CN101054552A - 一种微生物复合菌剂及其制备方法与应用 - Google Patents

一种微生物复合菌剂及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种微生物复合菌剂及其制备方法与应用。该菌剂由一次发酵菌剂和二次发酵菌剂组成，一次发酵菌剂的活性成分为水生栖热菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜热球杆菌、强壮类芽孢杆菌和酸热芽孢杆菌中的一株或几株菌的组合，每株菌20－100份；二次发酵菌剂的活性成分为巴氏芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、液化金杆菌、乳微杆菌、特氏盐芽孢杆菌、红霉素气微菌和产黄纤维单胞菌中的一株或几株嗜温木质纤维素降解细菌，以及绿色木霉、里氏木霉和黑曲霉中的一株或几株嗜温木质纤维素降解真菌的组合，每株菌10－50份。本发明将在农业固体废物和园林绿化废物等木质纤维素含量高的木质纤维素类废物的减量化和资源化处理，特别是堆肥处理中发挥重要作用，应用前景广阔。

Description

一种微生物复合菌剂及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及微生物复合菌剂及其制备方法与应用，特别是涉及一种微生物复合菌剂及其制备方法与其作为接种菌剂在对木质纤维素类废物进行堆肥中的应用。
背景技术
西方发达国家和我国台湾地区较早开展了堆肥复合菌剂的研制开发工作，但主要以禽畜粪便的发酵添加剂和复合肥菌剂为主。近年来，生活垃圾微生物降解菌剂产品的开发在发达国家成为热点，有些产品已实现商业化，但是，对于处理我国农业固体废物及城市垃圾，这些产品的适用性和效果还有待于进一步研究和验证。尤其是对于产量大、成分复杂、木质纤维素含量高的农业固体废物和城市园林绿化废物，其资源化利用需要专用的高效微生物接种剂，而我国对于环保型微生物菌剂的研究和应用相对滞后，在固体废物微生物处理研究方面还处于起步阶段。
好氧堆肥是农业固体废物、城市园林绿化废物及生活垃圾资源化和无害化处理的重要手段。堆肥技术是将有机固体废物与填充料按一定的比例混合，在合适的水分、pH、氧气、碳氮比的条件下，使微生物繁殖而降解有机质，并产生高温，可杀死其中的病原菌及杂草种子，使有机物达到稳定化的技术。在好氧堆肥过程中，只依靠堆肥底物中原有的土著微生物很难有效地分解堆肥物料中木质纤维素等降解缓慢的有机成分，因而需要引入特定的外源微生物，以加速堆肥的腐熟过程，协调具有不同降解能力的物料的降解进程。在堆肥腐熟过程中，纤维素的分解是关键，原因在于：(1)纤维素是含量最高，占植物干物质的40-60％，且分解缓慢的不含氮有机物；(2)纤维素的破坏意味着细胞物质的解体和无形体物质的产生，这是堆肥腐熟过程中的最重要的物理性状变化。因此，包括人工接种在内的各种加速纤维素分解技术都具有积极意义。但是，目前为止，好氧堆肥微生物接种菌剂的研究仍局限于实验阶段，并没有应用于大规模生产，究其原因有以下两点：1、好氧堆肥过程是一个复杂的微生物反应，其中涉及到多种细菌、放线菌和真菌的参与，对于反应的动力学过程，还没有完善的理论基础，难以对整个过程加以人为控制；2、对于堆肥接种剂，尤其是纤维素降解菌剂的扩大生产工艺，还未进行深入细致的研究，无法大量生产接种剂，而进行大规模堆肥生产的微生物接种需要大量的微生物菌剂。当前是以刚果红培养基作为选择性培养基，纤维素滤纸条发酵培养基或LB培养基作为增殖培养基，滤纸条培养基作为检测培养基对这些菌剂进行培养，但是，仅仅依靠实验室富集培养而获得的菌剂难以满足生产需要。
发明内容
本发明的目的是提供一种可加速木质纤维素降解和腐熟，适用于对农业固体废物、城市园林废物等木质纤维素类废物进行好氧堆肥处理的微生物复合菌剂。
本发明所提供的微生物复合菌剂，由适用于堆肥过程中高温发酵阶段(一次发酵)的一次发酵菌剂(简称1#菌剂)和适用于堆肥过程中常温/降温发酵阶段(二次发酵)的二次发酵菌剂(简称2#菌剂)组成，所述一次发酵菌剂的活性成分为水生栖热菌(Thermus aquaticus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、嗜热球杆菌(Sphaerobacter thermophilum)、强壮类芽孢杆菌(Paenibacillus validus)和酸热芽孢杆菌(Bacillus acidocaldarius)中的一株或几株菌的组合，每株菌20-100份；所述二次发酵菌剂的活性成分为巴氏芽孢杆菌(Bacillus pasteurii)、腊状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、液化金杆菌(Aurceobacterium liquefaciens)、乳微杆菌(Microbacterium lactium)、特氏盐芽孢杆菌(Halobacillus truepori)、红霉素气微菌(Aeromicrobium erythreum)和产黄纤维单胞菌(Cellulomonasflavigena)中的一株或几株嗜温木质纤维素降解细菌，以及绿色木霉(Trichodermaviride)、里氏木霉(Trichoderma reesei)和黑曲霉(Aspergillus niger)中的一株或几株嗜温木质纤维素降解真菌的组合，每株菌10-50份。
可按照所要处理的木质纤维素类废物(如秸秆、饼粕等农业废弃物)的成分，以及用该菌剂进行好氧堆肥处理所要达到的理化指标，对上述菌株进行搭配组合。
上述菌株的选择是广泛的，均可从商业途径购买到，如购自中国科学院微生物所、美国菌种保藏中心(ATCC)或德国菌种保藏中心(DSMZ)等。例如：所述水生栖热菌(Thermus aquaticus)可选自保藏于ATCC的编号分别为No.25104，25105和31558中的一株或几株；所述巴氏芽孢杆菌(Bacillus pasteurii)可选自保藏于ATCC的编号分别为No.11859，6452，6453和700386中的一株或几株；所述腊状芽孢杆菌(Bacillus cereus)可选自保藏于中国科学院微生物所的编号分别为No.1.126，1.173，1.229，1.230，1.895，1.932，1.1483，1.1626，1.1686，1.1687，1.1688，1.1689，1.1846，以及保藏于ATCC的编号分别为No.10702，10792，10876，11950，12480，12826，13061，13366，13472，13824，14603，14737，14893，15816，15817和19637中的一株或几株；所述液化金杆菌(Microbacterium