CN108504599A - 粘质沙雷氏菌菌株及其生产木质素降解酶和降解木质素中的应用 - Google Patents

粘质沙雷氏菌菌株及其生产木质素降解酶和降解木质素中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了粘质沙雷氏菌菌株及其生产木质素降解酶和降解木质素的应用，属于木质素降解技术领域。一种粘质沙雷氏菌菌株SM01，Serratia marcescens，保藏编号为CGMCC NO.15175。所述粘质沙雷氏菌菌株在生产木质素降解酶中的应用。所述粘质沙雷氏菌菌株在降解木质素中的应用。粘质沙雷氏菌菌株具有高效降解木质素的能力，木质素的累积降解率达到92％以上。

Description

粘质沙雷氏菌菌株及其生产木质素降解酶和降解木质素中的 应用
技术领域
本发明属于木质素降解技术领域，具体涉及粘质沙雷氏菌菌株及其生产木质素降解酶和降解木质素的应用。
背景技术
木质素是林木蛀干害虫幼虫阶段的主要营养来源，在该类昆虫的生长发育进程中起着重要作用。其中，木质素是木质素的主要成分，属大分子物质，性状稳定，不溶于水和绝大多数溶剂，不能直接被昆虫肠壁细胞吸收运转。许多研究表明，昆虫肠道微生物在木质素生物降解过程中扮演着重要角色，它们通过产生多种胞外酶推动木质素裂解反应，形成可被吸收的小分子物质。
目前有关昆虫肠道微生物产木质素降解酶的研究大多集中在真菌方面。但有不少研究证实细菌也能够降解木质素。Delalibera等(2005)在S.vestita幼虫肠道木质素降解细菌的群落中也获得同时具有羧甲基纤维素酶活性和滤纸降解活性的菌株；Schloss等(2006)研究表明光肩星天牛肠道中的放线菌具有降解木质素类芳香族的能力；韩国学者Park(2007)等研究了9种天牛肠道细菌的群落多样性，并在松墨天牛肠道细菌降解木质素能力的研究中分离获得具有木质素酶活性的变形菌门细菌；袁俊超等(2015)以木质纤维为唯一的碳源，从天牛幼虫的肠道中分离出3株具有降解木纤维能力的菌株，并发现枯草芽孢杆菌能协同烟曲霉提高对木质素的降解效率；李成林(2015)从4种食木白蚁的肠道内筛选出多种可转化利用木质素类化合物的细菌。但是昆虫肠道细菌已被证明能够产生的酶大多数是1,4-β-内切葡聚糖酶、1,4-β-木聚糖酶、果胶酶、α-淀粉酶等，具有促进昆虫肠道消化吸收木质素、木聚糖、果胶和淀粉等营养物质的功能，但有关昆虫肠道分离的细菌中通过产木质素降解酶分解木质素的研究则极少。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种粘质沙雷氏菌菌株及其生产木质素降解酶和降解木质素中的应用，具有较高的纤维素降解酶活性，同时具有高效降解木质素的特点。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种粘质沙雷氏菌菌株SM01，保藏编号为CGMCC NO.15175。
本发明提供了所述粘质沙雷氏菌菌株SM01在生产木质素降解酶中的应用。
优选的，所述木质素降解酶包括木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶。
优选的，所述应用包括：将所述粘质沙雷氏菌菌株SM01接种至产酶培养基上发酵培养；所述粘质沙雷氏菌菌株SM01的产酶培养基中硫酸木质素的浓度为1～10.0g/L。
优选的，粘质沙雷氏菌菌株SM01的产酶培养基中包括有机氮源或无机氮源；所述有机氮源包括蛋白胨或酵母膏；所述无机氮源包括NH4Cl或尿素。
优选的，所述酵母膏的浓度为2～6g/L。
优选的，所述尿素的浓度为3～5g/L。
优选的，粘质沙雷氏菌菌株SM01的产酶培养基包括金属离子；所述金属离子包括以下浓度的金属离子：0～0.6g/LMg2+、0.2～0.5g/L Ca2+、0～2g/LK+、0.02～0.06g/LMn2+和0.05～0.2g/LFe2+。
