CN111826326B - 一种用于降解造纸废水木质素的菌株及其筛选方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于降解造纸废水木质素的菌株及其筛选方法和应用，本发明提供的沙雷氏菌Serratia sp.AXJ‑M菌株的保藏编号为CCTCC NO：M2020273。该菌株用于降解木质素的应用也是本发明的保护范围。本发明提供的嗜热耐碱菌株Serratia sp.AXJ‑M能够利用木质素作为唯一碳源和能源生长，而且本发明提供的嗜热耐碱菌株Serratia sp.AXJ‑M对温度、pH的适应范围比较广，可以在高温强碱性环境中迅速有效的降解木质素，对造纸废水中木质素的去除效率极高，可以有效地解决现有技术中微生物难以用于降解造纸废水中木质素的问题，从而解决环境各介质中木质素的污染问题，具有高效、无二次污染、成本低的优点，在环境处理以及微生物技术领域具有良好的应用前景。

Description

一种用于降解造纸废水木质素的菌株及其筛选方法和应用

技术领域

本发明涉及环境处理以及微生物技术领域，具体涉及一种嗜热耐碱并能够高效降解造纸废水中木质素的菌株及其筛选方法和应用。

背景技术

造纸工业废水是一种严重的工业污染源，因为其较难处理，各个国家均将造纸废水视为公害重点防范和监管对象。据联合国环境组织估计，全世界造纸工业每年所排的废水超过274亿吨以上。我国有7000多家中小型造纸厂，每年排放废水约21-24亿吨，污染物总量为119-136万吨，约占工业废水总排放量的10％，对环境的污染仅次于化工和冶金行业，对人民的生活和生态安全造成严重威胁。

造纸废水对环境危害的一个主要原因是废水中含有高浓度的木质素及其衍生物，而当含有木质素的废水未经处理或得不到有效处理而直接排入水体时会导致水体缺氧，从而使兼性微生物和厌氧微生物大量繁殖，导致纳污水体发生腐败发臭，进而致使水质恶化。因此，造纸废水处理的关键在于开发出安全绿色处理废水中的木质素的技术。

目前处理造纸废水的主要方法有：碱回收法、酸析法、生物法等。其中，碱回收法是造纸废水治理研究中最成熟的处理方式，也是现阶段造纸厂实际运行较好的治理技术，但碱回收法在应用时存在着投资大、能耗高、工艺复杂以及对备料、黑液提取、除硅要求高等缺点，处理成本高，因此很难被造纸厂尤其是中小型造纸厂所接受。酸析法操作较简单，通过加酸将造纸废水中的木质素分离出来，对木质素进行回收，应用方便，但操作过程中需要加入大量无机酸，上清液呈强酸性，后续处理较难进行，治理成本高，还会造成二次污染。相较于目前常用的碱回收法及酸析法等，利用生物法处理造纸废水中的木质素具有成本低、不对环境造成二次污染等优点，具有很好的应用前景。但传统的生物处理方法降解造纸废水的木质素也存在着一些缺陷，最主要的原因是目前的造纸工艺中主要采用的是碱法蒸煮工艺处理原料，造纸废水的pH很高，利用生物法处理这些黑液时需先调低pH值以适应微生物生长，这大大增加了工艺的复杂程度及成本。此外，造纸废水的环境温度可高达40-50℃，微生物在这种极端环境中很难适应生长。因此，利用具有耐碱性和耐热性的微生物直接处理造纸废水去除废水中的木质素，将具有非常重要的应用价值。现有技术中，降解木质素的微生物能在中性以及中温条件下降解木质素，但未见报道有同时能在高pH和高温条件下存活并且高效降解木质素的微生物。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明提供一种降解木质素的菌株，该菌株嗜热耐碱，能够利用木质素为碳源和能源降解，在造纸废水处理中有很大的潜力。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种菌株，所述菌株为Serratia sp.AXJ-M，其保藏编号为CCTCC NO：M2020273。

本发明的沙雷氏菌Serratia sp.AXJ-M已于2020年7月3日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山)，保藏号为CCTCCNO：M2020273，分类命名为Serratia sp.AXJ-M，经检测存活。