liquefaciens)可选自保藏于中国科学院微生物所的编号为No.1.1934，保藏于ATCC的编号为No.43647，以及保藏于DSMZ的编号为No.20637中的一株或几株；所述乳微杆菌(Microbacteriumlacticum)可选自保藏于中国科学院微生物所的编号为No.1.1911，保藏于ATCC的编号为No.8180，以及保藏于DSMZ的编号为No.20172中的一株或几株；所述特氏盐芽孢杆菌(Halobacillus trueperi)可为保藏于DSMZ的编号为No.10404的菌株；所述红霉素气微菌(Aeromicrobium erythreum)可为保藏于ATCC的编号为No.51598的菌株；所述产黄纤维单胞菌(Cellulomonas flavigena)可选自保藏于中国科学院微生物所的编号为No.1.1002，1.1941，以及保藏于ATCC的编号为No.482中的一株或几株；所述绿色木霉(Trichoderma viride)可选自保藏于中国科学院微生物所的编号为No.3.1044，3.1913，3.2196，3.2876，3.2941，3.2942，3.3711，3.3744，3.4005，3.4264，以及保藏于ATCC的编号为No.20476，24449，26920，26921，28217，32086，32173，10043，10044，10045，12582，13233，13234和16325中的一株或几株；所述里氏木霉(Trichoderma reesei)可选自保藏于ATCC的编号为No.46480，46481，56763，56764，56766，56767，58350，58351，58352，58353，60787，66137，66587，66588，66589和56765中的一株或几株；所述黑曲霉(Aspergillus niger)可选自保藏于中国科学院微生物所的编号为No.3.40，3.315，3.316，3.421，3.429，3.739，3.769，3.795，3.877，3.879，3.958，3.1858，3.2760，3.2915，3.3882，3.3883，3.3902，3.3927，3.3928，3.4304，3.4309，3.4463，3.4523，3.4627，3.4628，以及保藏于ATCC的编号为No.1015，10249，10553，10574，10576，10577，10578，10579，10581，10594，10864，11384，11414，12846，13004，13496，13497，15475，16508，16220，16880，200072，200344，200345，20057，200930，20107和201122中的一株或几株；所述嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)可选自保藏于中国科学院微生物所的编号为No.1.1865，1.1866，1.1923，以及保藏于ATCC的编号为12976，12977，12979，15951，15952，21365，29492，29609，31195，31196，31197，31198，31199，31783，39536，43040和43513中的一株或几株；所述嗜热球杆菌(Sphaerobacter thermophilus)可为保藏于ATCC的编号为No.49802的菌株；所述强壮类芽孢杆菌(Paenibacillus validus)可为保藏于ATCC的编号为No.43897的菌株；所述酸热芽孢杆菌(Bacillus acidocaldarius)可选自保藏于ATCC的编号为No.27009，43030，43031，43032，43033，43034，43035和49025中的一株或几株。
所述菌剂既可以是固态，也可以是液态的。
本发明的第二个目的是提供一种上述微生物复合菌剂的制备方法。
本发明所提供的液态型一次发酵菌剂的制备方法，是将水生栖热菌(Thermusaquaticus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、嗜热球杆菌(Sphaerobacter thermophilum)、强壮类芽孢杆菌(Paenibacillus validus)和酸热芽孢杆菌(Bacillus acidocaldarius)中的一株或几株菌的组合接种于液态发酵专用培养基中，每株菌取20-100份，在25-35℃下连续曝气培养，得到液态型一次发酵菌剂；所述液态型二次发酵菌剂的制备方法，是将巴氏芽孢杆菌(Bacilluspasteurii)、腊状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、液化金杆菌(Aurceobacteriumliquefaciens)、乳微杆菌(Microbacterium lactium)、特氏盐芽孢杆菌(Halobacillustruepori)、红霉素气微菌(Aeromicrobium erythreum)和产黄纤维单胞菌(Cellulomonas flavigena)中的一株或几株嗜温木质纤维素降解细菌，以及绿色木霉(Trichoderma viride)、里氏木霉(Trichoderma reesei)和黑曲霉(Aspergillusniger)中的一株或几株嗜温木质纤维素降解真菌的组合接种于液态发酵专用培养基中，每株菌取10-50份，在25-35℃下连续曝气培养，得到液态型二次发酵菌剂；所述液态发酵专用培养基的配方为：质量/体积百分比浓度为50-100％的豆浆15-25mL(优选为20mL)，葡萄糖10-30g(优选为20g)，加水至1L，pH 6.8-7.2(优选为7.0)。
本发明所提供的固态型一次发酵菌剂的制备方法，是将水生栖热菌(Thermusaquaticus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、嗜热球杆菌(Sphaerobacter thermophilum)、强壮类芽孢杆菌(Paenibacillus validus)和酸热芽孢杆菌(Bacillus acidocaldarius)中的一株或几株菌的组合接种于固态发酵专用培养基中，每株菌取20-100份，在25-35℃下培养，得到固态型一次发酵菌剂；所述液态型二次发酵菌剂的制备方法，是将巴氏芽孢杆菌(Bacillus pasteurii)、腊状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、液化金杆菌(Aurceobacterium liquefaciens)、乳微杆菌(Microbacterium lactium)、特氏盐芽孢杆菌(Halobacillus truepori)、红霉素气微菌(Aeromicrobium erythreum)和产黄纤维单胞菌(Cellulomonasflavigena)中的一株或几株嗜温木质纤维素降解细菌，以及绿色木霉(Trichodermaviride)、里氏木霉(Trichoderma reesei)和黑曲霉(Aspergillus niger)中的一株或几株嗜温木质纤维素降解真菌的组合接种于固态发酵专用培养基中，每株菌取10-50份，在25-35℃下培养，得到固态型二次发酵菌剂；所述固态发酵专用培养基的配方为：锯末70-90份(优选80份)，米糠8-12份(优选10份)，麸皮8-12份(优选10份)，(NH4)2SO4 1-2份(优选1.5份)，KH2PO4 0.1-1份(优选0.5份)，加水至含水量达50-60％，pH 6.8-7.2(优选为7.0)。
