CN104805042B - 一种气微菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种气微菌及其应用。本发明所提供的气微菌（Aeromicrobium sp.）分离自陈熟普洱茶，保藏号为CGMCC No.9738。依据多相分类学方法，该菌株是气微菌属的一个新种，其分类地位是Aeromicrobium sp.，依据国际细菌系统分类委员会的命名方法，将该种命名为Aeromicrobium camelliae sp.nov.。本发明所提供的气微菌新菌种中温生长（30‑37℃），易培养。该新种的发现和利用丰富了我们的可利用微生物资源。本发明所提供的气微菌新菌种具有蛋白酶和酯酶活性，为蛋白酶和酯酶在食品、医药和化工等行业应用提供菌种资源。

Description

一种气微菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种气微菌及其应用。

背景技术

气微菌属由Miller等在1991年建立，模式种为Aeromicrobium erythreum NRRLB-3381^T。到现在为止，气微菌属共包括11个种，分离自土壤、空气、海洋和牧草等环境。2005年，由Yoon等对气微菌属的相关特性做了修正。好氧生长，不产芽孢，细胞呈杆状或球状，中温，主要的脂肪酸为10-甲基C18:0, C16:0, C_18:1ω9c和（或）C_16:02-OH。气微菌属G+C含量范围为70.6~73mol％。

多相分类的概念最初由Colwell于1970年提出，是指利用微生物多种不同的信息，包括表型的、基因型的和系统发育的信息，综合起来研究微生物分类和系统进化的过程。其中DNA同源性分析是确定正确的分类地位的最直接的方法，而DNA-DNA杂交可以在总体水平上研究微生物间的关系，用于种水平上的分类学研究。1987年，国际系统细菌学委员会（International Committee on Systematic Bacteriology, ICSB）规定，DNA同源性≥70%为细菌种的界限。

气微菌属的很多微生物可产生多种生物活性物质，如酶、抗菌物质、絮凝剂以及牛磺胆酸，因此在工农业生产中具有很好的应用潜力。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种气微菌，该气微菌为SEQ ID NO.1所示的碱基序列。

本发明的目的之二在于提供该气微菌在液体发酵生产蛋白酶和酯酶中的应用。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种气微菌，该菌株的保藏号为CGMCC No.9738。

一种上述的气微菌的培养方法，其特征在于该方法是将气微菌YS17 CGMCCNo.9738接种于培养基中，在15-50℃，pH5.5-12.0的条件下进行培养。

上述最适培养温度为30-37℃。

上述最适pH为7.0-8.0。

上述的培养的培养基中还包括质量百分比浓度不超过11%的NaCl。

上述的培养在需氧条件下进行。

一种根据上述的气微菌在液体发酵生产蛋白酶和酯酶中的应用。

本发明所述的培养可以是各种微生物的培养方式，比如液体培养、固体培养、半固体培养等，可以是摇床培养，也可以是发酵罐深层发酵，优选的摇床培养。

本发明所述的培养的接种量为常规，优选2%，所述百分比为体积百分比。

本发明所述的培养基为气微菌常规培养基，优选是TYB培养基。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：本发明提供了气微菌属的一个新种，该菌株的分类地位是Aeromicrobiumsp.，依照国际细菌系统分类委员会的命名方法，欲将该种命名为Aeromicrobium camelliae sp.nov.。该新种的发现和利用丰富了我们的可利用微生物资源，对我们以后更好地利用气微菌做出了一定的贡献。本发明的气微菌YS17，可提取酯酶和蛋白酶，在食品、医药和化工等行业具有有广泛应用。

生物材料保藏信息

本发明的气微菌YS17，已于2014年9月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。该菌株的保藏编号为：CGMCC No.9738。该菌株的分类命名是气微菌Aeromicrobiumsp.，名称为YS17。

附图说明

图1 显示本发明气微菌新种菌株YS17的16S rRNA系统发育进化树。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明中所述的室温是指进行试验的操作间的温度，一般为25℃。

Aeromicrobium erythreum DSM 8599^T购自德国微生物菌种保藏中心，Aeromicrobium alkaliterrae JCM 13518^T和Aeromicrobium ginsengisoli JCM 14732^T购自日本微生物菌种保藏中心。

