CN108441428B - 一株降解醇溶蛋白的华根霉及其应用 - Google Patents

一株降解醇溶蛋白的华根霉及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株降解醇溶蛋白的华根霉及其应用，属于食品酿造及糟醅副产物再利用领域。本发明的一株降解醇溶蛋白的华根霉是从白酒发酵环境中分离得到，命名为华根霉Rhizopus chinensis，于2017年12月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.14998。本发明的菌株具有耐酸、高效醇溶蛋白特征，是优良的酿酒功能菌株，可应用于酿造酒、蒸馏酒及其它食品领域，提高原料利用率，改善发酵食品风味品质。

Description

一株降解醇溶蛋白的华根霉及其应用
技术领域
本发明涉及一株降解醇溶蛋白的华根霉及其应用，属于食品酿造及糟醅副产物再利用领域。
背景技术
高粱作为一种重要的粮食作物，广泛应用于发酵食品制造、制糖、饲料制备、建材造纸等工业领域。高粱的化学成分主要为淀粉、蛋白质、脂肪、纤维素等；除了含量最多的淀粉之外，蛋白质是高粱中含量最多的成分，约占6.8-19.6％。高粱蛋白质依据其溶解性可分为清蛋白、球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白质四大类；其中醇溶蛋白作为主要贮藏蛋白，富含多种人体必需氨基酸，约占高粱总蛋白质量的77-82％。高粱醇溶蛋白可分为α-醇溶蛋白、β-醇溶蛋白质和γ-醇溶蛋白，这些蛋白质的生化性状对高粱蛋白质的营养性状起着决定性的作用。与其他禾谷类谷粒相比，高粱表现为低蛋白消化率，一般认为是β-醇溶蛋白和γ-醇溶蛋白之间易形成二硫键在蛋白质体外层形成一层酶抗性层因而限制蛋白酶靠近，从而降低醇溶蛋白消化率，这些因素直接影响到高粱蛋白质的营养价值。因此，添加酶制剂或筛选高效降解醇溶蛋白的微生物，是改善发酵食品制造、饲料制备等工业中高粱营养价值很好的选择。
近年来，为提高高粱等谷物蛋白质营养价值，发酵食品、饲料制造业在生产加工过程中添加蛋白酶制剂降解醇溶蛋白，以提高谷物蛋白质、淀粉等营养成分的消化率；但蛋白酶制剂的活力易受生产过程环境因素变化的影响，导致醇溶蛋白的降解效率低下。因此，从发酵食品酿造环境中筛选出被驯化并能高效降解醇溶蛋白的微生物，再将其添加于发酵食品、饲料制造及副产物深加工生产过程中，是改善提高谷物原料营养价值的优良途径。
白酒作为我国传统发酵食品，每年产量巨大，2016年白酒产量已达到1358.4万千升；另一方面，酿酒制造业产生酒糟等大量副产物，仅酒糟每年产量可达2500万t。传统白酒固态发酵过程中，高粱等酿酒原料中大部分淀粉被利用，但是丢糟中残留较多的蛋白质(含有 10～16％粗蛋白)，这说明高粱蛋白质在白酒酿造过程中利用率较低，且营养成分浪费较为严重。如何提高酿造过程中高粱蛋白质利用率，同时利用丢糟中蛋白质营养成分开展蛋白质饲料制备等深加工，对提高谷物类发酵食品利用率，促进产业发展、提高产业效益有重要意义。酒糟是酿酒制造业的主要副产物，我国酒糟资源丰富，据报道，据统计，我国白酒酿造行业每年产生约的丢糟。酒糟蛋白质是一种良好的蛋白质来源。利用生物技术，开发生产蛋白饲料是行之有效解决蛋白饲料生产不足的行业现状。
Rhizopus chinensis作为一类重要的丝状真菌，广泛存在于白酒酿造体系中，该类微生物能够分泌产生丰富的淀粉、蛋白质、脂肪等大分子物质的水解酶系。因此，获取高效降解醇溶蛋白、谷蛋白等难溶性蛋白质并能适应白酒生产环境的Rhizopus chinensis，对于以霉菌作为主要功能微生物的白酒发酵生产显得尤为重要。
发明内容
为了解决上述问题，本发明筛选得到了一株高效降解醇溶蛋白的Rhizopuschinensis CGMCC NO.14998，是从酱香型白酒发酵环境中筛选的。该菌株是从中国白酒酿造过程中获得，具有高效降解醇溶蛋白的特性，是优良的酿酒功能菌株，能够有效应用于白酒酿造及酒糟深加工过程，高效降解发酵原料及酒糟中醇溶蛋白，从而提高原料营养成分的利用率，改善食品风味品质。