可按照所要处理的木质纤维素类废物(如秸秆、饼粕等农业废弃物)的成分，以及用该菌剂进行好氧堆肥处理所要达到的理化指标，对上述菌株进行搭配组合。
上述菌株的选择是广泛的，均可从商业途径购买到，如购自中国科学院微生物所、美国菌种保藏中心(ATCC)或德国菌种保藏中心(DSMZ)等。例如：所述保水生栖热菌(Thermus aquaticus)可选自保藏于ATCC的编号分别为No.25104，25105和31558中的一株或几株；所述巴氏芽孢杆菌(Bacillus pasteurii)可选自保藏于ATCC的编号分别为No.11859，6452，6453和700386中的一株或几株；所述腊状芽孢杆菌(Bacillus cereus)可选自保藏于中国科学院微生物所的编号分别为No.1.126，1.173，1.229，1.230，1.895，1.932，1.1483，1.1626，1.1686，1.1687，1.1688，1.1689，1.1846，以及保藏于ATCC的编号分别为No.10702，10792，10876，11950，12480，12826，13061，13366，13472，13824，14603，14737，14893，15816，15817和19637中的一株或几株；所述液化金杆菌(Microbacterium liquefaciens)可选自保藏于中国科学院微生物所的编号为No.1.1934，保藏于ATCC的编号为No.43647，以及保藏于DSMZ的编号为No.20637中的一株或几株；所述乳微杆菌(Microbacteriumlacticum))可选自保藏于中国科学院微生物所的编号为No.1.1911，保藏于ATCC的编号为No.8180，以及保藏于DSMZ的编号为No.20172中的一株或几株；所述特氏盐芽孢杆菌(Halobacillus trueperi)可为保藏于DSMZ的编号为No.10404的菌株；所述红霉素气微菌(Aeromicrobium erythreum)可为保藏于ATCC的编号为No.51598的菌株；所述产黄纤维单胞菌(Cellulomonas flavigena)可选自保藏于中国科学院微生物所的编号为No.1.1002，1.1941，以及保藏于ATCC的编号为No.482中的一株或几株；所述绿色木霉(Trichoderma viride)可选自保藏于中国科学院微生物所的编号为No.3.1044，3.1913，3.2196，3.2876，3.2941，3.2942，3.3711，3.3744，3.4005，3.4264，以及保藏于ATCC的编号为No.20476，24449，26920，26921，28217，32086，32173，10043，10044，10045，12582，13233，13234和16325中的一株或几株；所述里氏木霉(Trichoderma reesei)可选自保藏于ATCC的编号为No.46480，46481，56763，56764，56766，56767，58350，58351，58352，58353，60787，66137，66587，66588，66589和56765中的一株或几株；所述黑曲霉(Aspergillus niger)可选自保藏于中国科学院微生物所的编号为No.3.40，3.315，3.316，3.421，3.429，3.739，3.769，3.795，3.877，3.879，3.958，3.1858，3.2760，3.2915，3.3882，3.3883，3.3902，3.3927，3.3928，3.4304，3.4309，3.4463，3.4523，3.4627，3.4628，以及保藏于ATCC的编号为No.1015，10249，10553，10574，10576，10577，10578，10579，10581，10594，10864，11384，11414，12846，13004，13496，13497，15475，16508，16220，16880，200072，200344，200345，20057，200930，20107和201122中的一株或几株；所述嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)可选自保藏于中国科学院微生物所的编号为No.1.1865，1.1866，1.1923，以及保藏于ATCC的编号为12976，12977，12979，15951，15952，21365，29492，29609，31195，31196，31197，31198，31199，31783，39536，43040和43513中的一株或几株；所述嗜热球杆菌(Sphaerobacter thermophilus)可为保藏于ATCC的编号为No.49802的菌株；所述强壮类芽孢杆菌(Paenibacillus validus)可为保藏于ATCC的编号为No.43897的菌株；所述酸热芽孢杆菌(Bacillus acidocaldarius)可选自保藏于ATCC的编号为No.27009，43030，43031，43032，43033，43034，43035和49025中的一株或几株。
此外，在上述液态型和固态型菌剂的制备方法中，接种量可为5-15％，优选为10％；培养温度优选为30℃，培养时间优选为36-72小时，尤其优选为48小时。
