CN111808757B - 一株产高蛋白酶活的米曲霉及其在豆酱发酵中的应用 - Google Patents

一株产高蛋白酶活的米曲霉及其在豆酱发酵中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株产高蛋白酶活的米曲霉及其在豆酱发酵中的应用，属于生物工程发酵技术领域。本发明的米曲霉，已于2020年5月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.19628。用本发明的米曲霉制备的成曲中总蛋白酶活力较对照组提高了75.8％。同时，采用所述米曲霉发酵的豆酱中氨基酸态氮和游离氨基酸含量显著高于对照组，在发酵相同的时间内比对照组中氨基酸含量提高了42.7％，鲜味氨基酸谷氨酸(Glu)和天冬氨酸(Asp)的含量较对照组提高了36.8％。这将加快豆酱发酵过程中大分子蛋白质的降解，进而明显缩短豆酱发酵周期，提高生产效率。

Description

一株产高蛋白酶活的米曲霉及其在豆酱发酵中的应用
技术领域
本发明涉及一株产高蛋白酶活的米曲霉及其在豆酱发酵中的应用，属于生物工程发酵技术领域。
背景技术
豆酱，是以黄豆、蚕豆和面粉为主要原料，经过一系列物理、化学及生物过程酿造得到的一种半流动或半固态调味品。豆酱营养丰富、易于消化吸收、风味独特，发展至今已经成为人们生化中不可缺少的佐餐佳品。传统发酵豆酱往往在开放环境中进行，微生物种类繁多，在促进发酵的过程中也存在一定安全隐患。近年来通过对豆酱中菌株的分析，筛选出了符合要求的纯种菌株进行发酵，既满足传统豆酱的优点，又能降低安全隐患保证功能性。米曲霉即是目前被广泛使用的菌株。
米曲霉(Aspergillus oryzae)在微生物分类学上属于真菌界、子囊菌门、散囊菌纲、散囊菌目、发菌科、曲霉菌属。米曲霉的基本组成是菌丝(包括气生菌丝和营养菌丝)和孢子，菌丝中有横隔膜。米曲霉的细胞是一种多核的细胞，整个菌丝体由多细胞、多核细胞构成，菌丝宽度一般为3-10μm。米曲霉的繁殖方式为孢子生殖，成熟的分生孢子为黄绿色，呈球形或近似球形状，孢子直径一般为4.5-7μm，个别大的可达8-10μm。据目前研究表明，米曲霉在产生孢子的同时，分泌的酶活力也将明显提高。由此说明米曲霉的产孢子速率也间接反映出该菌的产酶能力。
制曲是豆酱发酵的关键步骤，原料经过浸泡、蒸煮、冷却、接种米曲霉孢子、培养，最终制得成曲。米曲霉在利用碳源和氮源生长代谢的同时，分泌产生蛋白酶、淀粉酶等多种酶类，在后续发酵过程中通过酶的催化反应将原料中的大分子蛋白质和淀粉降解，转化为氨基酸、短肽、糊精、葡萄糖等小分子物质。由于米曲霉蕴含着丰富的酶系资源，因此米曲霉成为了目前豆酱发酵的核心菌种。
在目前工业化豆酱生产中，豆酱发酵速度以及最终豆酱的品质除了依赖于发酵工艺的不断优化外，采用的菌种对发酵周期以及产品品质也起到了决定性作用，而目前使用的米曲霉大多生长速度慢、蛋白酶活性低，发酵周期长，无法快速、高效降解原料中的淀粉、蛋白质等，影响了豆酱的工业化生产。因此，筛选一株高产蛋白酶、淀粉酶活力的米曲霉将极大提高原料中大分子物质的降解速率，进而缩短豆酱发酵周期，提升豆酱品质。
发明内容
为解决目前存在的问题，本发明提供一株高产蛋白酶活力的米曲霉菌种，加快豆酱发酵过程中蛋白至的分解，实现缩短发酵周期的目的。
本发明提供一种米曲霉(Aspergillus oryzae)BL18，已于2020年5月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19628。
本发明提供一种制备成曲的方法，将所述米曲霉BL18加入制曲原料中发酵。
在本发明的一种实施方式中，所述制曲原料含有大豆、面粉、蚕豆。
