CN102363757A - 一株2-酮基-d-葡萄糖酸高产菌株的筛选方法及该菌株的发酵方法 - Google Patents

一株2-酮基-d-葡萄糖酸高产菌株的筛选方法及该菌株的发酵方法 Download PDF

Info

Publication number
CN102363757A
CN102363757A CN2011103174355A CN201110317435A CN102363757A CN 102363757 A CN102363757 A CN 102363757A CN 2011103174355 A CN2011103174355 A CN 2011103174355A CN 201110317435 A CN201110317435 A CN 201110317435A CN 102363757 A CN102363757 A CN 102363757A
Authority
CN
China
Prior art keywords
keto
gluconic acid
bacterial strain
serratia
fermentation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2011103174355A
Other languages
English (en)
Inventor
刘立明
牛盼清
杨爱华
杨松鑫
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangnan University
Original Assignee
Jiangnan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangnan University filed Critical Jiangnan University
Priority to CN2011103174355A priority Critical patent/CN102363757A/zh
Publication of CN102363757A publication Critical patent/CN102363757A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Landscapes

  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明阐述了一株高产2-酮基-D-葡萄糖酸沙雷氏菌的筛选方法及应用该菌株生产2-酮基-D-葡萄糖酸，属于生物工程领域。本发明是称取约0.2g土壤于20ml 0.85％无菌生理盐水中，振荡混匀之后将菌悬液涂布至5％盐浓度的牛肉膏蛋白胨培养基上30℃培养36h，将产紫红色素的菌落经发酵培养基培养后，采用内标法经高效液相色谱进行定性分析，并对筛选菌株进行形态学、生理生化及分子生物学鉴定，获得的一株高产2-酮基-D-葡萄糖酸的沙雷氏菌；本发明同时公开一种采用该菌生产2-酮基-D-葡萄糖酸的方法，采用本方法发酵36h2-酮基-D-葡萄糖酸的产量为181.2g/L。

