CN103805520B - 一株高酸性蛋白酶华根霉及培养方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株高酸性蛋白酶华根霉及培养方法和应用，属于微生物技术领域。本发明获得一株高酸性蛋白酶华根霉（Rhizopus chinensis），命名为华，于2013年12月16日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.8589。本发明也提供了上述高酸性蛋白酶华根霉的培养方法，及所述高酸性蛋白酶华根霉用于制备麸曲在酿酒中的应用。

Description

一株高酸性蛋白酶华根霉及培养方法和应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株高酸性蛋白酶华根霉及培养方法和应用。

背景技术

酸性蛋白酶有改善白酒风味的作用，该酶可应用于不同工艺、不同香型白酒生产。通过对基础酒各种理化数据进行综合分析及基础酒的感官鉴定，认为酸性蛋白酶适合在酿酒的环境中发挥作用，有改善白酒质量的效果，并能提高原料出酒率。

酸性蛋白酶能在酸性环境中水解蛋白质，广泛用于制革工业，医药业，酿造业和饲料工业，酸性蛋白酶作为一种新型的饲料添加剂，可以明显促进幼龄动物的生长发育，降低断奶带来的应激效应，饲用效果非常显著，是一类应用前景非常广阔的酶制剂。

发明内容

为克服上述现有技术的缺点和不足，本发明的首要方法在于提供一株高酸性蛋白酶华根霉。

本发明的另一目的在于提供上述高酸性蛋白酶华根霉的培养方法。

本发明的再一目的在于提供上述高酸性蛋白酶华根霉的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一株高酸性蛋白酶华根霉（Rhizopuschinensis），命名为华，于2013年12月16日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.8589。

所述的高酸性蛋白酶华根霉从酒曲中分离纯化获得；

所述的高酸性蛋白酶华根霉为绒毛状，或稠密或疏松，初期呈白色，老化后呈灰黑色；最适生长温度为30℃，最适生长pH为6.5～7.5。

上述高酸性蛋白酶华根霉的培养方法，具体步骤为：

将高酸性蛋白酶华根霉接种于发酵培养基中，培养条件为28～35℃，pH值为6.5～7.5，培养100～140小时。

所述发酵培养基的组成：40～80g大米和8～16g黄豆粉，58ml水，混合煮熟；

所述发酵培养基的组成具体优选为50g大米和10g黄豆粉，58ml水，混合煮熟；

所述的pH值优选为用0.1mol/L的氢氧化钠和0.1mol/L的柠檬酸进行调节；

所述培养条件，优选为30℃，pH6.8，培养120小时。

为了使发酵的效果较好，所述高酸性蛋白酶华根霉在接种之前，将斜面菌种活化，培养成液体菌种，液体菌种经过二级种子培养后，接种到发酵培养基中进行发酵培养。

所述的斜面菌种是将高酸性蛋白酶华根霉接种于总糖含量为2～20g/L的土豆固体斜面上，在25～35℃条件下培养30～72小时后，放入4℃冰箱保存。

所述的斜面菌种活化为将菌种点殖于总糖含量为2～20g/L的土豆平板，28～32℃平板倒置培养38～42小时；

所述的液体菌种是将保存的高酸性蛋白酶华根霉菌种活化后，接种一环菌丝体于装有100毫升总糖含量为10～50g/L的米曲汁液体培养基的三角瓶中，于25～35℃条件下搅拌培养16～22小时，即为液体菌种；

所述的米曲汁液体培养基的成分为：500g大米，加水600ml,蒸煮至熟透，摊凉至室温，加入糖化酶，米饭在糖化酶的作用下，产生的汁液，即为米曲汁，糖度调制20波美度；添加2%琼脂，混合煮沸。

所述的二级液体种子培养是指：一级液体种子培养，是将液体菌种按体积百分数2～5%的接种量（即培养基体积的2～5%），接入装有200毫升，总糖含量为10～50g/L的米曲汁的三角瓶中，于25～35℃条件下搅拌培养16～22小时，即为一级液体种子培养物；所述二级液体种子培养，是将一级种子培养液按体积分数2～5%的接种量（即培养基体积的2～5%），接入装有100升，总糖含量为10～50g/L的米曲汁的种子培养罐，在25～35℃条件下搅拌培养16～22小时，即为二级液体种子培养物。

