CN108865901B

CN108865901B - 一株米曲霉菌株及其在降解黄曲霉毒素中的应用

Info

Publication number: CN108865901B
Application number: CN201810783156.XA
Authority: CN
Inventors: 王莹; 楚杰; 刘可春; 赵博
Original assignee: Biology Institute of Shandong Academy of Sciences
Current assignee: Biology Institute of Shandong Academy of Sciences
Priority date: 2018-07-17
Filing date: 2018-07-17
Publication date: 2020-06-09
Anticipated expiration: 2038-07-17
Also published as: CN108865901A

Abstract

本发明提供了一株米曲霉菌株及其在降解黄曲霉毒素中的应用。本发明提供的米曲霉，已于2018年6月27日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.15988。本发明首次筛选到一株能够降解黄曲霉毒素B1的米曲霉菌株。经过试验证明该菌株对黄曲霉毒素B1降解效率高，能达到87％以上。将菌剂用于黄曲霉毒素B1的降解具有高效、安全、不破坏产品品质的优点。

Description

一株米曲霉菌株及其在降解黄曲霉毒素中的应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体而言，涉及一株米曲霉菌株及其在降解黄曲霉毒素中的应用。

背景技术

黄曲霉毒素是一种由黄曲霉或寄生曲霉等真菌产生的具有致畸性、致癌性、致突变的次级代谢产物，严重影响食品安全和人类健康。黄曲霉毒素具有一定的稳定性，目前去除黄曲霉毒素的化学和物理方法都存在一定局限性，例如耗费时间长，营养物质损失多，成本高等，所以寻求一种更加高效的去除粮食、饲料和食品中的黄曲霉毒素的方法，具有十分重要的意义。

生物学方法消除黄曲霉毒素时间周期短，并且安全高效。目前常用的降解黄曲霉毒素的生物学方法是利用微生物发酵代谢产物消除黄曲霉毒素。研究报道较多的微生物有红串红球菌、分支杆菌、巨大芽孢杆菌、乳酸杆菌等细菌和白腐菌、假密环菌、黑曲霉等真菌，在一定条件下能够降解黄曲霉毒素。

米曲霉是一种产复合酶的真菌，是美国食品与药物管理局和美国饲料公司协会1989年公布的40余种安全微生物菌种之一，可以产蛋白酶，纤维素酶。至今为止，还未有米曲霉降解黄曲霉毒素的报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一株米曲霉菌株及其在降解黄曲霉毒素中的的应用。本发明的米曲霉菌株，其发酵后代谢产物能够有效降解黄曲霉毒素，且高效、安全。

为实现上述发明目的，本发明一方面提供一株米曲霉(Aspergillus oryzae sp.)菌株，命名为米曲霉SWS1。该菌株已于2018年6月27日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC NO.15988。该米曲霉SWS1菌株从花生种植区土壤中富集筛选得到，能够有效降解黄曲霉毒素，可用于减少黄曲霉毒素污染。

本发明筛选得到的米曲霉SWS1菌株(CGMCC NO.15988)，其生理生化特征如下：固体平板中菌落质地疏松，有气生菌丝，背面无色，表面为白色絮状，后变为青色，结有黑色孢子，较为干燥，菌丝不易被挑起。液体培养基中菌株为絮状圆团形，白色，后连接成片，浮于培养基上层。细胞呈丝状，孢子丝柱状，放射生长，孢子顶囊为球型。能利用淀粉、降解粗纤维，不耐受高浓度NaCl。

本发明米曲霉SWS1菌株，其18S rRNA序列如SEQ ID No.1所示。通过blastn比对和系统进化树的分析，进一步证明该菌株从属于米曲霉。

本发明还提供所述米曲霉的培养方法，采用常规真菌培养基培养即可；培养时，取固体平板中菌块，加入发酵培养基中进行摇瓶发酵培养；培养条件为：温度30℃，先摇瓶培养 12h转速180r/min；后静置培养24-36h。

所述发酵培养基的配方为：蛋白胨0.5％-0.75％，葡萄糖3％-5％，MgSO₄ 0.75％-0.8％， NH₄NO₃ 0.1％-0.15％，FeSO₄ 0.01％-0.03％，pH 6.5-7.2。固体平板培养基成分与发酵培养基相同，只需再加入琼脂即可。