本发明提供了一种微生物复合菌剂及其制备方法。该复合菌剂具有以下特点：1)由一次发酵菌剂(1#菌剂)和二次发酵菌剂(2#菌剂)组成，其中1#复合菌剂由经过特选、优化的嗜热木质纤维素降解细菌组成，能够耐受75℃以上的高温，并在高温下发挥木质纤维素的降解能力，且生长速度比自然状态的菌种要快得多，从而可在短时间内快速定殖，竞争性地成为堆肥中的优势菌种；所用嗜温木质纤维素降解细菌则能够在45℃以下的中温和常温阶段发挥木质纤维素降解能力，从而加速中间产物的矿化和腐殖化过程。在高温阶段使用一次发酵菌剂，可提高高温期堆肥中木质纤维素分解菌的种群密度，促进该阶段木质纤维素的生物转化，在降温和稳定阶段使用二次发酵菌剂，可通过增加嗜温木质纤维素分解菌种群密度以增强常温阶段的木质纤维素的后续性降解以及对中间产物的矿化和转化(腐殖化)。2)本发明的微生物复合菌剂可作为接种剂，用于蔬菜废物、花卉秸秆等农业固体废物以及枯枝落叶、剪枝杂草等园林绿化废物的农业固体废物和园林绿化废物等木质纤维素含量高的木质纤维素类废物的减量化和资源化处理，特别是堆肥处理，通过加快木质纤维素的降解和转化，协同具有不同降解能力的废物间的降解过程，从而达到缩短发酵时间，促进堆肥腐熟度，提高堆肥产品品质的效果。在堆肥厂、垃圾处理厂或者个人处理庭院废物等时均可使用本发明的菌剂，实验结果表明，使用本发明的菌剂能比用其它生物和非生物对照处理的堆温提高3-5℃，且高温阶段持续时间延长，增强了堆体中总体微生物区系和木质纤维素降解菌的活性，明显加速蔬菜花卉秸秆的联合堆肥进程，缩短腐熟时间，并能使最终精细堆肥产品(颗粒粒径＜1cm)的得率提高35％以上。3)可以加糖豆浆作为液态发酵培养基，或用锯末、米糠等物质作为固态发酵培养基制备该菌剂，制备方法简单，生产周期短，成本低廉，可在短时间内大量发酵生产，实验结果表明，以10％接种量在30℃下培养2周即能达到最大收获量109cfu/g或109cfu/mL。本发明将在农业固体废物和园林绿化废物等木质纤维素含量高的木质纤维素类废物的减量化和资源化处理，特别是堆肥处理中发挥重要作用，应用前景广阔。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所有百分比浓度如无特别说明均为质量百分比浓度，所有培养基中的溶剂均为水。
实施例1、微生物复合菌剂的制备及用其作为接种剂对木质纤维素类废物进行堆肥
一、微生物复合菌剂的制备
液态发酵专用培养基配方：质量/体积百分比浓度为80％的豆浆20mL，葡萄糖20g，加水至1L，pH 7.0。
用下述方法制备液态型一次发酵菌剂：将由水生栖热菌(Thermus aquaticus)ATCC No.25104 10g、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)ATCCNo.12976 10g、嗜热球杆菌(Sphaerobacter thermophilum)ATCC No.49802 10g、强壮类芽孢杆菌(Paenibacillus validus)ATCC No.43897 10g和酸热芽孢杆菌(Bacillus acidocaldarius)ATCC No.27009 10g接种(接种量为5％)于上述1L液态发酵专用培养基中，在30℃(25-35℃均可)下连续曝气培养36小时，得到液态型一次发酵菌剂(简称1#菌剂)。
用下述方法制备液态型二次发酵菌剂：将巴氏芽孢杆菌(Bacillus pasteurii)ATCC No.11859 7.5g、腊状芽孢杆菌(Bacillus cereus)中国科学院微生物所No.1.1267.5g、液化金杆菌(Aurceobacterium liquefaciens)中国科学院微生物所No.1.19347.5g、乳微杆菌(Microbacterium lactium)中国科学院微生物所No.1.1911 7.5g、特氏盐芽孢杆菌(Halobacillus truepori)DSMZ No.10404 7.5g、红霉素气微菌(Aeromicrobium erythreum)ATCC No.51598 7.5g和产黄纤维单胞菌(Cellulomonasflavigena)中国科学院微生物所No.1.1002 7.5g(接种量为5.25％)接种于1L液态发酵专用培养基中，在30℃(25-35℃均可)下连续曝气培养48小时，得到液态型二次发酵菌剂(简称2#菌剂)。
经检测，上述液态型菌剂呈米黄色悬浊液，pH 8.0-8.5；12个月内的含菌量＞109cfu/mL，符合标准。
二、用本发明的微生物复合菌剂作为接种剂对木质纤维素类废物进行堆肥
用步骤一制备的微生物复合菌剂作为接种剂对木质纤维素类废物进行堆肥，方法为：在一次发酵阶段，以体积百分含量为1％的接种量向农业固体废物(玉米秸秆等)中投加液态1#菌剂，搅拌均匀，为了使1#菌剂中的微生物保持活性，发挥最佳降解功能，将堆肥过程的最高堆体温度控制在75℃以下，当堆温降至40℃以下时，或者在堆肥二次发酵阶段，再以体积百分含量为2％的接种量向堆肥物料中投加液态2#菌剂，继续堆制，约70天，堆肥物料完全腐熟，得到安全、卫生、物理性状好、养分含量高的生物活性有机肥。经检测，用上述方法获得的有机肥中的有机质含量大于30％，有效养分(包括氮、磷、钾)达4.8％，水分含量40％，pH值为7.5，病原菌含量、重金属及其它指标均合格。小于1cm筛孔的精细堆肥产品的得率达56％。
实施例2、微生物复合菌剂的制备及用其作为接种剂对木质纤维素类废物进行堆肥
一、微生物复合菌剂的制备
配置固态发酵专用培养基51kg，具体配方为：锯末40kg，米糠5000g，麸皮5000g，(NH4)2SO4750g，KH2PO4250g，加水至含水量达50％(50-60％均可)，pH 7.0。
用下述方法制备固态型一次发酵菌剂：将由水生栖热菌(Thermus aquaticus)ATCC No.25105 1500g、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)ATCCNo.31783 1500g、嗜热球杆菌(Sphaerobacter thermophilum)ATCC No.49802 1500g、强壮类芽孢杆菌(Paenibacillus validus)ATCC No.43897 1500g和酸热芽孢杆菌(Bacillus acidocaldarius)ATCC No.49025 1500g接种(接种量为15％，5-15％均可)于上述固态发酵专用培养基中，在30℃(25-35℃均可)下培养48-72小时，得到固态型一次发酵菌剂(简称1#菌剂)。
用下述方法制备固态型二次发酵菌剂：将巴氏芽孢杆菌(Bacillus pasteurii)ATCC No.700386 750g、腊状芽孢杆菌(Bacillus cereus)中国科学院微生物所No.1.1846 750g、液化金杆菌(Aurceobacterium liquefaciens)ATCC No.43647 750g、乳微杆菌(Microbacterium lactium)ATCC No.8180 750g、特氏盐芽孢杆菌(Halobacillus truepori)DSMZ No.10404 750g、红霉素气微菌(Aeromicrobiumerythreum)ATCC No.51598 750g和产黄纤维单胞菌(Cellulomonas flavigena)ATCCNo.482750g，以及绿色木霉(Trichoderma viride)中国科学院微生物所No.3.4264750g、里氏木霉(Trichoderma reesei)ATCC No.56765 750g和黑曲霉(Aspergillusniger)中国科学院微生物所No.3.4523 750g接种(接种量为15％，5-15％均可)于50kg固态发酵专用培养基中，在32℃(25-35℃均可)下培养48-72小时，得到固态型二次发酵菌剂(简称2#菌剂)。