Description

一株2-酮基-D-葡萄糖酸高产菌株的筛选方法及该菌株的发酵方法
技术领域
本发明涉及一株2-酮基-D-葡萄糖酸高产菌株的筛选方法，以及用该菌株发酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸的方法。
背景技术
2-酮基-D-葡萄糖酸(2-keto-D-gluconic acid，2KGA)，是目前大规模生产的有机酸之一，主要用于食品抗氧化剂D-异抗坏血酸钠(sodium erthorbate，EN)以及D-异抗坏血酸(erythorbicacid，EA)的合成，D-异抗坏血酸又称异维生素C，在食品工业上被广泛用为食品抗氧化剂。2KGA的生产方法主要有酶法、化学合成法、发酵法3种，目前工业中主要采用细菌发酵法生产。
国内外2KGA发酵通常采用假单胞菌属(Pseudomonas)的细菌，尤其是荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)。通常以淀粉水解糖作为碳源，玉米浆作为氮源，控制pH6.0-7.0。在较高的溶氧条件下，添加18％左右的葡萄糖，温度维持在28-30℃，葡萄糖转化率在80％以上，发酵周期60h左右。由于该发酵是一个产酸过程，需要在培养基中添加3-5％的CaCO3，也可以用NaOH、氨气、氨水代替CaCO3。而将沙雷氏菌作为发酵菌种在国内很少有见报道。
国内目前生产2KGA主要采用分批发酵，初始葡萄糖浓度一般不超过18％，因为葡萄糖浓度过高，发酵周期将延长，转化率也降低。有关补料发酵生产2KGA的工艺也有报道，用氨水代替CaCO3，可以将葡萄糖的浓度提高到30％左右。
同时我国国内发酵生产2KGA也存在一些问题：噬菌体污染严重；发酵周期偏长；发酵生产效率不高，能源消耗高于国外同类型企业。
发明内容
本发明提供一株2-酮基-D-葡萄糖酸高生产菌及其筛选方法和用该菌株发酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸，发酵周期比文献报道缩短12h左右，显著提高了生产强度。
本发明的技术方案：
1、一种产2-酮基-D-葡萄糖酸沙雷氏菌的筛选方法：
1)沙雷氏菌的初步分离纯化
在江南大学食品与科学国家重点实验室附近采集土样，称取约0.2g土壤于20ml 0.85％无菌生理盐水中，振荡混匀之后将菌悬液涂布至5％盐浓度的牛肉膏蛋白胨培养基上30℃培养36h，将产紫红色素的菌落作为进一步筛选的疑似菌株，编号保存；
2)产2-酮基-D-葡萄糖酸沙雷氏菌的筛选
将上述分离纯化得到的菌种接种于5％葡萄糖的牛肉膏蛋白胨培养基中，培养36h后离心收集发酵液，发酵液采用内标法经高效液相色谱进行定性分析，使得2-酮基-D-葡萄糖酸钙标准品峰高增高的菌株即为产2-酮基-D-葡萄糖酸的沙雷氏菌。
2、根据权利要求1所述一种产2-酮基-D-葡萄糖酸沙雷氏菌的筛选方法，其筛选得到产2-酮基-D-葡萄糖酸的沙雷氏菌的鉴定方法如下：
1)形态学鉴定
菌落形态、细胞形态、革兰氏染色；
2)生理生化鉴定(见表1)
3)16S rDNA分子生物学鉴定
用细菌基因组提取试剂盒提取细菌基因组DNA，采用通用引物进行PCR扩增，扩增产物用胶回收试剂盒回收纯化，并连接至克隆载体pMD 18T Vector，转化到大肠杆菌JM109中，利用克隆载体的青霉素抗性筛选到阳性转化子，并用通用引物对转化子进行质粒PCR鉴定。
阳性克隆测序所得16S rDNA序列与GenBank数据库中的核苷酸序列进行同源性分析，得到与之亲缘关系最近的菌种Serratia sp，同源性达99％。
通过形态学、生理生化及16S rDNA分子生物学鉴定确定该菌株为沙雷氏菌，并命名为Serratia sp.FMME043。
3、本发明公开的一种2-酮基-D-葡萄糖酸的高产菌种，其特征是采用Serratia sp.FMME043为出发菌株，以种子培养和液体发酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸；
1)种子培养：
种子培养基以g/L计：牛肉浸取物3，蛋白胨5，NaCl 5，初始PH 6.8-7.2；
培养条件：温度30℃、摇床转速200rpm条件下，培养11-12h；
2)液体发酵培养：
发酵培养基以g/L计：葡萄糖140-200，(NH4)2SO4 1.93，Na2SO4 0.5，MgSO4·7H2O 0.8，KH2PO4 0.1-0.5，MnCl2·4H2O 0.036，FeSO4·7H2O 0.036，PH6.8-7.2；
发酵条件：接种量10％，温度30℃、摇床转速200条件下，发酵24-36h。
4、2-酮基-D-葡萄糖酸产量的测定
取发酵液8000rpm离心10min，收集上清液并稀释适当倍数，并以2-酮基-D-葡萄糖酸钙作为标准品，配制1、2.5、5、7.5、10g/L的标准溶液。将上清液与标准溶液经0.22μm微孔滤膜过滤后，用高效液相色谱法测定2-酮基-D-葡萄糖酸的含量。
色谱条件：
高效液相色谱仪：Agilent 1200system；
色谱柱：BioRad公司Aminex HPX-87H；
流动相：0.5mmol/L稀硫酸用0.45μm滤膜过滤；
柱温：35℃；
检测器：示差检测器(RID)；
进样量：10μl
流速：0.5ml/min。
标准曲线在1-10g/L之间呈现良好的线性关系(图1)，回归方程：y＝8.604x-1.2627，R2＝0.9991。
附图说明
图1 2-酮基-D-葡萄糖酸钙标准曲线。
图2色谱检测结果，10g/L 2-酮基-D-葡萄糖酸钙标样。
图3色谱检测结果，24h发酵液(稀释10倍)。
具体实施方式
以下是沙雷氏菌(Serratia sp.FMME043)筛选、鉴定及发酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸的实施例。
实施例1
称取约0.2g土壤于20ml 0.85％无菌生理盐水中，振荡混匀之后将菌悬液涂布至5％盐浓度的牛肉膏蛋白胨培养基上30℃培养24h，将产紫红色素的菌落接种至发酵培养基中进行复筛，30℃培养24h后离心收集发酵液，发酵液经高效液相方法中的内标法进行分析，用2-酮基-D-葡萄糖酸钙标准品作内标，使2-酮基-D-葡萄糖酸钙准品峰高增高的菌株即为产2-酮基-D-葡萄糖酸菌株。
实施例2
对筛选的菌株按《微生物分类学》进行形态特征鉴定，该菌株为短杆状，革兰氏阴性菌，无芽孢，周生鞭毛，能运动。菌落呈圆形，边缘光滑，表面湿润，微凸起，产生紫红色色素，有恶臭味。生理生化特性(见表1)，并按细菌基因组提取试剂盒提取方法提取基因组DNA，以P1和P2为正向和反向引物：
P1：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，
P2：5’-GGCTACCTTGTTACGACTT-3’。
用PCR扩增16S rDNA基因，委托华大基因研究中心进行16S rDNA测序，得到本菌株部分16S rDNA序列(GenBank登录号：JF794580)后，在NCBI网站上用BLAST检索工具进行同源性比对分析。基于16S rDNA序列分析和生理生化特性鉴定，结合对该菌的生长和发酵特性研究，认为是沙雷氏菌，命名为Serratia sp.FMME043。
表1菌株(FMME043)生理生化鉴定结果
Figure BSA00000593881700041
注：表中“+”代表阳性，“-”代表阴性。
实施例3
菌株保藏于终浓度为15％的甘油管中，取200μl保藏菌液接入50ml 5％盐浓度的牛肉膏蛋白胨培养基上30℃培养12h，以10％的接种量接入装有70ml发酵培养基的750mL二刺三角瓶进行发酵培养。发酵培养基见权利要求2，初始葡萄糖为140g/L。在30℃，200rpm条件下发酵24h，用HPLC测定发酵液中的2-酮基-D-葡萄糖酸的含量。产量为119.7g/L，产率0.84g/g，生产强度3.74g/(L·h)。
实施例4
菌株保藏于终浓度为15％的甘油管中，取200μl保藏菌液接入50ml 5％盐浓度的牛肉膏蛋白胨培养基上30℃培养12h，以10％的接种量接入装有70ml发酵培养基的750mL二刺三角瓶进行发酵培养。发酵培养基见权利要求2，初始葡萄糖为200g/L。在30℃，200rpm条件下发酵36h，用HPLC测定发酵液中的2-酮基-D-葡萄糖酸的含量。产量为181.2g/L，产率0.90g/g，生产强度5.03g/(L·h)。