本发明的沙雷氏菌Serratia sp.AXJ-M分离自造纸厂土壤。

进一步地，所述Serratia sp.AXJ-M菌株的16S rRNA序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还提供了一种菌株的筛选方法，所述菌株为Serratia sp.AXJ-M CCTCCNO：M2020273，该筛选方法包括以下步骤：

(1)称取土壤样品于含有木质素的培养液中进行振荡培养，然后取培养物加入新的液体无机盐培养基中，加入木质素传代培养；

(2)将经过多次传代培养得到的培养物稀释，得到稀释菌液，取稀释菌液涂布于无机盐固体培养基平板上，加入木质素后进行培养；挑取培养基上较大的单菌落，分离、纯化，获得筛选菌株；

(3)将筛选菌株接至新的液体无机盐培养基中，加入木质素后摇床培养一段之间，测定培养基中的木质素含量，筛选出培养基中木质素含量降低最多的菌株，即为木质素的高效降解菌株；

(4)将所述步骤(3)中得到的所述菌株进行16S rRNA鉴定，并于NCBI中进行BLAST比对构建系统发育树。

本发明提供的嗜热耐碱高效木质素降解菌株的筛选方法能够通过简便高效的方法得到以木质素为唯一碳源的菌株，该菌株对于造纸废水中的污染物木质素具有较高的降解效率，并且能够适应造纸废水的高温和强碱环境。

进一步地，步骤(1)液体培养液中木质素的浓度为1.5g/L，振荡培养时的培养条件为：培养温度为50℃，振荡频率为160rpm，振荡培养时间为48h。

进一步地，含有木质素的所述液体无机盐培养基包括以下重量份的组分：木质素1.5g，(NH₄)₂SO₄ 1.4g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，K₂HPO₄ 2.0g，CaCl₂ 0.3g，FeSO₄·7H₂O 0.005g，MnSO₄ 0.0016g，ZnCl₂ 0.0017g和CoCl₂ 0.0017g；所述液体无机盐培养基的pH值为7.0-7.5。具体地，加入1000mL蒸馏水制备成液体无机盐培养基，以NaOH调节pH值为7.0-7.5。

进一步地，步骤(2)的具体操作为：将经过5-6次传代培养的培养物稀释成稀释菌液，取稀释菌液涂布至无机盐固体培养基平板，加入木质素后于培养箱中28℃-30℃培养6-9天。

进一步地，所述步骤(5)中用于所述16S rRNA鉴定时使用的通用引物包括7F：5’-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’及1540R：5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’。

本发明还提供了Serratia sp.AXJ-M CCTCC NO：M2020273菌株在环境治理领域中的应用。

本发明还提供了Serratia sp.AXJ-M CCTCC NO：M2020273菌株用于处理含木质素的造纸废水。

优选地，所述菌株的最适生长降解条件包括：温度为50℃、pH为10.0、接种量为4％、摇床转速160rpm、培养时间为7d。

与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：

(1)本发明提供了一种新菌株Serratia sp.AXJ-M CCTCC NO：M2020273；

(2)菌株Serratia sp.AXJ-M能够以木质素作为唯一碳源和能源生长，在高温强碱性环境中迅速有效的降解木质素；

(3)本发明提供的嗜热耐碱菌株Serratia sp.AXJ-M对造纸废水中木质素的去除效率极高，从而解决环境各介质中木质素的污染问题，能够用于环境修复工程；

(4)本发明提供的嗜热耐碱菌株Serratia sp.AXJ-M对温度和pH的适应范围比较广，可以有效地解决现有微生物难以直接用于处理造纸废水中木质素的问题；

(5)本发明提供的嗜热耐碱菌株Serratia sp.AXJ-M用于生物降解造纸废水木质素具有高效、无二次污染、成本低的优点，具有良好的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。在所有附图中，类似的元件或部分一般由类似的附图标记标识。附图中，各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。