优选的，粘质沙雷氏菌菌株SM01的产酶培养基的pH值为4～7。
本发明提供了粘质沙雷氏菌菌株SM01在降解木质素中的应用。
本发明提供了一种粘质沙雷氏菌菌株，保藏编号为CGMCC NO.15175。所述粘质沙雷氏菌菌株分离自松墨天牛幼虫肠道，能够产木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶的性能，且生产的酶活性较高。基于此，粘质沙雷氏菌菌株具有高效降解木质素的能力，所述粘质沙雷氏菌菌株发酵10d，木质素的累积降解率达到92％以上。
本发明提供了所述粘质沙雷氏菌菌株在生产木质素降解酶中的应用。所述粘质沙雷氏菌菌株具有产木质素降解酶的特性，将所述粘质沙雷氏菌菌株经发酵培养，分泌具有高酶活力的木质素降解酶。
进一步的，本发明提供的应用，所述粘质沙雷氏菌菌株能够生产木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶，同时通过限定粘质沙雷氏菌菌株发酵过程中木质素的浓度、发酵液pH值，发酵培养基中氮源和金属离子的种类和浓度，采用该产酶培养基能有效提高酶活力。实验证明，木质素过氧化物酶的酶活力为220～1200U/L；锰过氧化物酶的酶活力为150～750U/L；漆酶的酶活力为20～105U/L。
菌种保藏信息
粘质沙雷氏菌菌株SM01，Serratia marcescens，在2018年1月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏单位简称：CGMCC,保藏编号为CGMCCNO.15175。
附图说明
图1为实施例1中木质素标准曲线；
图2为实施例1中松墨天牛肠道粘质沙雷氏菌SM01(S.marcescens)木质素降解率测定结果；
图3为实施例1中不同培养时间松墨天牛肠道粘质沙雷氏菌SM01(S.marcescens)产酶曲线。
具体实施方式
本发明提供了本发明提供了一种粘质沙雷氏菌菌株SM01，保藏编号为CGMCCNO.15175。
本发明提供了所述粘质沙雷氏菌菌株SM01在生产木质素降解酶中的应用。
在本发明中，所述木质素降解酶包括木质素过氧化物酶(Lip)、锰过氧化物酶(MnP)和漆酶(Lac)。所述粘质沙雷氏菌菌株产酶的变化趋势如下：对于Lip酶活性，前期随着培养时间的推进逐步升高，并在第4d天达到高峰，第5天开始开始急剧下降，至第10天其活性与MnP持平；对于MnP酶活性，前2d处于快速增长的阶段，而后3天则维持了相对稳定的高活性状态，并在第5d达到高峰期，而后开始出现逐步下降的趋势；对于Lac酶活性，酶活性较Lip酶和MnP酶相比始终处于较低水平，仅在第3d出现了酶活性的小高峰。LiP和MnP与纤维素的降解率的相关性分别达到0.740、0.798，显著高于Lac与降解率的相关性(0.405)。这表明，在同一发酵条件下，3种木质素降解酶具有不同酶活力，且三种酶的酶活力变化趋势有所不同，生产提取3种木质素降解酶的时间优选在培养3～5d时进行提取。
在本发明中，所述应用包括：将所述粘质沙雷氏菌菌株SM01接种至产酶培养基上发酵培养，提取木质素降解酶。
在本发明中，粘质沙雷氏菌菌株SM01的产酶培养基为液体培养基，包括硫酸木质素、氮源和金属离子。
在所述产酶培养基中，所述硫酸木质素的浓度优选为1～10.0g/L，更优选为2～6g/L，最优选为3g/L。所述硫酸木质素在产酶培养基中为粘质沙雷氏菌提供碳源。
在本发明中，所述产酶培养基中的氮源优选包括有机氮源和/或无机氮源。所述有机氮源优选包括蛋白胨或酵母膏。当所述氮源为酵母膏时，所述酵母膏在产酶培养基中的浓度优选为2～6g/L，更优选4～5.5g/L，最优选为5g/L。当所述氮源为蛋白胨时，所述蛋白胨在产酶培养基中的浓度优选为1.6～4.8g/L，更优选3.2～4.4g/L，最优选为4g/L。