在本发明的一种实施方式中，将所述米曲霉BL18以不低于1.5×106cfu/g接种量接种至制曲原料中。
在本发明的一种实施方式中，制曲原料发酵55～65h制得成曲。
本发明提供一种微生物菌剂，所述菌剂中含有所述米曲霉BL18。
在本发明的一种实施方式中，所述菌剂的制备方法为：将米曲霉BL18菌株接种于PDA平板中，20～30℃下培养65～75h，待米曲霉BL18的孢子浓度达到107cfu/mL以上时加入缓冲液冲洗米曲霉孢子得到孢子悬液，在无菌环境下加入保护剂，得到菌剂。
在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液为生理盐水或pH值为5～8的0.1～1M磷酸盐缓冲液，所述保护剂为浓度为10～25％(w/v)的葡萄糖溶液。
本发明提供一种提高成曲中蛋白酶含量的方法，所述方法为在制曲原料中加入所述米曲霉BL18，或含有米曲霉BL18微生物菌剂。
本发明提供一种改善酱醅理化性质的方法，所述方法为在制曲原料中加入所述米曲霉BL18，或含有米曲霉BL18微生物菌剂。
在本发明的一种实施方式中，所述理化性质包括氯化钠、还原糖、氨基酸态氮、总酸。
本发明提供一种缩短豆酱发酵周期的方法，所述方法为在制曲原料中加入所述米曲霉BL18，或含有米曲霉BL18微生物菌剂。
本发明还保护所述米曲霉BL18，或含有米曲霉BL18微生物菌剂，或所述制备成曲的方法，或所述提高成曲中蛋白酶含量的方法，或提高成曲中氨基酸含量的方法，或缩短豆酱发酵周期的方法在制备发酵食品中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵食品包括豆酱、酱油、米酒、甜面酱。
有益效果：用米曲霉BL18制备的成曲中总蛋白酶活力较对照组提高了75.8％。同时，采用BL18发酵的豆酱中氨基酸态氮和游离氨基酸含量显著高于对照组，在发酵相同的时间内比对照组中氨基酸含量提高了42.7％，鲜味氨基酸谷氨酸(Glu)和天冬氨酸(Asp)的含量较对照组提高了36.8％。这将加快豆酱发酵过程中大分子蛋白质的降解，进而明显缩短豆酱发酵周期，提高生产效率。
生物材料保藏
本发明所提供的米曲霉BL18，分类命名为米曲霉Aspergillus oryzae，已于2020年5月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.19628，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
附图说明
图1是米曲霉BL18的生长曲线图，以菌体干重表示。
图2是米曲霉BL18在PDA平板上的菌落生长直径和生长速率图。
图3是采用米曲霉BL18和米曲霉3.042所制成曲的表观形态图。
具体实施方式
酱醅中氯化钠含量的测定：测定方法参照酱卫生标准的分析方法GB/T 5009.40-2003中食盐测定方法。
酱醅中还原糖含量的测定：测定方法采用3，5-二硝基水杨酸(DNS)法，具体方法为取酱醅5g，充分研磨后用蒸馏水定容至100mL，离心后取上清100μL，加入1.5mL蒸馏水，1.5ml DNS试剂，沸水浴反应5min，冷却后定容至10mL，于540nm波长下测定吸光值，根据标准曲线计算还原糖含量。
酱醅中氨基酸态氮含量的测定：测定方法参照酱卫生标准的分析方法GB/T5009.40-2003中甲醛值法。
酱醅中总酸含量的测定：测定方法参照酱卫生标准的分析方法GB/T 5009.40-2003中总酸测定方法。
实施例1：米曲霉的筛选
配制PDA培养基：土豆200g，去皮切成1cm左右小块，煮沸煮30min至土豆块变软，2层纱布过滤，补去离子水至1L，再加入葡萄糖20g，琼脂20g，115℃灭菌用于配制液体培养基。上述方法基础上以2g/100mL的量加入琼脂，配制成固体PDA培养基。