实施例1、本发明新菌株YS17的分离制备

取普洱熟茶浸出液，将其稀释涂布于LB固体培养基中，30℃培养5-6天，挑取单菌落，然后划线纯化得到。

将其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），其保藏编号为CGMCC No.9738。

实施例2、本发明新菌株YS17的表观特征

1. 菌落特征

取菌株YS17的单菌落，转接到TYB固体培养基（琼脂）上，于30℃恒温培养箱中培养24h、36h和48h，分别观察其菌落的大小、颜色、边缘、凸起、光滑度、粘性、透明度等特点。结果显示，菌株YS17在TYB固体培养基上形成边缘整齐，光滑，湿润，不透明，黄色的菌落，直径约1mm。

2. 细胞形态学特征

细胞为短杆，顶端圆钝；革兰氏染色阳性；细胞菌体大小为0.3-0.5μm×0.9-1.6μm，单生。

实施例3、本发明新菌株YS17的生长特性

挑取在TYC固体培养基（琼脂）上培养24 h的新鲜培养物，接种到TYB液体培养基，37℃摇床培养20~24h，作为种子。

液体TYB培养基的组成（/L）：胰蛋白胨15g，NaCl 5g，大豆蛋白胨5g，蒸馏水定容至1000ml。

1.生长温度：

将所培养的YS17种子按2%(v/v)接种量转接新鲜的无菌接种TYB（液体培养基中，混匀。分别置于4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、37℃、40℃、45℃、50℃和60℃的水浴培养，每个温度梯度做三个平行，分别在24 h和48 h时测定其生长情况。得到菌株YS17生长温度范围为15~50℃，最适温度30~37℃。

2. 生长NaCl 耐受性

所培养的YS17种子按2%(v/v)接种量转接氯化钠浓度分别为0.0%、2.0%、

5.0%、7.0%、9%、10.0%、11.0%和12.0%的TYB培养基，30℃培养，分别于24 h和48 h的生长状态做记录。结果显示菌株YS17的NaCl耐受性为11%。

3. 生长pH 范围

用无菌的1mol/L HCl和1mol/L NaOH将灭好菌的TYB培养基调至pH值分别为3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0、8.5、9.0、10.0，将所培养的YS17种子按2%接种量接入，30℃培养，分别于24 h和48 h的生长状态做记录。得到菌株YS17生长的pH范围为5.5~12.0，最适pH为7.0~8.0。

实施例4、本发明新菌株YS17的生理生化特性

利用API ZYM和API20E鉴定系统（生产厂商：bioMe′rieux）及常规的生理生化测定方法（东秀珠，蔡妙英等，2001）对菌株YS17及相关的同属菌株进行生理生化特征鉴定。

菌株YS7的主要生理生化特征：好氧生长；接触酶阳性；核酸酶阴性；β-半乳糖苷酶阴性，精氨酸双水解酶阴性，赖氨酸脱羧酶阴性，鸟氨酸脱羧酶阴性，脲酶阴性，酯酶（C4）阳性，类脂酯酶（C8）阳性，胰凝乳蛋白酶阳性，不产生吲哚，VP反应阳性，水解Tween 60，不水解七叶灵；不液化明胶；不水解酪蛋白；不水解淀粉；还原硝酸盐；能利用葡萄糖、甘油、蔗糖、、果糖、海藻糖、L-谷氨酸等作为碳源；不利用阿拉伯糖、乳糖、鼠李糖、木糖、甲酸、纤维二糖、延胡索酸、柠檬酸盐、L-鸟氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-天冬氨酸、L-丙氨酸、DL-天冬酰胺、甘氨酸、赖氨酸与组氨酸等底物。

且菌株YS17在吲哚产生，胰凝乳蛋白酶活性及硝酸盐还原等方面与同源性接近的菌株Aeromicrobium erythreum DSM 8599^T，Aeromicrobium alkaliterrae JCM 13518^T和Aeromicrobium ginsengisoli JCM 14732^T具有明显差异。