Claims (3)

1.一种2-酮基-D-葡萄糖酸高产菌沙雷氏菌的筛选方法，其特征为：
1)沙雷氏菌的初步分离纯化
称取约0.2g土壤于20ml 0.85％无菌生理盐水中，振荡混匀之后将菌悬液涂布至5％盐浓度的牛肉膏蛋白胨培养基上30℃培养36h，将产紫红色素的菌落作为进一步筛选的疑似菌株，编号保存；
2)产2-酮基-D-葡萄糖酸沙雷氏菌的筛选
将上述分离纯化得到的菌种接种于5％葡萄糖的牛肉膏蛋白胨培养基中，培养36h后离心收集发酵液，发酵液采用内标法经高效液相色谱进行定性分析，使得2-酮基-D-葡萄糖酸钙标准品峰高增高的菌株即为产2-酮基-D-葡萄糖酸的沙雷氏菌。
2.根据权利要求1所述一种产2-酮基-D-葡萄糖酸沙雷氏菌的筛选方法，其筛选得到产2-酮基-D-葡萄糖酸沙雷氏菌经形态学、生理生化及16S rDNA分子生物学鉴定为沙雷氏菌，并命名为Serratia sp.FMME043。
3.一种2-酮基-D-葡萄糖酸的生产方法，其特征是采用Serratia sp.FMME043为出发菌株，以种子培养和液体发酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸钙；
1)种子培养：牛肉膏3g/L，蛋白胨5g/L，NaCl 5g/L初始PH6.8-7.2；
培养条件：温度30℃、摇床转速200r/min条件下，培养11-12h；
2)液体发酵培养：葡萄糖140-200g/L，(NH4)2SO4 1.93g/L，Na2SO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O0.8g/L，KH2PO4 0.5g/L，MnCl2·4H2O 0.036g/L，FeSO4·7H2O 0.036g/L，初始PH6.8-7.2；
发酵条件：接种量10％，温度30℃、摇床转速200r/min条件下，发酵24-36h。
CN2011103174355A 2011-10-19 2011-10-19 一株2-酮基-d-葡萄糖酸高产菌株的筛选方法及该菌株的发酵方法 Pending CN102363757A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2011103174355A CN102363757A (zh) 2011-10-19 2011-10-19 一株2-酮基-d-葡萄糖酸高产菌株的筛选方法及该菌株的发酵方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2011103174355A CN102363757A (zh) 2011-10-19 2011-10-19 一株2-酮基-d-葡萄糖酸高产菌株的筛选方法及该菌株的发酵方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN102363757A true CN102363757A (zh) 2012-02-29