在本发明中，所述无机氮源优选包括NH4Cl或尿素。当所述氮源为尿素时，所述尿素在产酶培养基中的浓度优选为3～5g/L，更优选为4～5g/L，最优选为4.5g/L。
在本发明中，所述产酶培养基优选包括金属离子。所述金属离子优选包括以下浓度的组分：0～0.6g/LMg2+、0.2～0.5g/L Ca2+、0～2g/LK+、0.02～0.06g/L Mn2+和0.05～0.2g/LFe2+；更优选为0.1～0.4g/LMg2+、0.3～0.45g/L Ca2+、0～1g/L K+、0.03～0.04g/LMn2 +和0.1～0.18g/LFe2+；最优选为0.2g/LMg2+、0.4g/L Ca2+、0g/LK+、0.04g/LMn2+和0.15g/LFe2 +。所述金属离子的形式以金属离子常见水溶性盐的形式添加入培养基中，例如，Mg2+的常见盐优选为MgSO4。Ca2+的常见盐优选为CaCl2。K+的常见盐优选为K2HPO4和/或KH2PO4。Fe2+的常见盐优选为FeSO4。Mn2+的常见盐优选为MnSO4。在本发明中，所述产酶培养基的pH值优选为4～7，更优选为5～6。
本发明对所述产酶培养基的配制方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的培养基的配制方法即可。
在本发明中，所述发酵培养的温度优选为28～35℃，更优选为30℃。所述发酵过程中优选进行振荡。所述振荡的速度优选为150～300rpm，更优选200rpm。所述接种量优选为1％～10％，更优选为3～8％，更优选为5％。
在本发明中，所述提取木质素降解酶的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的提取方案即可。
本发明提供了粘质沙雷氏菌菌株SM01在降解木质素中的应用。
在本发明中，所述应用优选包括以下步骤：所述粘质沙雷氏菌菌株SM01接入产酶培养基中，所述粘质沙雷氏菌菌株SM01产生木质素降解酶，产生的木质素降解酶能有效降解产酶培养基中木质素。
所述降解过程中，粘质沙雷氏菌菌株SM01的接种量优选为1～10％，更优选为3～7％，最优选为5％。所述降解过程的温度优选为28～35℃，更优选为30℃。所述降解过程中优选进行振荡。所述振荡的速度优选为150～300rpm，更优选200rpm。
在本发明中，所述粘质沙雷氏菌SM01对木质素降解率的测定方法，优选如下：将降解后的产酶培养基进行固液分离，测定上清液在280nm处的OD值，根据木质素磺酸钙标准曲线的方程计算菌株的木质素浓度，再代入公式I推算出木质素降解率。所述木质素磺酸钙标准曲线绘制方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的标准曲线绘制方法即可。
下面结合实施例对本发明提供的粘质沙雷氏菌菌株及其生产木质素降解酶和降解木质素的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
(1)菌株分离与保藏
粘质沙雷氏菌供试菌株分离自松墨天牛幼虫肠道。松墨天牛幼虫来源于福建省连江县琯头镇中榜水库周边马尾松林(N26.150°；E119.593°)，通过劈开马尾松木段的办法收集。分离得到的粘质沙雷氏菌菌株保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏标号为CGMCCNO.15175。
(2)菌株的扩大培养
将保藏的粘质沙雷氏菌的单菌落接种至灭菌的SOC培养基中，置于避光条件下30℃恒温培养箱中进行活化培养，得到扩大培养的粘质沙雷氏菌菌株。SOC培养基包括以下含量组分：2％(W/V)胰蛋白胨，0.5％(W/V)酵母提取物，0.05％(W/V)NaCl，2.5mMKCl10mMMgCl2，20mM葡萄糖，共34g；琼脂糖12g；蒸馏水1000mL。