本发明使用的发酵培养液是普通的米曲汁，只需要调节其还原糖总含量，即可进行正常生产，方法简单，生产投资较少。

上述高酸性蛋白酶华根霉用于制备麸曲在酿酒中的应用。

一种高酸性蛋白酶华根霉制作麸曲的方法，具体步骤如下：

麸皮蒸煮30分钟，培养水分为40%，冷却后拌曲，接种质量分数为0.4%的高酸性蛋白酶华根霉，30±1℃培养2天，入箱至培养18小时培养湿度为90～92%，然后湿度调整为85～87%，接着提高箱温为36±1℃干燥24小时，再提温至38±1℃干燥24小时，获得高酸性蛋白酶华根霉制作麸曲；培养期间温高于35℃时，每小时翻曲一次。

本发明相比于现有技术的有点和效果为：

本发明的高酸性蛋白酶华根霉产生的酸性蛋白酶，一方面应用于半固态发酵工艺的白酒生产，既提高了白酒发酵的出酒率，又提高了斋酒中乙酸乙酯、总酯、乙酸、β-苯乙醇等的含量，使斋酒的酒体更丰满，风味更好；另一方面，应用于豉香型白酒的生产，通过在豉香型的曲种——大酒饼的培养过程中加入以该根霉制作的功能麸曲，使大酒饼的糖化力、发酵力、酸度、蛋白酶、酯化力得到有效的提高，该酒饼应用于豉香型白酒的发酵中使斋酒的总酯、总酸也得到明显的提高，从而使斋酒风味质量更好。

本发明的方法实用性强，操作简便，易于推广。投资少、见效快、效益高，具有很强的市场竞争力。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

请提供本发明中高酸性蛋白酶华根霉的来自广东省九江酒厂有限公司的酒曲；分离的步骤方法为：样品经稀释（称取1g（±0.0005g）酒曲，置于100ml已灭菌的蒸馏水中，充分混和，即得10^-2稀释液，用1ml刻度吸管及9ml蒸馏水试管制成10^-4、10^-5、10^-6稀释度），每个稀释度取1ml于灭菌平皿中，浇灌土豆培养基（土豆培养基的成分为20g去皮土豆，加水煮沸30分钟，用纱布过滤，得到土豆液，定容至100ml，加入2g葡萄糖，2g琼脂，混匀，煮沸），28—32℃平板倒置培养38—42小时，平板画线获得。

获得高酸性蛋白酶华根霉（Rhizopuschinensis），命名为华，于2013年12月16日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.8589。

实施例1高酸性蛋白酶华根霉的培养方法

利用高酸性蛋白酶华根霉发酵生产酸性蛋白酶，步骤如下：

1）斜面菌种：将菌种接种于含有总糖含量为6g/L的土豆固体斜面上，在28℃条件下培养48小时后，放入4℃冰箱保存；

2）液体菌种：将保存的高酸性蛋白酶活霉菌斜面菌种活化后，接一环细胞于装有100毫升，总糖含量为12g/L的麦芽汁液体培养基的三角瓶中，于30℃条件下搅拌培养20小时，即为液体菌种；

3）一级液体种子培养：将液体菌种按体积分数5%的接种量接入装有200毫升，总糖含量为12g/L的大米淀粉糖化液三角瓶中，于30℃条件下搅拌培养18小时，得到一级液体种子培养物；

4）二级液体种子培养：将一级种子培养液按体积分数5%的接种量接入装有300升，总糖含量为12g/L的大米淀粉糖化液种子罐，在30℃条件下搅拌培养18小时，得到二级液体种子培养物；

5）发酵培养基的制备：发酵培养基是总还原糖浓度为100g/L的大米淀粉糖化液，培养基的pH为5.5；

6）发酵罐发酵：将二级种子培养液按体积分数5%的接种量接入装有1000升步骤5）中配制的总还原糖浓度为100g/L的大米淀粉糖化液培养基中，在30℃条件下搅拌培养80小时；获得含酸性蛋白酶的发酵液。

用福林法测定样品中蛋白酶活，测定结果如表1。

表1样品中蛋白酶活数据比对

样品名称	蛋白酶活（μ/g）
		空白样品	137.86
本发明样品	493.45

空白样品发酵是没有添加本发明样品（高酸性蛋白酶华根霉）的发酵样品，添加本发明样品进行发酵的样品，蛋白酶活明显高于没有添加本发明样品的发酵样品。

所述的福林法测定蛋白酶活的方法：

分光光度计：722型分光光度计

测光密度波长：680nm

检测样品使用试剂：福林试剂、0.4mol/L碳酸钠溶液、0.4mol/L三氯醋酸溶液、质量分数2%酪蛋白溶液、标准L-酪氨酸溶液、乳酸-乳酸钠缓冲液（pH3.0）。