本发明的第一个目的是提供一株华根霉Rhizopus chinensis，于2017年12月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.14998。
在本发明的一种实施方式中，所述华根霉是从白酒发酵环境中分离筛选得到的。
在本发明的一种实施方式中，所述华根霉，具有高效降解醇溶蛋白的特性并能适应食品发酵环境。
在本发明的一种实施方式中，所述华根霉通过高粱籽粒为固态发酵培养基进行培养。
在本发明的一种实施方式中，所述华根霉的培养方式选用于温度30℃条件下静置培养。
在本发明的一种实施方式中，所述华根霉胞外分泌蛋白质，共检测出54个蛋白点，包括 20种蛋白质水解酶。
在本发明的一种实施方式中，所述蛋白质水解酶主要包括根霉蛋白酶、根霉蛋白酶前体、天冬氨酸蛋白酶、肽链内切酶、酸性蛋白酶、亮氨酸氨基肽酶、丝氨酸羧肽酶、天冬氨酸蛋白酶，其中羧肽酶具有较强醇溶蛋白降解能力。
本发明的第二个目的是提供所述华根霉的发酵方法，所述方法是将所述华根霉接种于高粱固态发酵培养基中，于28～32℃培养3～5d。
在本发明的一种实施方式中，所述高粱固态发酵培养基是取适量的高粱清洗后，以高粱：水＝1:1～2的比例混合，在60～80℃浸泡20～30h，取沥干后的高粱，按照高粱：水＝2～1:1混合配制而成。
本发明的第三个目的是提供一种高效降解醇溶蛋白的方法，所述方法是利用所述华根霉发酵所得的蛋白酶。
本发明的第四个目的是提供一种微生物菌剂，所述微生物菌剂含有Rhizopuschinensis CGMCC NO.14998菌体的活细胞、冷冻干燥得到的Rhizopus chinensis CGMCCNO.14998干菌体、固定化的Rhizopus chinensis CGMCC NO.14998细胞、Rhizopuschinensis CGMCC NO.14998 的液体菌剂、Rhizopus chinensis CGMCC NO.14998的固体菌剂，或者以其他任何形式存在的 Rhizopus chinensis CGMCC NO.14998菌株。
在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂应用于谷物类发酵食品生产原料中醇溶蛋白的降解。
在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂还应用于谷物类发酵食品残余糟醅中醇溶蛋白的降解及其再利用生产蛋白饲料。
本发明的第五个目的是提供所述华根霉或所述微生物菌剂在谷物类发酵食品技术领域的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述应用是将所述华根霉或所述微生物菌剂添加到谷物类发酵食品酿造过程中。
在本发明的一种实施方式中，所述应用是将所述华根霉或所述微生物菌剂添加糟醅深加工生产中。
在本发明的一种实施方式中，所述应用是将所述华根霉或所述微生物菌剂添加到白酒酒糟中，应用于蛋白饲料生产中。
本发明的有益效果：
本发明得到了一株高效降解醇溶蛋白的Rhizopus chinensis CGMCC NO.14998菌株，利用该华根霉在白酒酿造过程中高效降解醇溶蛋白。本发明的菌株，可在高粱籽粒固态培养基上生产，其蛋白酶种类和表达量优于其他华根霉菌株，具有较高降解、利用醇溶蛋白的能力，可在酒糟生物再利用领域用于蛋白饲料加工等生产。
生物材料保藏
华根霉，分类学命名为华根霉Rhizopus chinensis，于2017年12月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.14998。
附图说明
图1：高粱固态发酵中华根霉的胞外蛋白的二维电泳图谱。
具体实施方式
蛋白组学分析参照以下两篇文章：
1、郑礼月，王栋，徐岩.华根霉蛋白质组双向电泳体系的建立及优化.食品与生物技术学报.2015；34(5):487-93.
2、蔡君，王栋，徐岩.华根霉固态与液态培养产胞外蛋白的比较蛋白质组学分析.微生物学通报.2017；44(2):402-10.