将10g传统发酵豆酱酱醅加入到90mL无菌生理盐水(0.9g/100mL氯化钠)中，于200rpm、30℃孵育1h，然后稀释涂布于PDA平板，30℃培养72h。用一次性接种环挑取黄绿色孢子反复进行平板划线分离，得到纯化的米曲霉单菌落。挑取单菌落上的孢子接种于PDA液体培养基中，30℃、湿度80％，静置培养72h。用接种环挑取培养基上层的菌丝体，用真菌DNA提取试剂盒提取米曲霉基因组，用ITS1和ITS4扩增ITS rDNA序列。引物序列分别为：ITS1：GGAAGTAAAAGTCGTAACAA；ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC。PCR产物由苏州金维智进行测序，将测序结果在NCBI网站上进行BLAST序列比对，与米曲霉相似性100％，确定为米曲霉，并命名为BL18。
实施例2：米曲霉BL18菌株生长曲线以及菌落生长直径、生长速率的测定
在PDA液体培养基中接种米曲霉BL18孢子悬液(接种量为2mL/100mL)，于30℃恒温培养，每间隔4h过滤菌体并烘至恒重，记录干重，如图2所示。培养前8h菌体生长缓慢，8h至24h为菌体生长的对数期，24h以后菌体生物量达到稳定期。在配制的PDA平板中央点接种米曲霉孢子悬液，孢子悬液浓度为2.25×107个/mL，接种量为1μL。在温度为30℃，湿度为80％的培养箱中培养5天，每隔24h测定米曲霉菌落直径(mm)，连续测定5天，并计算菌落生长速率(mm/h)，设置3个平行样本，结果如图3所示。米曲霉菌落直径在第5天达到最大(64.17mm±0.85mm)，米曲霉菌落的生长速率从第一天开始逐渐增加，第四天达到最高值(0.62mm/h)，从第四天开始，米曲霉菌落生长速率开始下降，第5天时米曲霉菌落生长速率为0.47mm/h。
实施例3：米曲霉在制曲中的应用及成曲中蛋白酶活的比较
蚕豆115℃高压蒸煮后冷却至室温，与小麦粉充分混合(4:1，w/w)，以2×106cfu/g的接种量分别接种米曲霉BL18与米曲霉3.042菌株。在温度为30℃，湿度为80％下培养60h后制得成曲。BL18菌株制得的成曲豆瓣颗粒分明，无粘连结块的现象，如图3(b)所示。而如图3(a)所示，3.042菌株在制曲过程中菌丝生长旺盛，成曲结块现象明显。
按照行业标准(SB/T 10317-1999)测定成曲酶活的方法，称取充分研细的成曲5g，加水至100mL，40℃水浴内间断搅拌1h，过滤即制得粗酶液。采用福林酚法分别测定由米曲霉BL18与米曲霉3.042所制得成曲的酸性(pH3.0)、中性(pH7.2)和碱性(pH10.0)蛋白酶活力。40℃下每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸，定义为1个蛋白酶活力单位，如表1所示。
在酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶以及总蛋白酶活力方面，米曲霉BL18菌株均高于米曲霉3.042菌株，其具有高效分泌蛋白酶的能力，成曲的总蛋白酶活力较3.042菌株提高了75.8％，这将加快豆酱发酵过程中大分子蛋白质的降解，进而明显缩短豆酱发酵周期，提高生产效率。
表1米曲霉3.042与米曲霉BL18制得成曲的蛋白酶活力比较
Figure BDA0002578678940000041
实施例4：米曲霉对豆酱发酵中理化指标和氨基酸含量的比较