本发明还提供了所述米曲霉SWS1在降解黄曲霉毒素尤其是黄曲霉毒素B1中的应用。优选为用于饲料中黄曲霉毒素B1脱毒。本发明所述米曲霉SWS1菌株降解黄曲霉毒素B1的成分为发酵胞外代谢产物，该产物是非诱导产生的。

本发明米曲霉SWS1降解黄曲霉毒素B1的方法，可以是：将米曲霉SWS1发酵物干燥后得到的菌剂与含黄曲霉毒素的饲料按照质量比0.5-1:100混合，保持饲料含水量为30-40％，于室温放置12-72h，即可有效脱除饲料中黄曲霉毒素；所述菌剂中活菌数量1-5×10⁸cfu/g。

本发明还提供一种含所述米曲霉菌株的动物饲料添加剂，所述饲料添加剂包括米曲霉 SWS1菌剂，可以降解饲料中黄曲霉毒素B1。

本发明具有如下有益效果：

(1)本发明首次筛选到一株能够降解黄曲霉毒素的米曲霉菌株。经过试验证明该菌株对黄曲霉毒素B1降解效率高，能达到87％以上(图2，图3)。

(2)本发明的米曲霉SWS1菌株通过自身代谢物，完成对黄曲霉毒素B1的降解，过程简单，温和有效，并且发酵产物为非诱导型，操作简便，具有广阔的应用前景。

(3)本发明米曲霉SWS1菌株降解黄曲霉毒素B1安全、不破坏产品品质。米曲霉是一种常用的生产菌株，能够产复合酶，例如蛋白酶，纤维素酶等，是美国食品与药物管理局和美国饲料公司协会1989年公布的40余种安全微生物菌种之一。使用本发明的米曲霉降解饲料及其他产品中的黄曲霉毒素，具有安全、不破坏产品品质的优点。

附图说明

图1为本发明筛选到的米曲霉在香豆素培养基平板中的生长状态。

图2为实施例3米曲霉SWS1菌株降解黄曲霉毒素B1效果试验中的对照组黄曲霉毒素 B1图谱。

图3为实施例3米曲霉SWS1菌株降解黄曲霉毒素B1效果试验中的试验组黄曲霉毒素 B1图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的保护范围。下述实施例中，所用方法如无特殊说明，均为本领域常规方法，所用试剂如无特殊说明，均可从常规途径获得。例如，所用色谱甲醇(MERCK)、黄曲霉毒素 B1购买于Sigma公司，PBS购买于索莱宝公司。

实施例1.本发明降解黄曲霉毒素B1的米曲霉菌株的筛选及鉴定

(1)菌株的筛选：

富集培养：从山东莒南花生种植地收集土壤样品，配制黄曲霉降解菌筛选培养基100mL 于500mL锥形瓶中，将土壤样品按1％比例放入，30℃，180r/min摇瓶培养60h。

初筛：将100μL富集样品加入装有900μL无菌生理盐水的EP管中，混合均匀，再取出100μL加入另外一支装有900μL无菌生理盐水的EP管中，依次操作，将菌液分别稀释至10¹、10²、10³、10⁴和10⁵，将10⁴和10⁵稀释度菌液涂布三个平行的黄曲霉降解菌筛选平板，置于30℃培养箱培养60h。

复筛：挑选在平板中能够生长的菌株重新进行液体培养，500mL锥形瓶放入100mL黄曲霉降解菌筛选培养基，30℃，180r/min摇瓶培养60h。测定发酵上清液对黄曲霉B1的降解能力，确定降解能力最强的菌株进行保存。

黄曲霉降解菌筛选培养基配方：以香豆素为唯一碳源，KH₂PO₄：0.25g/L；NH₄NO₃：1g/L；CaCl₂：1g/L；MgSO₄：0.25g/L；FeSO₄：1mg/L；香豆素：1g/L。

(2)形态学鉴定及理化特征鉴定

筛选得到的菌株其生理生化特征如下：固体平板中菌落质地疏松，有气生菌丝，背面无色，表面为白色絮状，后变为青色，结有黑色孢子，较为干燥，菌丝不易被挑起。液体培养基中菌株为絮状圆团形，白色，后连接成片，浮于培养基上层。细胞呈丝状，孢子丝柱状，放射生长，孢子顶囊为球型。能利用淀粉、降解粗纤维，不耐受高浓度NaCl。

(3)分子鉴定

菌株的分子鉴定：提取菌株基因组DNA，以其为模版进行18SrRNA扩增，使用的引物为：

F：5’-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’(SEQ ID No.2)