实施例1：高效降解醇溶蛋白的华根霉Rhizopus chinensis筛选及鉴定
取10g酱香型大曲溶于90ml无菌生理盐水中，30℃条件下摇床振荡培养30分钟后进行梯度稀释，涂布马铃薯葡萄糖琼脂培养基，于30℃恒温条件下培养3-5天，根据平板上菌落形态特征，收集Rhizopus chinensis孢子进行高粱固态培养基发酵，对获得的潜在的高产蛋白水解酶Rhizopus chinensis根霉提取基因组DNA进行分子生物学鉴定，利用霉菌特异分类鉴定引物扩增霉菌的26S rDNA的片段，凝胶电泳检测，将PCR扩增产物送至上海生工生物技术有限公司进行序列测定后在NCBI中经Blast比较分析确定为华根霉菌，确定所筛选得高产蛋白酶的根霉在分类学上都属于Rhizopus chinensis根霉，最终所得到一株高产蛋白酶的华根霉，命名为华根霉Rhizopus chinensis。将华根霉Rhizopus chinensis保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.14998。
马铃薯葡萄糖琼脂培养基(g·L-1)：马铃薯粉6.00，葡萄糖20.00，琼脂20.00，加1000 mL蒸馏水。
实施例2：菌株代谢产蛋白水解酶的功能
高粱固态发酵培养基：取适量的高粱清洗后，以高粱：水＝3：4的比例混合，放75℃烘箱浸泡24h，沥干后，称取50g的高粱于500mL三角瓶，加入25mL水，121℃条件下灭菌20min。
发酵培养：高粱固态发酵培养基灭菌后接种华根霉的孢子悬浮液，每克高粱接种量为 1×108个，于30℃培养4d，间隔12h摇晃震荡一次。
蛋白样品的制备及浓缩：将发酵成熟的三角瓶取出，每瓶装入100mL pH 5.0的乙酸盐缓冲溶液，添加蛋白酶抑制剂，摇匀后放4℃浸提12h；浸提液4层纱布过滤，12000rpm离心2次，每次30min，再过0.45μm滤膜得蛋白粗提液。将所得的蛋白酶粗提液装入14kD 的透析袋中，将其埋入聚乙二醇中，4℃浓缩过夜；再将浓缩液采用10倍体积的10％TCA- 丙酮溶液沉淀过夜，再用纯丙酮清洗3次，12000rpm离心30min，沉淀放-20℃冻干呈粉，即得蛋白样品。
霉菌胞外蛋白酶测定：采用双向电泳技术对提取的霉菌胞外蛋白样品进行分离鉴定。
以高粱籽粒为固态发酵培养基，高粱蛋白质作唯一氮源，接种由酱香型白酒发酵体系中筛选的Rhizopus chinensis CGMCC NO.14998，采用蛋白组学二维双向电泳的分析手段分析比较了高粱蛋白质诱导霉菌胞外分泌蛋白组差异，共鉴定出54个蛋白点，其中20个蛋白点为蛋白水解酶类，如图1、表1所示；鉴定的蛋白种类丰富、功能多样，主要包括根霉蛋白酶、根霉蛋白酶前体、天冬氨酸蛋白酶、肽链内切酶等。根霉蛋白酶、根霉蛋白酶前体、肽链内切酶均是高粱蛋白诱导华根霉产生的蛋白水解酶，可用于蛋白质的降解，为根霉提供生长必须的氮源。天冬氨酸蛋白酶也是霉菌分泌的一类非常重要的水解酶，活性中心含有两个催化性天冬氨酸残基，主要分为胃蛋白酶亚型、逆转录蛋白酶亚型、天冬氨酸膜内裂解蛋白酶亚型，尤其是胃蛋白酶亚型在强酸的环境下仍具有较高的生理活性。与其他华根霉相比， Rhizopus chinensis CGMCC NO.14998具有较强产生蛋白酶活力。
表1 Rhizopus chinensis CGMCC NO.14998接种于高粱固体培养基分泌的蛋白酶
Figure RE-GDA0001680465460000051
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (9)

1.一株华根霉，其特征在于，分类学命名为华根霉(Rhizopus chinensis)，于2017年12月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.14998。
2.一种微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂含有CGMCC NO.14998菌体的活细胞、冷冻干燥得到的CGMCC NO.14998干菌体、固定化的CGMCC NO.14998细胞、CGMCC NO.14998的液体菌剂、CGMCC NO.14998的固体菌剂，或者以其他任何形式存在的CGMCC NO.14998菌株。
3.权利要求1所述的华根霉或者权利要求2所述的微生物菌剂在谷物类发酵食品技术领域的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用是将所述华根霉或所述微生物菌剂添加到谷物类发酵食品酿造过程中。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用是将所述华根霉或所述微生物菌剂添加到糟醅深加工过程中。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述微生物菌剂应用于谷物类发酵食品生产原料中醇溶蛋白的降解。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述微生物菌剂应用于谷物类发酵食品残余糟醅中醇溶蛋白的降解。
8.一种权利要求1所述华根霉的发酵方法，其特征在于，所述方法是将所述华根霉接种于高粱固态发酵培养基中，于28～32℃培养3～5d；所述高粱固态发酵培养基按如下方法制备：取适量的高粱清洗后，以高粱：水＝3：4的比例混合，放75℃烘箱浸泡24h，沥干后，称取50g的高粱于500mL三角瓶，加入25mL水，121℃条件下灭菌20min。
9.一种高效降解醇溶蛋白的方法，其特征在于，所述方法是利用权利要求1所述的华根霉降解醇溶蛋白。
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