(3)木质素磺酸钙标准曲线的绘制
配制木质素磺酸钙标准品浓度(mg·L-1)分别为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50的一组溶液，并在木质素特征吸收峰280nm处分别测出各个浓度下标准品的吸光度OD值。然后以浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制出木质素标准曲线，建立回归分析直线方程(结果见图1)。
(4)降解率测定
将活化后的粘质沙雷氏菌菌株SM01接种至含70mL以硫酸盐木质素(kraftlignin，购自Sigma)为唯一碳源的硫酸盐木质素液体培养基的250mL锥形瓶中，200rpm，30℃连续培养，定时取样测定木质素降解率和酶活性。所述硫酸盐木质素液体产酶培养基组分为硫酸盐木质素3.0g/L；(NH4)2SO42.0g/L；K2HPO41.0g/L；KH2PO41.0g/L；MgSO40.2g/L；CaCl20.1g/L；FeSO40.05g/L；MnSO40.02g/L；所述培养基的pH值为7.0。
将每天通过移液枪在超净工作台内所取的液体培养基样品，以12000g离心力离心10min取其上清液，测定其在280nm处的OD值。最后根据标准曲线的方程计算菌株的木质素浓度，再代入以下公式推算出木质素降解率。
经10d液体培养后，粘质沙雷氏菌降解木质素的情况如图2所示。从图2中可以看出，粘质沙雷氏菌具有显著的木质素降解功能，在木质素培养基中培养的前4d，其木质素降解率随时间的延长而增加，并在第4d达到高峰，降解率达15.16％，在维持2d的稳定期后，第6天开始进入衰亡期，且随时间的推移降解率逐步降低，至第10d仅为3.98％。经10d液体培养后，累积降解率达到92.5％以上。
(5)酶活力的测定
取培养后的菌液4℃，10000g的转速离心5min，取上清液，即为粗酶液。
①粘质沙雷氏菌产木质素降解酶特性的测定
采用1.2.2的方法发酵产酶，分别于培养的第1～10d每天17点取样制备粗酶液。试验过程中用未接种菌的相同培养基作为空白对照。试验设3重复。
酶活定义：每分钟1μmol底物生成产物所需的酶量定义为1个酶活单位(U)，用单位U/L来表示酶活力。
②木质素过氧化物酶(LiP)活性的测定
参考Ming Tien与T.KentKirk的研究，采用藜芦醇法。具体测定方法为：利用酶标仪，设置30℃反应条件，通过移液枪分别吸取2mM VA30μL、50mM pH＝2.5的酒石酸钠缓冲液139μL、30μL的粗酶液于酶标板上，再以1μL 0.4mM H2O2启动反应，最后在波长310nm处测定并记录1min内体系吸光度的变化值。
③锰过氧化物酶(MnP)活性的测定
依据Wariish(1992)的研究，采用二价锰氧化法。具体测定方法为：利用酶标仪，设置30℃反应条件，通过移液枪分别吸取1mM MnSO430μL、50mMpH＝4.5的丙二酸钠缓冲液139μL、30μL的粗酶液于酶标板上，再以1μL0.1mM H2O2启动反应，最后在波长270nm处测定并记录1min内体系吸光度的变化值。
④漆酶(Lac)活性的测定
参考Wolfenden和Willson(1982)的研究，采用ABTS法。具体测定方法为：利用酶标仪，设置30℃反应条件，通过移液枪分别吸取1mMABTS30μL、100mM pH＝5的醋酸钠缓冲液140μL于酶标板上，再以30μL的粗酶液启动反应，最后在波长420nm处测定并记录1min内体系吸光度的变化值。