实施例5、本发明新菌株YS17（CGMCC No.9738）的16S rRNA基因的PCR扩增和序列测定及16S rRNA系统发育特征。

1.提取基因组DNA

将气微菌Aeromicrobium sp.YS17（CGMCC No.9738）接种于TSB液体培养基，将生长至对数晚期的发酵液，12000转/分钟离心1分钟，去除上清液；用TES (50 mM Tris，50 mMEDTA-Na₂，50mM NaCl，pH 8.0-8.2)溶液洗3遍；用0.4mL TES溶液将菌体混匀，加入适量溶菌酶，37℃保温1小时；加入0.04 mL20%SDS，60℃保温30分钟；加入0.18 mL 5M NaClO₄，混匀；加入等体积氯仿-异戊醇(24: 1)，轻轻摇匀1分钟左右，离心（12000转/分钟，10分钟），吸取上清液；上清液加入20 μl 0.2 % RNA酶37℃保温30 分钟，氯仿-异戊醇（24: 1，v/v）处理一遍；上清液加入20 μl蛋白酶K (50-70 μg/mL)，37℃保温1小时，氯仿-异戊醇（24:1，v/v）处理一遍；上清液用2倍体积冰乙醇沉淀，70%冰乙醇溶液浸泡5分钟，12000/分钟离心5分钟。晾干后溶于无菌水中作为模板DNA。

2.16S rRNA基因的PCR扩增及测序

用于PCR扩增的正向引物为5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ (nt 8-27)，反向引物为5’-AAGGAGGTGATCCAGCC-3’(nt 1541-1557)，分别对应于大肠杆菌的16S rRNA基因的8-27和1541-1557碱基。PCR反应体系（20 μl）为：10×buffer 2μl、25 mmol/L MgCl₂2μl、10mmol/L dNTPs 1.5μl、30 pmol/L 引物各1μl、ddH₂O 13.4μl、Taq DNA酶 1μl、模板1μl。PCR反应条件为：95℃ 10 min，95℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min30s，30个循环；72℃ 10min，4℃保存。

PCR 产物的测序采用 ABI BigDye3.1测序试剂盒 (Applied Biosystems) 和DNA自动测序仪 (model ABI3730; Applied Biosystems)。

测序结果表明，菌株YS17（CGMCC No.9738）16S rRNA基因序列长度为1512 bp。其16S rRNA基因的核苷酸序列如序列表1所示。

将测序结果在GenBank及EzTaxon 数据库中进行同源比对分析，其序列与Aeromicrobium erythreum 的16S rRNA基因序列最接近，相似性为96.8%。

如上所述的16S rRNA 序列使用软件MEGA version6.0.software package绘制进化关系树。采用neighbor-joining 计算，并以maximum-parsimony 和maximum-likelihood进行验证计算，bootstrap设置为1000个循环。结果如图1 所示。从图1可见，通过对16SrRNA 基因的系统发育树分析，菌株YS17 可以归入到气微菌属。与红霉气微菌（Aeromicrobium erythreum），碱土气微菌（Aeromicrobium alkaliterrae）和参田气微菌（Aeromicrobium ginsengisoli）为96.8%，96.7%和96.7%。而97% 则是同一属内不同种类菌株相似性的16S rNA的阈值，而且很多文献中证明了有些菌16S rRNA 基因序列的相似性超过了99%，但是他们仍然属于不同的菌种。故菌株BD3526 较有可能为新的微生物物种，有待其他生理生化指标的验证。

实施例6：本发明新微生物的脂肪酸含量特征

菌株YS17的总脂肪酸含量的测定。

配置如下溶液：I，45g氢氧化钠溶于150ml甲醇及150ml蒸馏水；II，190ml浓盐酸，275ml 甲醇溶于135ml 蒸馏水；III，200ml 正己烷与200ml 乙醚混合均匀；IV，10.8 克氢氧化钠溶于900ml 蒸馏水；V，饱和氯化钠溶液。

1）取适量细菌培养物，置于8ml螺口玻璃管中，加入1ml溶液，拧紧螺盖，沸水浴5min，取出振荡5-10秒，再度拧紧螺盖，继续沸水浴25min；

2）待样品管冷却后，加入2ml溶液，盖严振荡，随后精确控制80±1℃水浴10min，冰浴冷却；此步骤需严格控制温度和时间，以免羟基酸和环式脂肪酸受到破坏；

3）在冷却的样品管中加入1.25ml溶液，快速振荡10min左右，弃去下层水相；

4）在剩余有机相中加入3ml溶液及几滴溶液，快速振荡5min左右，取三分之二上层有机相置气相色谱样品瓶中备用。

HP 6890气相色谱仪，配备分流/不分流进样口，氢火焰离子化检测器（FID）及HP气相色谱化学工作站（HP CHEMSTATION ver A 5.01）；色谱柱为Ultra-2柱，长25m，内径0.2mm，液膜厚度0.33mm；炉温为二阶程序升温：起始温度170℃，每min5℃升至260℃，随后以40℃/ min升至310℃，维持1.5min；进样口温度250℃， 载气为氢气，流速0.5ml/min，分流进样模式，分流比100:1，进样量2ml；检测器温度300℃，氢气流速30ml/min，空气流速216ml/min，补充气（氮气）流速30ml/min。