图1为本发明的一个实施例的菌株Serratia sp.AXJ-M菌体形态的扫描电镜图；

图2为本发明的一个实施例的菌株Serratia sp.AXJ-M进行16S rRNA序列分析比对后构建的系统发育树示意图；

图3为本发明的一个实施例的菌株在不同温度条件下的无机盐液体培养基中的细胞生长密度及木质素降解率数据图；

图4为本发明的一个实施例的菌株在不同pH条件下的无机盐液体培养基中的细胞生长密度及木质素降解率数据图；

图5为本发明的一个实施例的菌株在不同接种量条件下的无机盐液体培养基中的细胞生长密度及木质素降解率数据图；

图6为本发明的一个实施例的菌株在不同摇床转速条件下的无机盐液体培养基中的细胞生长密度及木质素降解率数据图；

图7为本发明的一个实施例的菌株在不同培养时间下的无机盐液体培养基中的细胞生长密度及木质素降解率数据图；

图8为本发明的一个实施例中菌株Serratia sp.AXJ-M处理造纸废水中木质素和色度去除数据图；

图9为本发明的一个实施例中菌株Serratia sp.AXJ-M处理造纸废水中COD、BOD和总酚去除数据图。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。

下面的实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。

实施例1：Serratia sp.AXJ-M的分离筛选与鉴定

1、样品

土壤样品：取自中国黑龙江省哈尔滨市某造纸厂排污口附近的距地表10cm处土壤样品，4℃冰箱保存备用。

2、培养基：

液体培养基：(NH₄)₂SO₄ 1.4g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，K₂HPO₄ 2.0g，CaCl₂ 0.3g，FeSO₄·7H₂O 0.005g，MnSO₄ 0.0016g，ZnCl₂ 0.0017g，CoCl₂ 0.0017g，蒸馏水1000mL，NaOH调节pH值为7.0～7.5。

含木质素的培养基为在上述液体培养基中添加木质素1.5g。

固体培养基是在液体培养基中加入1.5％的琼脂粉制作而成。

3、分离筛选及驯化操作：

取5.0g土壤样品于装有100mL碱性无机盐培养基的250mL锥形瓶中，加入木质素至终浓度为1.5g/L。将锥形瓶置于50℃、160rpm的条件下摇床培养。5天后转培养，按5％接种量将1mL培养物转接至新鲜的含木质素的100mL碱性液体无机盐培养基中，且木质素的终浓度为1.5g/L，在前述条件下培养，每隔5天进行转接，重复三次，将最后一次培养得到的培养液制备成不同稀释度的稀释液，并涂布于含1.5g/L木质素的碱性无机盐固体培养基上，50℃下培养直至长出单菌落，观察菌落特征。挑取生长良好且菌落形态不同的菌划线培养，3-5天后重新挑取单菌落划线培养，如此反复3-5次得到纯化的菌种。

经过大量的富集培养，分离得到能够在高温强碱条件下并含1.5g/L木质素的分离培养基上生长的菌株，并使用高效液相色谱法(HPLC)验证其降解效果。进一步筛选后，获得一个编号为AXJ-M的菌株，命名为降解菌AXJ-M，该菌株能够在纯培养条件下，将初始浓度1.5g/L的木质素在7d内降解50％以上。

HPLC测定条件：Waters 600E高效液相色谱仪(美国Waters)；检测器Waters 2487紫外检测器(美国Waters)；色谱柱：C18反相柱(SunFire^TM，150nmX 4.60mm)；流动相为甲醇/水/冰醋酸(70/30/0.5，V/V)，流速1.0mL/min；柱温25℃；检测波长：254nm；进样量：5uL。配制不同浓度梯度的木质素标准品，测定相应浓度下的峰面积，绘制标准曲线。将样品中的木质素峰面积由标准曲线换算得出木质素浓度。

降解率＝(初始浓度-终浓度)/初始浓度。

将获得的高效木质素降解菌一份接种于LB斜面培养基中，4℃保存；同时于甘油中保存于-20℃下。

4、降解菌的鉴定

(1)降解菌AXJ-M的形态学鉴定

将处于对数生长期，且菌落大小稳定，上述步骤一分离并纯化得到的降解菌AXJ-M进行单菌落状态描述，并对处于对数生长期的所述降解菌AXJ-M经涂片染色后采用光学显微镜观察菌体的形态。