粘质沙雷氏菌在木质素培养基中培养10d内产LiP、MnP、Lac 3种降解酶活性情况如图3。从图3中可以看出，该菌在各阶段产Lip酶的活性均最高，然后依次是MnP和Lac。对于Lip酶活性，前期随着培养时间的推进逐步升高，并在第4d天达到高峰(214.67U/L)，第5天开始开始急剧下降，至第10天其活性与MnP持平；对于MnP酶活性，前2d处于快速增长的阶段，而后3天则维持了相对稳定的高活性状态，并在第5d达到高峰期(145.47U/L)，而后开始出现逐步下降的趋势。上述两种酶活性在培养后期出现下降的现象与培养基中的木质素被菌体逐渐消耗利用等有关。相对于其他2种酶，在整个培养过程中漆酶的活性始终处于较低水平，仅在第3d出现了16.88U/L活性的小高峰。
LiP、MnP、Lac 3种降解酶活性与木质素降解率的相关性分析结果如表1所示。LiP和MnP与降解率的相关性分别达到0.740、0.798，显著高于Lac与降解率的相关性(0.405)，从而进一步表明木质素降解效率很可能主要由该菌产生的胞外酶LiP、MnP所引起的。
表1降解率与3种木质素降解酶的相关性分析
酶的种类 LiP Lac MnP 降解率
LiP 1.000 0.738 0.871 0.740
Lac 0.738 1.000 0.733 0.405
MnP 0.871 0.733 1.000 0.798
降解率 0.740 0.405 0.798 1.000
实施例2
将实施例1中保藏的粘质沙雷氏菌菌株SM01经过扩大培养后得到菌液，将菌液以接种量为5％的比例接种至液体产酶培养基中，所述液体产酶培养基为硫酸盐木质素10.0g/L；(NH4)2SO42.0g/L；K2HPO40.5g/L；KH2PO41.5g/L；MgSO40.6g/L；CaCl20.2g/L；FeSO40.05g/L；MnSO40.02g/L；酵母膏为2g/L；所述尿素的浓度优选为5g/L。所述培养基的pH值为6.5。在转速为200rpm，30℃连续培养4d，取样按照实施例1的方法测定木质素降解率。取培养后的菌液4℃，10000g的转速离心5min，取上清液，即为粗酶液。将得到的粗酶液按照实施例1的方法测定酶活力。结果见表2。
实施例3
将实施例1中分离的粘质沙雷氏菌菌株SM01经过扩大培养后得到菌液，将菌液以接种量为8％的比例接种至液体产酶培养基中，所述液体产酶培养基为硫酸盐木质素1.0g/L；(NH4)2SO42.0g/L；CaCl20.5g/L；FeSO40.2g/L；MnSO40.06g/L；酵母膏为6g/L；所述尿素的浓度优选为3g/L。所述培养基的pH值为5.0。在转速为200rpm，30℃连续培养4d，取样按照实施例1的方法测定木质素降解率。取培养后的菌液4℃，10000g的转速离心5min，取上清液，即为粗酶液。将得到的粗酶液按照实施例1的方法测定酶活力。结果见表2。
实施例4
将实施例1中分离的粘质沙雷氏菌菌株SM01经过扩大培养后得到菌液，将菌液以接种量为3％的比例接种至液体产酶培养基中，所述液体产酶培养基为硫酸盐木质素6.0g/L；(NH4)2SO42.0g/L；K2HPO40.5g/L；KH2PO40.5g/L；MgSO40.1g/L；CaCl20.3g/L；FeSO40.1g/L；MnSO40.03g/L；蛋白胨为4g/L；所述尿素的浓度为5g/L。所述培养基的pH值为6.0。在转速为200rpm，30℃连续培养4d，取样按照实施例1的方法测定木质素降解率。取培养后的菌液4℃，10000g的转速离心5min，取上清液，即为粗酶液。将得到的粗酶液按照实施例1的方法测定酶活力。结果见表2。
实施例5
将实施例1中分离的粘质沙雷氏菌菌株SM01经过扩大培养后得到菌液，将菌液以接种量为10％的比例接种至液体产酶培养基中，所述液体产酶培养基为硫酸盐木质素2.0g/L；(NH4)2SO42.0g/L；K2HPO40.5g/L；KH2PO40.5g/L；MgSO40.4g/L；CaCl20.45g/L；FeSO40.18g/L；MnSO40.04g/L；酵母膏为5.5g/L；所述尿素的浓度优选为5g/L。所述培养基的pH值为5.0。在转速为200rpm，30℃连续培养4d，取样按照实施例1的方法测定木质素降解率。取培养后的菌液4℃，10000g的转速离心5min，取上清液，即为粗酶液。将得到的粗酶液按照实施例1的方法测定酶活力。结果见表2。