结果显示，菌株YS17 的主要细胞脂肪酸为不饱和脂肪酸C_18:1ω9c、结核硬脂酸10-Methyl C_18:0和十六碳饱和脂肪酸C16 ：0，百分含量分别为16.24%、30.17%、18.5%。符合气微菌属主要的脂肪酸类型。而且同相似菌株脂肪酸种类与含量上，均有差异，以此判断同相似菌株属于不同种类。

实施例 7：本发明新微生物的G + C mol%含量特征

菌株 YS17基因组DNA的G+C mol%含量测定。

使用熔解温度(Tm)法，以大肠埃希氏(E.coli K12，AS1.365)为参比对照，所用仪器为Agilent Technologies公司Cary Series UV-Vis Spectrophotometer，用PTP-1数字温度控制仪控温。步骤如下:

1）将待测DNA样品用0.1×SSC稀释至OD₂₆₀nm 值于0.3 ~ 0.4之间；

2） 在波长260nm首先记录25°C的OD值，然后设定升温程序，从30℃开始到95°C,其间每分钟升高1℃；

3）OD值上升表示变性开始,记录比色皿温度和OD值，直至OD值不变表示变性完毕；

4）根据热变性曲线，得出熔链温度(Tm)，计算G+C mol%含量。

在0.1×SSC溶液中计算公式为:

G+C mol%=G+Cmol% （AS1.365）+ 2.08(Tm_未知- Tm _AS1.365)

试验测定的E.coli K12 _AS1.365的Tm为75.97°C和51.6 mol%，待测菌株YS17的Tm值和G+Cmol%分别为83.02和66.3 mol%。

实施例8：本发明新微生物的DNA-DNA杂交试验

菌株YS17同遗传亲缘关系最相似的菌种及类芽孢杆菌属模式菌种的杂交试验。

参考16S rRNA的结果，对YS17与遗传亲缘关系最相似的种Aeromicrobium erythreum DSM 8599^T，Aeromicrobium alkaliterrae JCM 13518^T和Aeromicrobium ginsengisoli JCM 14732^T 进行DNA-DNA杂交试验。

采用液相复性率方法，所用仪器为Cary Series UV-Vi Spectrophotometer。温度控制用Peltier temperature-controlling programmer数字控温程序。步骤如下：

1）DNA样品处理：如上所述实施例5中提取的DNA样品，实验前需先置冰浴中用超声波40W打24分钟（设定为：打3秒/停3秒；DNA样品浓度为OD260nm 2.0，将DNA样品剪切2~5×10⁵道尔顿的片段。

2）将待测DNA样品（A、B）分别用0.1×SSC 精确配制成为OD260nm1.8~ 2.0，且两者OD260nm 值一致；

3）进入Kinetics程序，出现其方法窗口，在方法窗口中设置合适的测定参数。测定波长为260nm，总测定时间设定为30分钟。按照已经测定的G+C mol%计算最适复性温度（optimal renaturation temperature，TOR），将比色杯的温度稳定在最适复性温度。在2×SSC反应液中，最适复性温度按公式：TOR=0.51×（G+C）mol%+47计算。

4）取两株菌种DNA样品各720 μl分别装在两个离心管中，再取两株菌种DNA 样品各360 μl 装在同一个离心管中为混合样品；

5）单一DNA样品和混合DNA样品测试前分别通过空气浴（Themomixer, Eppendorf生产）100℃变性10min，然后迅速转移到预热的比色皿中，降温至最适复性温度。记录OD260nm值，待反应进行到30min时，停止读数，全部过程样品的温度都不得低于TOR，最终得到一条随时间延长，光吸收值逐渐减小的直线；