结果表明，上述步骤一分离并纯化得到的降解菌AXJ-M在牛肉膏蛋白胨固体平板上生长很快，呈圆形或近似圆形、表面光滑湿润、边缘整齐、轮廓清晰、质地软、淡黄色菌落、生长较快。扫描电镜结果见图1，菌体细胞杆状，无芽孢，电子显微镜下观察杆状细胞长直径>1μm。

(2)生理生化特征分析

参考《微生物学实验》(沈萍，范秀容，李广武.微生物学实验(第三版).北京：高等教育出版社，1999)和《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册.北京：科学出版社，2011)以及采用Biolog GEN III系统测定降解菌AXJ-M的生理生化特征。

对培养至对数期的上述菌体进行革兰氏染色。光学显微镜下，菌株经革兰氏染色显红色，呈阴性。生理生化测定结果显示，接触酶阳性，氧化酶阳性，VP试验阳性，具体见表1。

表1菌株Serratia sp.AXJ-M的生理生化特征

生理生化实验	反应
		精氨酸水解酶试验	－
脲酶试验	－
		VP试验	+
氧化酶试验	+
		触酶试验	+
碱性磷酸酶试验	－
		胰蛋白酶试验	－
硝酸还原酶试验	+
		胰蛋白酶试验	－
β-尿激酶试验	－
		葡萄糖发酵试验	+
明胶液化试验	+
		半乳糖苷酶试验	+
β-岩藻糖苷酶试验	－

+阳性；-阴性

此外，该菌可利用76种碳源，具体见表2。

表2BIOLOG分析菌株Serratia sp.AXJ-M对不同碳源的利用能力

(3)降解菌16S rDNA的同源性分析

用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒(由生工生物工程有限公司生产)提取菌株AXJ-M的全基因组DNA，然后以提取的基因组DNA为模板，以细菌16S rDNA通用引物(7F，1540R；生工生物工程股份有限公司合成)，扩增菌株的16S rDNA片段。

16S rDNA通用引物7F：5’-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’，1540R：5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’。

PCR扩增体系(50μL)：模板DNA 1-2μL，引物F 2μL，引物R 2μL，dNTP(mix)2uL，ddH₂O 16μL，Taq Buffer(with Mgcl₂)，Taq酶0.5μL。

PCR扩增程序：95℃预变性3-5min，95℃变性30s；55-60℃退火25-30s；72℃延伸30-50s，循环35次；最后72℃延伸5-10min，4℃保存。

扩增产物进行10g/L琼脂糖凝胶电泳分析，纯化和回收PCR产物，送生物公司进行序列测定，AXJ-M的16S rDNA序列如SEQ ID NO：1所示：

GGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGTAGCACAGGGAGCTTGTTCCTGGGTGACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCTACGGACCAAAGTGGGGGACCTTCGGGCCTCATGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAATGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGCGAGGAGGAAGGGTAGTGTGTTAATAGCACATTGCATTGACGTTACTCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTTTGTTAAGTCAGATGTGAAATCCCCGCGCTTAACGTGGGAACTGCATTTGAAACTGGCAAGCTAGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAATTCGCTAGAGATAGCTTAGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGCGTAATGGCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGTATACAAAGAGAAGCGAACTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTACGTCGTAGTCCGGATCGGAGTCTGCAACTCGACTCCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGAATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTACCACTTTGTGATTCATGACT。

将获得的序列提交NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)进行Megablast，获取同源性高的相关序列，用ClustalX软件进行比对，Mega软件进行系统发育分析，采用邻接法构建系统发育树。根据16S rDNA序列所作的系统发育树如图2所示。菌株AXJ-M已提交GenBank，登录号MN3658899。

将菌株AXJ-M的16S rDNA序列提交到GenBank数据库在GenBank核酸序列数据库中进行同源序列搜索，AXJ-M与Serratia sp.P2ACOL2(AJ251467)的相似性为99.93％，结合菌株的生理生化特征，鉴定AXJ-M为沙雷氏菌(Serratia sp.AXJ-M)。