实施例6
将实施例1中分离的粘质沙雷氏菌菌株SM01经过扩大培养后得到菌液，将菌液以接种量为5％的比例接种至液体产酶培养基中，所述液体产酶培养基为硫酸木质素的浓度为3g/L，0.2g/L MgSO4、0.4g/L CaCl2、0.04g/L MnSO4和0.15g/LFeSO4，所述酵母膏为4g/L，所述尿素的浓度为5g/L。所述培养基的pH值为7.0。在转速为200rpm，30℃连续培养4d，取样按照实施例1的方法测定木质素降解率。取培养后的菌液4℃，10000g的转速离心5min，取上清液，即为粗酶液。将得到的粗酶液按照实施例1的方法测定酶活力。结果见表2。
对比例1
采用实施例2所述的方案，不同之处为所述液体产酶培养基为硫酸木质素的浓度为20g/L，测得粘质沙雷氏菌菌株对木质素的降解率和产酶的活性。结果见表2。
对比例2
采用实施例2所述的方案，不同之处为所述液体产酶培养基的pH值为8.0，测得粘质沙雷氏菌菌株对木质素的降解率和产酶的活性。结果见表2。
对比例3
采用实施例2的方案，不同之处为所述液体产酶培养基中氮源为干酪素1g/L，测得粘质沙雷氏菌菌株对木质素的降解率和产酶的活性。结果见表2。
对比例4
采用实施例2的方案，不同之处为菌株为S.marcescens SM019。S.marcescensSM019菌株分离自松墨天牛幼虫肠道。结果见表2。
表2实施例2～6和对比例1～4中对木质素降解率和产酶活性一览表
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种粘质沙雷氏菌菌株SM01，Serratia marcescens，保藏编号为CGMCC NO.15175。
2.权利要求1所述粘质沙雷氏菌菌株SM01在生产木质素降解酶中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述木质素降解酶包括木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用包括：将所述粘质沙雷氏菌菌株SM01接种至产酶培养基上发酵培养；所述产酶培养基中硫酸木质素的浓度为1～10.0g/L。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，粘质沙雷氏菌菌株SM01的产酶培养基中包括有机氮源或无机氮源；所述有机氮源包括蛋白胨或酵母膏；所述无机氮源包括NH4Cl或尿素。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，当所述有机氮源为酵母膏时，所述酵母膏在产酶培养基中的浓度为2～6g/L。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，当所述无机氮源为尿素时，所述尿素在产酶培养基中的浓度为3～5g/L。
8.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，粘质沙雷氏菌菌株SM01的产酶培养基包括金属离子；所述金属离子包括以下浓度的组分：0～0.6g/L的Mg2+、0.2～0.5g/L的Ca2+、0～2g/L的K+、0.02～0.06g/L的Mn2+和0.05～0.2g/L的Fe2+。
9.根据权利要求2～8任意一项所述的应用，其特征在于，粘质沙雷氏菌菌株SM01的产酶培养基的pH值为4～7。
10.权利要求1所述粘质沙雷氏菌菌株SM01在降解木质素中的应用。
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