R：5’-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3’(SEQ ID No.3)

利用合成的引物，进行PCR反应。PCR反应体系如下：

PCR条件

将所得到的PCR产物使用凝胶回收试剂盒回收，送到华大公司进行18S rRNA测序。菌株的18S rRNA序列如SEQ ID No.1所示。

过blastn比对和系统进化树的分析，检索发现，SWS1菌株与Genebank中枯米曲霉序列同源性较高，相似性为99％，进一步证明该菌株从属于米曲霉。

实施例2.本发明米曲霉SWS1菌株的培养

(1)所用培养基

发酵培养基1：蛋白胨0.75％，葡萄糖3％，MgSO₄ 0.75％，NH₄NO₃ 0.1％，FeSO₄0.01％， pH 7.2。

固体平板培养基1：蛋白胨0.75％，葡萄糖3％，MgSO₄ 0.75％，NH₄NO₃ 0.1％，FeSO₄0.01％，琼脂2％，pH 7.2。

发酵培养基2：蛋白胨0.5％，葡萄糖5％，MgSO₄ 0.75％，NH₄NO₃ 0.1％，FeSO₄0.03％， pH 7.2。

固体平板培养基2：蛋白胨0.5％，葡萄糖5％，MgSO₄ 0.75％，NH₄NO₃ 0.1％，FeSO₄0.03％，琼脂2％，pH 7.2。

(2)取固体平板中直径大约为1cm菌块，加入装有100mL发酵培养基的500mL锥形瓶中进行培养。

摇瓶发酵的条件为：温度30℃，发酵时间36h；先摇瓶12h，转速180r/min，后静置24-36h。

经过培养后菌体数量达到1-5×10⁸cfu/g。

实施例3.本发明米曲霉SWS1菌株降解黄曲霉毒素B1效果试验

试验组：取所述实施例2的米曲霉发酵培养液，离心取900μL上清液，加入100μL黄曲霉毒素B1，于30℃温浴24h。其中黄曲霉毒素B1浓度为10μg/mL，溶解在pH为7.2的 PBS中。

对照组：在100μL黄曲霉毒素B1中加入900uL PBS缓冲液，其余条件同试验组。

将试验组和对照组分别离心(12000rpm，离心5min)后，将上清液过0.22μm滤膜。

使用高效液相色谱法对黄曲霉毒素B1进行检测。实验条件：色谱柱：YMC C18HPLCcolumn，259mm×4.6mm×5μm；流动相为甲醇：水＝9：11；柱温：30℃；流速：0.8mL/min；进样量：20μL；激发波长360nm，发射波长440nm。

对照组样品和试验组样品峰型图分别如图2、图3所示。

检测结果表明，米曲霉发酵液对黄曲霉毒素B1的降解，30℃反应24h的降解率为87％。

实施例4.本发明米曲霉SWS1在降解饲料中黄曲霉毒素B1的应用

将实施例2的米曲霉SWS1发酵液干燥后得到的菌剂保存。取0.01kg(1-5×10⁸cfu/g) 菌剂，加入到黄曲霉毒素含量为200μg/kg的1kg花生粕饲料中，保持含水量为30-40％左右，于室温放置60h。再次测定饲料中黄曲霉毒素含量，此时黄曲霉含量降为22μg/kg，降解率达到89％。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东省科学院生物研究所

<120> 一株米曲霉菌株及其在降解黄曲霉毒素中的应用

<130>

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1761

<212> DNA

<213> Aspergillus oryzae sp.