实施例2：外界环境因素对降解菌降解效果的影响

①培养温度对降解菌AXJ-M降解率的影响：

向经过灭菌处理的含1.5g/L木质素的无机盐培养基中接种2％活化好的AXJ-M菌株悬液，分别于20℃、30℃、40℃、50℃、60℃下培养7天，要素为150rpm、pH为8.0，测定各培养条件下的降解率。结果如图3所示，在50℃下条件下木质素降解率最佳。

②培养基pH对降解菌AXJ-M降解率的影响：

分别配置pΗ为6、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0的含1.5g/L木质素的无机盐培养基，接种2％的AXJ-M的PBS菌株悬液，于50℃、150rpm的条件下恒温摇床培养7天，测定各培养条件下的降解效果。结果如图4所示，在pH为10.0的条件下木质素降解率更佳。

③接种量对降解菌AXJ-M降解率的影响：

向经过灭菌处理的含1.5g/L木质素的无机盐培养基中分别接种1％、2％、3％、4％、5％、6％的降解菌AXJ-M的PBS菌悬液，于50℃、pH 10.0、150rpm的恒温摇床上培养7d，测定各处理的降解效果。结果如图5所示，4％降解菌AXJ-M的PBS菌悬液时的木质素降解率最佳。

④摇床转速对降解菌AXJ-M降解率的影响：

向经过灭菌处理的含1.5g/L木质素的无机盐培养基中接种4％活化好的降解菌AXJ-M菌株悬液，分别于120rpm、140rpm、160rpm、180rpm、200rpm的摇床速度下并在50℃、pH10.0的条件下恒温摇床培养7d，测定各处理的降解效果。结果如图6所示，160rpm时木质素降解率最佳。

⑥培养时间对降解菌AXJ-M降解效果的影响：

向灭好菌的1.5g/L木质素的无机盐培养基中接种4％的降解菌AXJ-M菌株悬液，于50℃、pH 10.0、160rpm的恒温摇床上培养7d，培养时每隔24小时取一次样，测定各处理的降解效果。结果如图7所示。

根据图3至图7的结果显示，木质素降解菌AXJ-M的最佳降解条件为：50℃、pH值为10.0、接种量为4％、摇床转速160rpm。在最佳降解条件下，菌株培养到第7天时可对1.5g/L木质素的降解率达到60％。值得注意的是，降解菌菌株AXJ-M在pH值达到12.0时，仍可降解40％的木质素。当环境温度达到60℃时，降解菌菌株AXJ-M仍可降解50％以上的木质素。

实施例3：降解菌AXJ-M对造纸废水的处理效果

造纸废水取自某造纸厂废水，表3为实际废水中各参数值。

表3造纸废水物理化学参数测定结果

取10mL造纸废水于250mL三角瓶中，调节pH至9.53后按4％接种量接种降解菌AXJ-M，并设置未接种菌剂的造纸废水作为对照，均置于160rpm、50℃条件下发酵培养，定期取样测定COD、BOD、色度、总酚含量及木质素含量，其结果如图8和图9所示。结果显示处理7天后，废水的COD去除率、BOD去除率、色度去除率、总酚去除率及木质素去除率分别达到85％、80％、80％、95％和60％。由此可知，本发明降木质素的微生物可以高效去除造纸废水中的主要污染物木质素并对其他目标参数去除率较为理想，适用于污染负荷大且环境复杂的造纸废水，并能使造纸废水在短时间内达到良好处理效果。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (5)

1.一种菌株，其特征在于，所述菌株为Serratia sp.AXJ-M，其保藏编号为CCTCC NO：M2020273。

2.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，所述Serratia sp.AXJ-M菌株的16S rRNA序列如SEQ ID NO：1所示。

3.Serratia sp.AXJ-M CCTCC NO：M2020273菌株用于处理含木质素的造纸废水。

4.Serratia sp.AXJ-M CCTCC NO：M2020273菌株用于降解造纸废水木质素。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，Serratia sp.AXJ-M CCTCC NO：M2020273菌株用于降解造纸废水木质素的生长降解条件为：所述菌株的最适生长降解条件包括：温度为50℃、pH为10.0、接种量为4％、摇床转速160rpm、培养时间为7d。

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