经检测，上述固态型菌剂黄色，松软，pH 8.0-8.5；12个月内的含菌量＞108cfu/g，符合标准。
二、用本发明的微生物复合菌剂作为接种剂对木质纤维素类废物进行堆肥
用步骤一制备的微生物复合菌剂作为接种剂对木质纤维素类废物进行堆肥，方法为与实施例1相同，结果约55天，堆肥物料完全腐熟，得到安全、卫生、物理性状好、养分含量高的生物活性有机肥。经检测，用上述方法获得的有机肥中的有机质含量大于38.6％，有效养分(包括氮、磷、钾)达8.1％，水分含量35％，pH值为8.5，病原菌含量、重金属及其它指标均合格。小于1cm筛孔的精细堆肥产品的得率达75％。
实施例3、微生物复合菌剂的制备及用其作为接种剂对木质纤维素类废物进行堆肥
一、微生物复合菌剂的制备
液态发酵专用培养基配方：质量/体积百分比浓度为90％的豆浆25mL，葡萄糖30g，加水至1L，pH 7.0。
用下述方法制备液态型一次发酵菌剂：将由水生栖热菌(Thermus aquaticus)ATCC No.25104 300g、ATCC No.31558 300g、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)ATCC No.12976 200g、ATCC No.43040 200g、ATCC No.43513 200g、嗜热球杆菌(Sphaerobacter thermophilum)ATCC No.49802 600g、强壮类芽孢杆菌(Paenibacillus validus)ATCC No.43897 600g和酸热芽孢杆菌(Bacillusacidocaldarius)ATCC No.27009 300g、ATCC No.43032 300g接种(接种量为10％)于上述30L液态发酵专用培养基中，在30℃(25-35℃均可)下连续曝气培养48小时，得到液态型一次发酵菌剂(简称1#菌剂)。
用下述方法制备液态型二次发酵菌剂：将巴氏芽孢杆菌(Bacillus pasteurii)ATCC No.6453 450g、腊状芽孢杆菌(Bacillus cereus)中国科学院微生物所No.1.126225g、ATCC No.10702 225g、液化金杆菌(Aurceobacterium liquefaciens)DSMZ的编号为No.20637 450g、乳微杆菌(Microbacterium lactium)中国科学院微生物所No.1.1911 225g、DSMZ No.20172 225g、特氏盐芽孢杆菌(Halobacillus truepori)DSMZ No.10404 450g、红霉素气微菌(Aeromicrobium erythreum)ATCC No.51598 450g和产黄纤维单胞菌(Cellulomonas flavigena)中国科学院微生物所No.1.1002 450g，接种(接种量为10％)于液态发酵专用培养基中，在30℃(25-35℃均可)下连续曝气培养48小时，得到液态型二次发酵菌剂(简称2#菌剂)。
经检测，上述液态型菌剂呈米黄色悬浊液，pH 8.0-8.5；12个月内的含菌量＞109cfu/mL，符合标准。
二、用本发明的微生物复合菌剂作为接种剂对木质纤维素类废物进行堆肥
用步骤一制备的微生物复合菌剂作为接种剂对木质纤维素类废物进行堆肥，方法与实施例1相同，结果约50天，堆肥物料完全腐熟，得到安全、卫生、物理性状好、养分含量高的生物活性有机肥。经检测，用上述方法获得的有机肥中的有机质含量大于43.1％，有效养分(包括氮、磷、钾)达8.5％，水分含量40％，pH值为8.0，病原菌含量、重金属及其它指标均合格。小于1cm筛孔的精细堆肥产品的得率达63％。
实施例4、微生物复合菌剂的制备及用其作为接种剂对木质纤维素类废物进行堆肥
一、微生物复合菌剂的制备
配置固态发酵专用培养基51kg，具体配方为：锯末40kg，米糠5000g，麸皮5000g，(NH4)2SO4 750g，KH2PO4 250g，加水至含水量达50％(50-60％均可)，pH 7.0。用下述方法制备固态型一次发酵菌剂：将由水生栖热菌(Thermus aqua ticus)ATCCNo.25105 1250g、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)中国科学院微生物所No.1.1865 625g、ATCC No.31783 625g、强壮类芽孢杆菌(Paenibacillusvalidus)ATCC No.43897 1250g和酸热芽孢杆菌(Bacillus acidocaldarius)ATCC No.43034 1250g接种(接种量为10％)于上述50kg固态发酵专用培养基中，在30℃(25-35℃均可)下培养72小时，得到固态型一次发酵菌剂(简称1#菌剂)。
用下述方法制备固态型二次发酵菌剂：将巴氏芽孢杆菌(Bacillus pasteurii)ATCC No.6452 700g、腊状芽孢杆菌(Bacillus cereus)中国科学院微生物所No.1.1846230g、中国科学院微生物所No.1.1483 230g、ATCC No.10792 230g、乳微杆菌(Microbacterium lactium)ATCC No.8180 700g、特氏盐芽孢杆菌(Halobacillustruepori)DSMZ No.10404 700g和产黄纤维单胞菌(Cellulomonas flavigena)ATCCNo.1.1941 700g，以及绿色木霉(Trichoderma viride)中国科学院微生物所No.3.4264 700g和黑曲霉(Aspergillus niger)中国科学院微生物所No.3.2760 350g、ATCC No.200072 350g接种(接种量为10％)于50kg固态发酵专用培养基中，在32℃(25-35℃均可)下培养72小时，得到固态型二次发酵菌剂(简称2#菌剂)。
经检测，上述固态型菌剂呈黄色，松软，pH 8.0-8.5；12个月内的含菌量＞108cfu/g，符合标准。
二、用本发明的微生物复合菌剂作为接种剂对木质纤维素类废物进行堆肥用步骤一制备的微生物复合菌剂作为接种剂对木质纤维素类废物进行堆肥，方法与实施例1相同，结果约60天，堆肥物料完全腐熟，得到安全、卫生、物理性状好、养分含量高的生物活性有机肥。经检测，用上述方法获得的有机肥中的有机质含量大于35％，有效养分(包括氮、磷、钾)达5.5％，水分含量35％，pH值为7.0，病原菌含量、重金属及其它指标均合格。小于1cm筛孔的精细堆肥产品的得率达60％。
实施例5、现场堆肥试验