绘制标准曲线：

5%酶浸出液：5g样品（发酵罐发酵获得的发酵液），用乳酸-乳酸钠缓冲液定容至100ml，在40℃水浴中浸出30min。

试样测定：1ml5%酶浸出液注入离心管，40℃水浴预热5min，加质量分数2%酪蛋白溶液1ml，保温10min，加入2ml0.4mol/L三氯醋酸溶液，中止反应。15min分钟后离心分离。1ml上清液注入试管，加入5ml0.4mol/L碳酸钠溶液和1ml福林试剂，摇匀，在40℃水浴加热20min显色。

空白试验：与试样测定同时进行（直接加入2ml0.4mol/L三氯醋酸溶液，样品没有进行反应，2ml0.4mol/L三氯醋酸溶液有中止反应的作用），离心管中先后注入质量分数5%酶浸出液1ml，0.4mol/L三氯醋酸2ml，质量分数2%酪蛋白溶液1ml。15min分钟后离心分离，以下的操作均与试样测定相同。

比色测定光密度：以空白试液为对照，在680nm波长下测试样的光密度。

实施例2高酸性蛋白酶华根霉制作麸曲的方法：

麸皮蒸煮30分钟，培养水分为40%，冷却后拌曲，接种质量分数为0.4%的高酸性蛋白酶华根霉，30±1℃培养2天，入箱至培养18小时培养湿度为90～92%，培养第二阶段，湿度降低为85～87%，接着提高箱温为36±1℃干燥24小时，再提温至38±1℃干燥24小时，获得高酸性蛋白酶华根霉制作麸曲；培养期间温高于35℃时，每小时翻曲一次。

实施例3

实施例2制备的高酸性蛋白酶华根霉麸曲在粤宴基酒生产中的应用。

（1）试验方案所用物质见表2.

表2样品中所加物质成分

样品编号	糯米	饼种	菌种
				1	150公斤	5‰饼丸、3%酒饼	无（空白对照）
2	150公斤	5‰饼丸	1%高酸性蛋白酶华根霉麸曲

所述的1%高酸性蛋白酶华根霉麸曲是将实施例2获得的高酸性蛋白酶华根霉麸曲按照与糯米质量比1:100的比例应用，即高酸性蛋白酶华根霉麸曲的用量为1.5公斤。

表2中的酒饼的原料、制作、成曲：

1）原料配比：大米100公斤，大豆20公斤，饼泥20公斤，饼叶10公斤，曲母2公斤。

2）蒸料、制坯、培曲：大米加水量为80%--85%，用蒸汽蒸煮至米饭熟度为75%--80%即可；大豆采用常压蒸煮16—20小时，务必熟透。将米饭冷却至36℃左右，加入经冷却的熟大豆后，再加入饼泥、饼叶、曲母混合拌匀。然后，装料入压曲机，由螺旋推进挤压成坯。曲坯呈方块状，规格为30cm×20cm×3cm，质量约0.5公斤。曲坯挂入曲房，保温保湿培养一周。

3）成曲：培养一周后开蒸汽干燥一天，出房，放入饼仓贮存。

试验酒饼的来源及取样：

1）从饼仓随机抽取5吨酒饼，作试验备用饼，在饼仓中作标识，贮存备用。

2）从这5吨酒饼中随机抽取40块酒饼，分别取饼边、饼心，混匀，粉碎后用四分法抽取约0.5公斤，作分离菌种用。

表2中的饼丸的原料、制作、成曲：

1）原料配比：米粉100公斤，饼叶4公斤，曲母3公斤。

2）制坯、培曲：米粉、饼叶、曲母在搅拌机混匀，加入70公斤水，搅拌成粉团，用切粒机切成直径为2cm的小丸，小丸放上疏竹筛，疏竹筛上下加盖密竹筛，送入饼房，保温保湿培养6天。