将实施例3中制备得到的成曲与NaCl浓度为17g/100mL的盐水按1:1(w/w)的比例混合后加入发酵罐进行发酵，发酵温度为35℃，发酵35天。对采用米曲霉BL18和米曲霉3.042菌株发酵得到的酱醅理化指标进行测定，包括氯化钠、还原糖、氨基酸态氮、总酸，如表2所示。检测结果发现菌株BL18发酵的酱醅中氨基酸态氮含量和还原糖含量均高于对照组，总酸含量低于对照组，氯化钠含量与对照组无明显差别。理化指标符合酱醅发酵要求并且由于对照组，可适用于豆酱发酵。通过柱前衍生化高效液相色谱检测A.oryzae3.042与A.oryzae BL18发酵酱醅中游离氨基酸的含量，发现采用A.oryzae BL18发酵的酱醅中总氨基酸含量达到9.61g/100g，在发酵相同的时间内比对照组中氨基酸含量提高了42.7％，并且17种游离氨基酸的含量在A.oryzae BL18发酵的酱醅中均高于对照组，其中鲜味氨基酸例如谷氨酸(Glu)和天冬氨酸(Asp)的含量较对照组提高了36.8％，结果如表3所示。说明A.oryzae BL18在豆酱发酵中能分泌较高的蛋白酶活力，相同时间内对蛋白质的速降速率更快，显著提高酱醅中的氨基酸含量，这将有利于缩短豆酱发酵周期。同时，大量呈鲜味氨基酸的生成也对改善豆酱风味提供帮助。
表2应用A.oryzae 3.042与A.oryzae BL18发酵酱醅的理化指标测定
Figure BDA0002578678940000051
表3应用A.oryzae 3.042与A.oryzaeBL18发酵酱醅的氨基酸含量测定
Figure BDA0002578678940000052
实施例5：米曲霉的微生物菌剂的制备
将米曲霉BL18菌株接种于PDA平板中，30℃下培养72h，待米曲霉BL18的孢子浓度达到107cfu/mL以上时加入缓冲液(生理盐水或pH值为7的0.2M磷酸盐缓冲液)冲洗米曲霉孢子得到孢子悬液，在无菌环境下加入保护剂(15g/100mL的葡萄糖溶液)，得到菌剂。
实施例6：微生物菌剂在制备豆酱中的应用
具体实施方式参见实施例3，将实施例5制备得到的微生物菌剂加水稀释后加入发酵体系中，在温度为30℃，湿度为80％下培养60h后制得成曲，将实施例3中制备得到的成曲与NaCl浓度为17g/100mL的盐水按1:1(w/w)的比例混合后加入发酵罐进行发酵，发酵温度为35℃，发酵35天即得到豆酱。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种米曲霉（Aspergillus oryzae），已于2020年5月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19628。
2.一种制备成曲的方法，其特征在于，将权利要求1所述米曲霉加入制曲原料中发酵。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，将所述米曲霉以不低于1.0×106cfu/g接种量接种至制曲原料中。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，制曲原料发酵55~65 h制得成曲。
5.一种微生物菌剂，其特征在于，所述菌剂中含有权利要求1所述米曲霉。
6.一种提高成曲中蛋白酶含量的方法，其特征在于，在制曲原料中加入权利要求1所述米曲霉，或权利要求5所述微生物菌剂。
7.一种改善酱醅理化性质的方法，其特征在于，在制曲原料中加入权利要求1所述米曲霉，或权利要求5所述微生物菌剂。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述理化性质包括氯化钠、还原糖、氨基酸态氮和总酸的含量。
9.一种缩短豆酱发酵周期的方法，其特征在于，在制曲原料中加入权利要求1所述米曲霉，或权利要求5所述微生物菌剂。
10.权利要求1所述米曲霉，或权利要求5所述微生物菌剂，或权利要求2~4、6~9任一所述方法在制备豆酱中的应用。
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