用实施例1-4制备的微生物复合菌剂在清华大学环境科学与工程系实验室进行多次堆肥实验和在“滇池流域面源污染控制技术研究”示范区昆明市呈贡县大渔乡进行现场堆肥中试，结果表明将上述微生物复合菌剂中的1#菌剂和2#菌剂配合使用能比用其它生物和非生物对照(生物对照为新鲜马粪培养液，非生物对照为1％的糖蜜溶液)处理的堆温提高3-5℃，且高温阶段持续时间可延长至140-180小时，增强了堆体中总体微生物区系和木质纤维素降解菌的种群密度和活性，明显加速了蔬菜花卉秸秆等木质纤维素类废物的联合堆肥进程，缩短了腐熟时间，并能使最终精细堆肥产品(＜1cm筛孔)的得率提高35％以上。

Claims (10)

1、一种微生物复合菌剂，由一次发酵菌剂和二次发酵菌剂组成，所述一次发酵菌剂的活性成分为水生栖热菌(Thermus aquaticus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、嗜热球杆菌(Sphaerobacter thermophilum)、强壮类芽孢杆菌(Paenibacillus validus)和酸热芽孢杆菌(Bacillus acidocaldarius)中的一株或几株菌的组合，每株菌20-100份；所述二次发酵菌剂的活性成分为巴氏芽孢杆菌(Bacillus pasteurii)、腊状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、液化金杆菌(Aurceobacterium liquefaciens)、乳微杆菌(Microbacterium lactium)、特氏盐芽孢杆菌(Halobacillus truepori)、红霉素气微菌(Aeromicrobium erythreum)和产黄纤维单胞菌(Cellulomonas flavigena)中的一株或几株嗜温木质纤维素降解细菌，以及绿色木霉(Trichoderma viride)、里氏木霉(Trichoderma reesei)和黑曲霉(Aspergillus niger)中的一株或几株嗜温木质纤维素降解真菌的组合，每株菌10-50份。
2、根据权利要求1所述的菌剂，其特征在于：所述保水生栖热菌(Thermusaquaticus)选自保藏于ATCC的编号分别为No.25104，25105和31558中的一株或几株；所述巴氏芽孢杆菌(Bacillus pasteurii)选自保藏于ATCC的编号分别为No.11859，6452，6453和700386中的一株或几株；所述腊状芽孢杆菌(Bacilluscereus)选自保藏于中国科学院微生物所的编号分别为No.1.126，1.173，1.229，1.230，1.895，1.932，1.1483，1.1626，1.1686，1.1687，1.1688，1.1689，1.1846，以及保藏于ATCC的编号分别为No.10702，10792，10876，11950，12480，12826，13061，13366，13472，13824，14603，14737，14893，15816，15817和19637中的一株或几株；所述液化金杆菌(Microbacterium liquefaciens)选自保藏于中国科学院微生物所的编号为No.1.1934，保藏于ATCC的编号为No.43647，以及保藏于DSMZ的编号为No.20637中的一株或几株；所述乳微杆菌(Microbacterium lacticum))选自保藏于中国科学院微生物所的编号为No.1.1911，保藏于ATCC的编号为No.8180，以及保藏于DSMZ的编号为No.20172中的一株或几株；所述特氏盐芽孢杆菌(Halobacillustrueperi)为保藏于DSMZ的编号为No.10404的菌株；所述红霉素气微菌(Aeromicrobium erythreum)为保藏于ATCC的编号为No.51598的菌株；所述产黄纤维单胞菌(Cellulomonas flavigena)选自保藏于中国科学院微生物所的编号为No.1.1002，1.1941，以及保藏于ATCC的编号为No.482中的一株或几株；所述绿色木霉(Trichoderma viride)选自保藏于中国科学院微生物所的编号为No.3.1044，3.1913，3.2196，3.2876，3.2941，3.2942，3.3711，3.3744，3.4005，3.4264，以及保藏于ATCC的编号为No.20476，24449，26920，26921，28217，32086，32173，10043，10044，10045，12582，13233，13234和16325中的一株或几株；所述里氏木霉(Trichoderma reesei)选自保藏于ATCC的编号为No.46480，46481，56763，56764，56766，56767，58350，58351，58352，58353，60787，66137，66587，66588，66589和56765中的一株或几株；所述黑曲霉(Aspergillus niger)选自保藏于中国科学院微生物所的编号为No.3.40，3.315，3.316，3.421，3.429，3.739，3.769，3.795，3.877，3.879，3.958，3.1858，3.2760，3.2915，3.3882，3.3883，3.3902，3.3927，3.3928，3.4304，3.4309，3.4463，3.4523，3.4627，3.4628，以及保藏于ATCC的编号为No.1015，10249，10553，10574，10576，10577，10578，10579，10581，10594，10864，11384，11414，12846，13004，13496，13497，15475，16508，16220，16880，200072，200344，200345，20057，200930，20107和201122中的一株或几株；所述嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)选自保藏于中国科学院微生物所的编号为No.1.1865，1.1866，1.1923，保藏于ATCC的编号为12976，12977，12979，15951，15952，21365，29492，29609，31195，31196，31197，31198，31199，31783，39536，43040和43513中的一株或几株；所述嗜热球杆菌(Sphaerobacterthermophilus)为保藏于ATCC的编号为No.49802的菌株；所述强壮类芽孢杆菌(Paenibacillus validus)为保藏于ATCC的编号为No.43897的菌株；所述酸热芽孢杆菌(Bacillus acidocaldarius)选自保藏于ATCC的编号为No.27009，43030，43031，43032，43033，43034，43035和49025中的一株或几株。
3、根据权利要求1或2所述的菌剂，其特征在于：所述菌剂为液态或固态。