5）以时间为横坐标，OD260nm为纵坐标，绘制复性曲线，该线的斜率即为DNA 的复性速率（VM；VA；VB）。

DNA同源性计算：依据De Ley等的公式计算

H% = (4VM-VA-VB) / 2(VA× VB) 1/2 ×100%

DNA-DNA杂交的结果如下：

菌株YS17与Aeromicrobium erythreum DSM 8599^T、Aeromicrobium alkaliterrae JCM 13518^T和 Aeromicrobium ginsengisoli JCM 14732^T的DNA相关性分别为10.9%，16.8%和10.9%，均大大低于国际系统细菌学委员会（International Committeeon Systematic Bacteriology, ICSB）在1987年关于DNA相关性70%为细菌种的界限规定。结合实例2，3，4，5，6的数据，由此判定，菌株YS17为Aeromicrobium属的一个新菌种，该菌株的分类地位是Aeromicrobium sp.，依照国际细菌系统分类委员会的命名方法，欲将该种命名为Aeromicrobium camelliae sp.nov.，并选菌株YS17为该种的模式菌株。

实施例9：本发明新微生物的用途

经API ZYM鉴定系统（生产厂商：bioMe′rieux）测定，菌株YS17具有酯酶（C4），类脂酯酶（C8）及胰凝乳蛋白酶活性。

作为微生物来源的酯酶和蛋白酶在食品、医药和化工等行业具有有广泛应用。

<110> 上海大学

<120> 一种气微菌及其应用

<160> 1

<210> 1

<211> 1512

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agagtttgat catggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ttaacacatg caagtcgagc 60

ggtaaggccc ctttcggggg gtacacgagc ggcgaacggg tgagtaacac gtgagcaacc 120

tgcccttctc tttgggataa ccagtggaaa cgctggctaa taccgaatat gaccgccttg 180

ggcatccggg gtggtggaaa gttccggcgg agaaggatgg gctcgcggcc tatcagcttg 240

ttggtgaggt aatggctcac caaggcgacg acgggtagcc ggcctgagag ggtgaccggc 300

cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtggg gaatattgga 360

caatgggcga aagcctgatc cagcaacgcc gcgtgaggga tgacggcctt cgggttgtaa 420

acctctttca gcaccgacga agcgaaagtg acggtaggtg cagaagaagg accggccaac 480

tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg gtccgagcgt tgtccggaat tattgggcgt 540

aaagggctcg taggcggtct gtcgcgtcgg gagtgaaaac tcggggctta accccgagcg 600

tgcttccgat acggacagac tagagggatg caggggagaa tggaattcct ggtgtagcgg 660

tggaatgcgc agatatcagg aggaacaccg gtggcgaagg cggttctctg ggcatttcct 720

gacgctgagg agcgaaagca tggggagcga acaggattag ataccctggt agtccatgcc 780

gtaaacgttg ggcgctaggt gtggggacct tccacggttt ccgtgccgca gctaacgcat 840

taagcgcccc gcctggggag tacggccgca aggctaaaac tcaaaggaat tggcgggggc 900

ccgcacaagc ggcggagcat gctgattaat tcgatgcaac gcgaagaacc ttacctgggt 960

ttgacatatg ccggaaagct gcagagatgt ggcctccctt gtggccggta tacaggtggt 1020

gcatggctgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac 1080

cctcgtccta tgttgccagc acgtgatggt ggggactcat aggagactgc cggggtcaac 1140

tcggaggaag gtggggatga cgtcaagtct tcatgcccct tatgtccagg gcttcaagca 1200

tgctacaatg gccggtacaa tgggctgcga aatcgtaagg tggagcgaat cccaaaaagc 1260

cggtctcagt tcggattggg gtctgcaact cgaccccatg aagtcggagt cgctagtaat 1320

cgcagatcag caacgctgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcacg 1380

tcatggaagt cggcaacacc cgaagccggt ggcctaaccc ttgtgggagg agccgtcgaa 1440

ggtggggctg gcgattggga cgaagtcgta acaaggtagc cgtaccggaa ggtgcggctg 1500

gatcacctcc tt 1512

Claims (6)

1.一种气微菌，该菌株的保藏号为CGMCC No.9738。

2.一种根据权利要求1所述的气微菌的培养方法，其特征在于该方法是将气微菌YS17CGMCC No.9738接种于培养基TYB中，在15-50℃，pH5.5-12.0的条件下进行培养；所述的培养基中还包括质量百分比浓度不超过11%的NaCl。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于培养温度为30-37℃。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于pH为7.0-8.0。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的培养在需氧条件下进行。

6.一种根据权利要求1所述的气微菌在液体发酵生酯酶C4、类脂酯酶C8和胰凝乳蛋白酶中的应用。