<400> 1

aaagattaag ccatgcatgt ctaagtataa gcactttata ctgtgaaact gcgaatggct 60

cattaaatca gttatcgttt atttgatagt accttactac atggatacct gtggtaattc 120

tagagctaat acatgctaaa aacctcgact tcggaagggg tgtatttatt agataaaaaa 180

ccaatgccct tcggggctcc ttggtgattc ataataactt aacgaatcgc atggccttgc 240

gccggcgatg gttcattcaa atttctgccc tatcaacttt cgatggtagg atagtggcct 300

accatggtgg caacgggtaa cggggaatta gggttcgatt ccggagaggg agcctgagaa 360

acggctacca catccaagga aggcagcagg cgcgcaaatt acccaatccc gacacgggga 420

ggtagtgaca ataaatactg atacggggct cttttgggtc tcgtaattgg aatgagtaca 480

atctaaatcc cttaacgagg aacaattgga gggcaagtct ggtgccagca gccgcggtaa 540

ttccagctcc aatagcgtat attaaagttg ttgcagttaa aaagctcgta gttgaacctt 600

gggtctggct ggccggtccg cctcaccgcg agtactggtc cggctggacc tttccttctg 660

gggaacctca tggccttcac tggctgtggg gggaaccagg acttttactg tgaaaaaatt 720

agagtgttca aagcaggcct ttgctcgaat acattagcat ggaataatag aataggacgt 780

gcggttctat tttgttggtt tctaggaccg ccgtaatgat taatagggat agtcgggggc 840

gtcagtattc agctgtcaga ggtgaaattc ttggatttgc tgaagactaa ctactgcgaa 900

agcattcgcc aaggatgttt tcattaatca gggaacgaaa gttaggggat cgaagacgat 960

cagataccgt cgtagtctta accataaact atgccgacta gggatcgggc ggtgtttcta 1020

tgatgacccg ctcggcacct tacgagaaat caaagttttt gggttctggg gggagtatgg 1080

tcgcaaggct gaaacttaaa gaaattgacg gaagggcacc acaaggcgtg gagcctgcgg 1140

cttaatttga ctcaacacgg ggaaactcac caggtccaga caaaataagg attgacagat 1200

tgagagctct ttcttgatct tttggatggt ggtgcatggc cgttcttagt tggtggagtg 1260

atttgtctgc ttaattgcga taacgaacga gacctcggcc cttaaatagc ccggtccgcg 1320

tttgcgggcc gctggcttct tagggggact atcggctcaa gccgatggaa gtgcgcggca 1380

ataacaggtc tgtgatgccc ttagatgttc tgggccgcac gcgcgctaca ctgacagggc 1440

cagcgagtac atcaccttgg ccgagaggtc cgggtaatct tgttaaaccc tgtcgtgctg 1500

gggatagagc attgcaatta ttgctcttca acgaggaatg cctagtaggc acgagtcatc 1560

agctcgtgcc gattacgtcc ctgccctttg tacacaccgc ccgtcgctac taccgattga 1620

atggctcggt gaggccttcg gactggccca ggagggttgg caacgacccc ccagggccgg 1680

aaagttggtc aaacccggtc atttagagga agtaaaagtc gtaacaaggt ttccgtaggt 1740

gaacctgcgg aaggatcatt a 1761

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gtagtcatat gcttgtctc 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tccgcaggtt cacctacgga 20

Claims

1.一株米曲霉菌株，其特征是，所述米曲霉菌株的保藏编号为CGMCC NO.15988，命名为米曲霉SWS2。

2.根据权利要求1所述的米曲霉菌株，其特征是，所述米曲霉SWS2的18S rRNA序列如SEQ ID No.1所示。

3.一种培养权利要求1或2所述的米曲霉菌株的方法，其特征是，取固体平板中菌块，加入发酵培养基中进行摇瓶发酵培养；培养条件为：温度30℃，先摇瓶培养12h转速180r/min，后静置培养24-36h。

4.如权利要求3所述的培养方法，其特征是，所述发酵培养基的配方为：蛋白胨0.5％-0.75％，葡萄糖3％-5％，MgSO₄ 0.75％-0.8％，NH₄NO₃ 0.1％-0.15％，FeSO₄0.01％-0.03％，pH 6.5-7.2。

5.权利要求1或2所述的米曲霉菌株的应用，其特征是，在降解黄曲霉毒素B1中的应用。

6.如权利要求5所述应用，其特征是，所述米曲霉菌株的发酵产物应用于黄曲霉毒素B1脱毒。

7.如权利要求5所述应用，其特征是，所述米曲霉菌株应用于饲料中黄曲霉毒素B1脱毒。

8.如权利要求7所述应用，其特征是，将米曲霉SWS2发酵物干燥后得到的菌剂与含黄曲霉毒素B1的饲料按照质量比0.5-1:100混合，保持饲料含水量为30-40％，于室温放置12-72h，即可有效脱除饲料中黄曲霉毒素B1；所述菌剂中活菌数量1-5×10⁸cfu/g。

9.一种含权利要求1或2所述的米曲霉菌株的动物饲料添加剂，其特征是，所述饲料添加剂包括米曲霉SWS2菌剂。