4、一种制备权利要求3所述液态型菌剂的方法，是将水生栖热菌(Thermusaquaticus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、嗜热球杆菌(Sphaerobacter thermophilum)、强壮类芽孢杆菌(Paenibacillus validus)和酸热芽孢杆菌(Bacillus acidocaldarius)中的一株或几株菌的组合接种于液态发酵专用培养基中，每株菌取20-100份，在25-35℃下连续暴气培养，得到液态型一次发酵菌剂；所述液态型二次发酵菌剂的制备方法，是将巴氏芽孢杆菌(Bacilluspasteurii)、腊状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、液化金杆菌(Aurceobacteriumliquefaciens)、乳微杆菌(Microbacterium lactium)、特氏盐芽孢杆菌(Halobacillustruepori)、红霉素气微菌(Aeromicrobium erythreum)和产黄纤维单胞菌(Cellulomonas flavigena)中的一株或几株嗜温木质纤维素降解细菌，以及绿色木霉(Trichoderma viride)、里氏木霉(Trichoderma reesei)和黑曲霉(Aspergillusniger)中的一株或几株嗜温木质纤维素降解真菌的组合接种于液态发酵专用培养基中，每株菌取10-50份，在25-35℃下连续暴气培养，得到液态型二次发酵菌剂；所述液态发酵专用培养基的配方为：质量/体积百分比浓度为50-100％的豆浆15-25mL，葡萄糖10-30g，加水至1L，pH 6.8-7.2。
5、根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述保水生栖热菌(Thermusaquaticus)选自保藏于ATCC的编号分别为No.25104，25105和31558中的一株或几株；所述巴氏芽孢杆菌(Bacillus pasteurii)选自保藏于ATCC的编号分别为No.11859，6452，6453和700386中的一株或几株；所述腊状芽孢杆菌(Bacilluscereus)选自保藏于中国科学院微生物所的编号分别为No.1.126，1.173，1.229，1.230，1.895，1.932，1.1483，1.1626，1.1686，1.1687，1.1688，1.1689，1.1846，以及保藏于ATCC的编号分别为No.10702，10792，10876，11950，12480，12826，13061，13366，13472，13824，14603，14737，14893，15816，15817和19637中的一株或几株；所述液化金杆菌(Microbacterium liquefaciens)选自保藏于中国科学院微生物所的编号为No.1.1934，保藏于ATCC的编号为No.43647，以及保藏于DSMZ的编号为No.20637中的一株或几株；所述乳微杆菌(Microbacterium lacticum))选自保藏于中国科学院微生物所的编号为No.1.1911，保藏于ATCC的编号为No.8180，以及保藏于DSMZ的编号为No.20172中的一株或几株；所述特氏盐芽孢杆菌(Halobacillustrueperi)为保藏于DSMZ的编号为No.10404的菌株；所述红霉素气微菌(Aeromicrobium erythreum)为保藏于ATCC的编号为No.51598的菌株；所述产黄纤维单胞菌(Cellulomonas flavigena)选自保藏于中国科学院微生物所的编号为No.1.1002，1.1941，以及保藏于ATCC的编号为No.482中的一株或几株；所述绿色木霉(Trichoderma viride)选自保藏于中国科学院微生物所的编号为No.3.1044，3.1913，3.2196，3.2876，3.2941，3.2942，3.3711，3.3744，3.4005，3.4264，以及保藏于ATCC的编号为No.20476，24449，26920，26921，28217，32086，32173，10043，10044，10045，12582，13233，13234和16325中的一株或几株；所述里氏木霉(Trichoderma reesei)选自保藏于ATCC的编号为No.46480，46481，56763，56764，56766，56767，58350，58351，58352，58353，60787，66137，66587，66588，66589和56765中的一株或几株；所述黑曲霉(Aspergillus niger)选自保藏于中国科学院微生物所的编号为No.3.40，3.315，3.316，3.421，3.429，3.739，3.769，3.795，3.877，3.879，3.958，3.1858，3.2760，3.2915，3.3882，3.3883，3.3902，3.3927，3.3928，3.4304，3.4309，3.4463，3.4523，3.4627，3.4628，以及保藏于ATCC的编号为No.1015，10249，10553，10574，10576，10577，10578，10579，10581，10594，10864，11384，11414，12846，13004，13496，13497，15475，16508，16220，16880，200072，200344，200345，20057，200930，20107和201122中的一株或几株；所述嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)选自保藏于中国科学院微生物所的编号为No.1.1865，1.1866，1.1923，保藏于ATCC的编号为12976，12977，12979，15951，15952，21365，29492，29609，31195，31196，31197，31198，31199，31783，39536，43040和43513中的一株或几株；所述嗜热球杆菌(Sphaerobacterthermophilus)为保藏于ATCC的编号为No.49802的菌株；所述强壮类芽孢杆菌(Paenibacillus validus)为保藏于ATCC的编号为No.43897的菌株；所述酸热芽孢杆菌(Bacillus acidocaldarius)选自保藏于ATCC的编号为No.27009，43030，43031，43032，43033，43034，43035和49025中的一株或几株。
6、根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于：所述接种量为5-15％；培养温度为30℃，培养时间为36-72小时。
