙炔和纯乙烯按体积比100∶1混合；纯乙炔和纯乙烯按体积比10；1混合；纯乙炔和纯乙烯按体积比1∶1混合；纯乙炔和纯乙烯按体积比1∶10混合；纯乙炔和纯乙烯按体积比1∶100混合；纯乙炔和纯乙烯按体积比1∶1000混合；纯乙炔和纯乙烯按体积比1∶1000混合；纯乙炔和纯乙烯按体积比1∶10000混合；纯乙烯，绘制标准曲线。由此计算不同处理根瘤菌样品的固氮酶活性。

亲本中华根瘤菌NX2004062 CGMCC No.2883和融合子F17 CGMCC No.2885与苜蓿CW787有很好的共生效果(表3)。在苜蓿植株地上和地下部分生物量、固氮酶活性、叶绿素含量、根瘤数量、根留重等测定指标上，中华根瘤菌NX2004062 CGMCCNo.2883和融合子F17 CGMCC No.2885处理明显优于对照和其他几个处理。其中，融合子F17 CGMCC No.2885处理的地上部分鲜重较对照净增约1.68倍，地上部分干重较对照净增约1.63倍，地下部分鲜重较对照净增约2.14倍，地下部分干重较对照净增约1.75倍。中华根瘤菌NX2004062 CGMCC No.2883处理也高于对照，但是低于融合子F17 CGMCC No.2885处理。播种后45天，对照的叶绿素含量值是2.0319，枯草芽孢杆菌HL259 CGMCC No.1451处理的苜蓿的叶绿素含量最低，为1.9240，融合子F17 CGMCC No.2885处理的苜蓿的叶绿素含量最高，为2.5621。中华根瘤菌NX2004062 CGMCC No.2883、枯草芽孢杆菌HL259 CGMCC No.1451和融合子F17 CGMCC No.2885处理的苜蓿的固氮酶活性均高于对照，其中融合子F17 CGMCCNo.2885处理的苜蓿的固氮酶活性最高，为对照的1.97倍。融合子F17 CGMCCNo.2885处理的苜蓿株高比对照净增35.57％，根长较对照净增最多为13.82％，且主根粗而长、侧根和须根旺盛、根瘤也很多；对照植株根部主根较细、侧根和须根少、几乎没有根瘤(图6)；枯草芽孢杆菌HL259 CGMCC No.1451处理稍优于对照相当，侧根较对照多。融合子F17 CGMCC No.2885对紫花苜蓿CW787植株生长表现为促进作用(图5)。

图6中，“A”为对照的根，“B”为中华根瘤菌NX2004062 CGMCC No.2883处理的紫花苜蓿CW787的根，“C”枯草芽孢杆菌HL259 CGMCC No.1451处理的紫花苜蓿CW787的根，“D”融合子F17 CGMCC No.2885处理的紫花苜蓿CW787的根。

表3融合子F17与紫花苜蓿CW787的共生效果

苜蓿生长受到多种因素制约，其中病害防治和肥料利用是重要的两个环节。根腐病是一种防治难度较大的根部病害，一旦发生就可能给苜蓿生产带来惨重损失。氮肥是苜蓿生长所需的大量元素，对植株的生长发育具有较大影响。单纯的生防菌和单纯的固氮根瘤菌均不能完美的解决这些问题，枯草芽孢杆菌HL259 CGMCCNo.1451是一株对苜蓿根腐病具有良好防治效果的生防菌，中华根瘤菌NX2004062CGMCC No.2883具有高效固氮活性，二者原生质体融合后的产物融合子F17 CGMCCNo.2885兼有固氮和防病的特点。实验结果表明，融合子F17 CGMCC No.2885是一株具有高效固氮和防病活性的工程菌资源。

序列表

<110>中国农业大学

<120>一种融合菌株及其应用

<160>2

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<230>

<400>1

aagtgcgtgg agtccggtgg                                        20

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<230>

<400>2

gttcggcaag catctgctcg                                        20

Claims (5)

1、一种融合菌株，是由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC No.1451原生质体和根瘤菌(Sinorhizobium sp.)NX2004062 CGMCC No.2883原生质体融合获得的融合子。

2、根据权利要求1所述的融合菌株，其特征在于：所述融合菌株的保藏编号为CGMCC No.2885。

3、权利要求1或2所述的融合菌株在苜蓿固氮中的应用。

4、权利要求1或2所述的融合菌株在苜蓿病害防治中的应用。

5、权利要求1或2所述的融合菌株在苜蓿固氮和病害防治中的应用。

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