Family

ID=45690351

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2011103174355A Pending CN102363757A (zh) 2011-10-19 2011-10-19 一株2-酮基-d-葡萄糖酸高产菌株的筛选方法及该菌株的发酵方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN102363757A (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102634473A (zh) * 2012-05-16 2012-08-15 哈尔滨工业大学（威海） 一种沙雷氏菌合成培养基及其发酵液的制备方法
CN105695520A (zh) * 2016-04-21 2016-06-22 江南大学 一种提高发酵法生产2-酮基-d-葡萄糖酸产量的方法
CN111826326A (zh) * 2020-08-05 2020-10-27 江西农业大学 一种用于降解造纸废水木质素的菌株及其筛选方法和应用
CN114152701A (zh) * 2021-12-22 2022-03-08 浙江圣达生物研究院有限公司 用hplc-elsd测定发酵液中2kga含量的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
张炜: "2-酮基-D-葡萄糖酸产生菌的筛选、发酵工艺优化及其动力", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库（工程科技I辑）》 *
张炜等: "沙雷氏菌Serratia+sp.BK-98发酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸的工艺优化及动力学研究", 《化工学报》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102634473A (zh) * 2012-05-16 2012-08-15 哈尔滨工业大学（威海） 一种沙雷氏菌合成培养基及其发酵液的制备方法
CN102634473B (zh) * 2012-05-16 2015-05-20 哈尔滨工业大学（威海） 一种沙雷氏菌合成培养基及其发酵液的制备方法
CN105695520A (zh) * 2016-04-21 2016-06-22 江南大学 一种提高发酵法生产2-酮基-d-葡萄糖酸产量的方法
CN105695520B (zh) * 2016-04-21 2019-12-24 江南大学 一种提高发酵法生产2-酮基-d-葡萄糖酸产量的方法
CN111826326A (zh) * 2020-08-05 2020-10-27 江西农业大学 一种用于降解造纸废水木质素的菌株及其筛选方法和应用
CN111826326B (zh) * 2020-08-05 2023-01-03 江西农业大学 一种用于降解造纸废水木质素的菌株及其筛选方法和应用
CN114152701A (zh) * 2021-12-22 2022-03-08 浙江圣达生物研究院有限公司 用hplc-elsd测定发酵液中2kga含量的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102220270B (zh) 一种产硫酸软骨素菌株的筛选方法及用该菌株发酵法生产硫酸软骨素
CN107629973B (zh) 一株产β-苯乙醇的库德里阿兹威毕赤酵母菌株及其应用
CN103695341B (zh) 一种由海洋细菌分泌的褐藻胶裂解酶及其制备方法
CN110093285B (zh) 一株耐酸发酵乳杆菌及其应用
CN103497911A (zh) 金黄杆菌及其羰基还原酶用于阿瑞匹坦手性中间体生产
Chen et al. Screening and characterization of ethanol-tolerant and thermotolerant acetic acid bacteria from Chinese vinegar Pei
CN101481713B (zh) 生物催化2-氰基吡嗪生产吡嗪酰胺的方法及其菌株
CN111808757B (zh) 一株产高蛋白酶活的米曲霉及其在豆酱发酵中的应用
CN106635920A (zh) 一种高产岩藻多糖酶的海洋交替假单胞菌及其应用
CN102242072A (zh) 利用风味定向技术筛选中国白酒酿造中的β-大马酮产生菌株及其应用
CN102363757A (zh) 一株2-酮基-d-葡萄糖酸高产菌株的筛选方法及该菌株的发酵方法
CN105695340A (zh) 一种米曲霉及其应用
CN102634563A (zh) 一种产乙偶姻菌株的筛选方法及用该菌株发酵法生产乙偶姻
CN104911169A (zh) 一种培制蛹虫草菌丝体和纤溶酶的方法
CN104450571A (zh) 一种高效降解蝇蛆蛋白的苏云金芽孢杆菌菌株
CN111518711B (zh) 一株肠杆菌株及其在联产微生物胞外多糖和2,3-丁二醇中的应用
CN105624067B (zh) 一株海洋细菌Pseudoalteromonas sp SC127及其制备的石莼硫酸鼠李聚糖酶
CN104774794A (zh) 一株产d-甘露糖异构酶的菌株及用其生产d-甘露糖的方法
CN108587923B (zh) 一种改善苹果酸发酵性能的方法
CN102154245B (zh) 一种海洋草酸青霉菌产壳聚糖酶的方法
CN104531573A (zh) 一种解淀粉芽孢杆菌及其应用
CN116004750B (zh) 桃色欧文氏菌产安吉菌素的方法
CN102994487B (zh) 酸性脲酶的生产方法
CN116286557B (zh) 一株产纤维素酶的耐盐贝莱斯芽孢杆菌及其培养方法
CN101974457A (zh) 一株短小芽孢杆菌及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20120229