7、一种制备权利要求3所述固态型菌剂的方法，是将水生栖热菌(Thermusaquaticus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、嗜热球杆菌(Sphaerobacter thermophilum)、强壮类芽孢杆菌(Paenibacillus validus)和酸热芽孢杆菌(Bacillus acidocaldarius)中的一株或几株菌的组合接种于固态发酵专用培养基中，每株菌取20-100份，在25-35℃下培养，得到固态型一次发酵菌剂；所述液态型二次发酵菌剂的制备方法，是将巴氏芽孢杆菌(Bacillus pasteurii)、腊状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、液化金杆菌(Aurceobacterium liquefaciens)、乳微杆菌(Microbacterium lactium)、特氏盐芽孢杆菌(Halobacillus truepori)、红霉素气微菌(Aeromicrobium erythreum)和产黄纤维单胞菌(Cellulomonasflavigena)中的一株或几株嗜温木质纤维素降解细菌，以及绿色木霉(Trichodermaviride)、里氏木霉(Trichoderma reesei)和黑曲霉(Aspergillus niger)中的一株或几株嗜温木质纤维素降解真菌的组合接种于固态发酵专用培养基中，每株菌取10-50份，在25-35℃下培养，得到固态型二次发酵菌剂；所述固态发酵专用培养基的配方为：锯末70-90份，米糠8-12份，麸皮8-12份，(NH4)2SO4 1-2份，KH2PO4 0.1-1份，加水至含水量达50-60％，pH 6.8-7.2。
8、根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述水生栖热菌(Thermusaquaticus)选自保藏于ATCC的编号分别为No.25104，25105和31558中的一株或几株；所述巴氏芽孢杆菌(Bacillus pasteurii)选自保藏于ATCC的编号分别为No.11859，6452，6453和700386中的一株或几株；所述腊状芽孢杆菌(Bacilluscereus)选自保藏于中国科学院微生物所的编号分别为No.1.126，1.173，1.229，1.230，1.895，1.932，1.1483，1.1626，1.1686，1.1687，1.1688，1.1689，1.1846，以及保藏于ATCC的编号分别为No.10702，10792，10876，11950，12480，12826，13061，13366，13472，13824，14603，14737，14893，15816，15817和19637中的一株或几株；所述液化金杆菌(Microbacterium liquefaciens)选自保藏于中国科学院微生物所的编号为No.1.1934，保藏于ATCC的编号为No.43647，以及保藏于DSMZ的编号为No.20637中的一株或几株；所述乳微杆菌(Microbacterium lacticum))选自保藏于中国科学院微生物所的编号为No.1.1911，保藏于ATCC的编号为No.8180，以及保藏于DSMZ的编号为No.20172中的一株或几株；所述特氏盐芽孢杆菌(Halobacillustrueperi)为保藏于DSMZ的编号为No.10404的菌株；所述红霉素气微菌(Aeromicrobium erythreum)为保藏于ATCC的编号为No.51598的菌株；所述产黄纤维单胞菌(Cellulomonas flavigena)选自保藏于中国科学院微生物所的编号为No.1.1002，1.1941，以及保藏于ATCC的编号为No.482中的一株或几株；所述绿色木霉(Trichoderma viride)选自保藏于中国科学院微生物所的编号为No.3.1044，3.1913，3.2196，3.2876，3.2941，3.2942，3.3711，3.3744，3.4005，3.4264，以及保藏于ATCC的编号为No.20476，24449，26920，26921，28217，32086，32173，10043，10044，10045，12582，13233，13234和16325中的一株或几株；所述里氏木霉(Trichoderma reesei)选自保藏于ATCC的编号为No.46480，46481，56763，56764，56766，56767，58350，58351，58352，58353，60787，66137，66587，66588，66589和56765中的一株或几株；所述黑曲霉(Aspergillus niger)选自保藏于中国科学院微生物所的编号为No.3.40，3.315，3.316，3.421，3.429，3.739，3.769，3.795，3.877，3.879，3.958，3.1858，3.2760，3.2915，3.3882，3.3883，3.3902，3.3927，3.3928，3.4304，3.4309，3.4463，3.4523，3.4627，3.4628，以及保藏于ATCC的编号为No.1015，10249，10553，10574，10576，10577，10578，10579，10581，10594，10864，11384，11414，12846，13004，13496，13497，15475，16508，16220，16880，200072，200344，200345，20057，200930，20107和201122中的一株或几株；所述嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)选自保藏于中国科学院微生物所的编号为No.1.1865，1.1866，1.1923，保藏于ATCC的编号为12976，12977，12979，15951，15952，21365，29492，29609，31195，31196，31197，31198，31199，31783，39536，43040和43513中的一株或几株；所述嗜热球杆菌(Sphaerobacterthermophilus)为保藏于ATCC的编号为No.49802的菌株；所述强壮类芽孢杆菌(Paenibacillus validus)为保藏于ATCC的编号为No.43897的菌株；所述酸热芽孢杆菌(Bacillus acidocaldarius)选自保藏于ATCC的编号为No.27009，43030，43031，43032，43033，43034，43035和49025中的一株或几株。
9、根据权利要求7或8所述的制备方法，其特征在于：所述接种量为5-15％；培养温度为30℃，培养时间为36-72小时。
10、权利要求1-3任一项所述的菌剂在对木质纤维素类废物进行堆肥中的应用。
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