3）成曲：培养5天后开蒸汽干燥一天，出房，放入饼丸仓贮存。

试验饼丸的来源及取样：

1）从饼丸仓随机抽取100公斤饼丸，作试验备用饼，在饼丸仓中作标识，贮存备用。

2）从这100公斤饼丸中随机抽取2公斤饼丸，分别取饼边、饼心，混匀，粉碎后用四分法抽取约0.5公斤，作分离菌种用。

（2）糖化、入缸方案：投料糖化，糖化前添加质量分数2%的熟麸皮，每样一张小饭床，糖化1天。入缸发酵方案：每样分为2缸发酵，每缸添加20g活性干酵母，米与水的质量比为1：1.6，入缸发酵（28～32℃静置发酵），发酵20天；空白对照不加活性干酵母，其余与试验样品同。采用小甑作蒸馏，每样的两缸发酵样品混合蒸一甑。当天完成样品的蒸馏。

（3）斋酒（蒸馏的新酒)的主要检测数据见表3：

表3斋酒的主要检测数据

样品名称	酒度%vol	总酸（g/L）	杂醇油（g/L）	总酯（g/L）
					空白对照	51.2	0.67	1.45	1.96
华根霉	51.0	1.44	1.23	4.96

实施例4高酸性蛋白酶华根霉麸曲在豉香型酒曲的应用（麸曲培养方法见实施例2）

（1）试验方案：2种酒饼的配置方案如表4中组分。

表42种酒饼的配置方案组分

酒饼制作和培养工艺：

1）按照上述原料配方把大米、黄豆煮熟后，混入配方中的辅料后，搅拌均匀压制成饼；

2）酒饼进房后做好培养房的保温、保湿工作，揭边席前控制房间温度在30-36℃，房间温度干湿球差0-1.5℃（相对湿度90%以上）记录酒饼最后进房时间、当时房间干湿球温度品温。

3）酒饼培养发酵前期，要经常检查培养情况，每隔2小时左右记录一次

4）酒饼培养8-12小时，品温升至32-36℃时，有潮气上升即可揭顶席；揭顶席后继续保温保湿，房温控制在33-36℃，品温控制在35-42℃，等长满菌丝，颜色转白才可揭边席，记录品温、房温。

5）揭席后，排放热气、潮气，使饼身散去一部分热量及水份，控制房温在30-35℃范围内。

6）当酒饼发酵到旺盛期，品温上升到40℃～42℃时，要适当打开门窗降低房温，房温控制在34-36℃。

7）培养到第6天至第8天，房温保持在40℃以下，使酒饼发透心，排清饼心水份。

8）酒饼经过8天的培养发酵，即可完成培养过程，进行落饼进仓。

（2）成品酒饼主要检测数据：

步骤（1）中两种成品酒饼的主要检测数据见表5。

表5两种成品酒饼的主要检测数据

表5中脂肪酶活力的检测方法如下：（参考《白酒生产技术全书》沈怡方主编，P619—622页）

（1）5%酶浸出液的制备

用电子天平分别称取酒曲10g，加pH7.5缓冲液，使体积为200mL，在40度水浴浸泡30分钟，并不时搅拌，浸泡后用定性试纸过滤。

（2）试剂与溶液

①聚乙烯醇底物溶液制备：聚乙烯醇40g，加水800mL，在沸水裕中加热，不停搅拌至全部溶解，冷却后过滤。吸150mL滤液，加橄榄油50mL，用高速组织捣碎机处理2次，每次3分钟，中间间隔5分钟，即为乳化液。

②橄榄油

③体积分数为95%的乙醇

④0.025mol/L磷酸缓冲液（pH7.5）

⑤0.05mol/L氢氧化钠溶液

⑥10g/L酚酞指示剂

（3）测定方法

①试样测定：取两个100mL三角瓶，各加底物乳化液4mL和磷酸缓冲液5mL，在空白瓶A（瓶A）中先加入95%的乙醇15mL,。将两瓶在40度水浴中预热5分钟。各加1mL试样滤液，立刻混匀，计时，在40度水浴中准确反应15分钟。在试样瓶（瓶B）中补加95%的乙醇15mL以中止反应。取出三角瓶，冷至室温。

②酸碱滴定：于A、B两瓶分别加入酚酞指示剂2滴，用0.05mol/L氢氧化钠滴定至微红色，10秒不褪色为终点。记录消耗氢氧化钠的体积。

（4）计算:

$\frac{(V-V1)\×\frac{C}{0.05}\×50}{M\×\frac{10\×15}{200}}$

V—样品瓶滴定消耗的氢氧化钠的体积（mL）；

V1—空白瓶滴定消耗的氢氧化钠的体积（mL）；

C—氢氧化钠标准溶液的浓度（mol/L）；

0.05—换算到0.05mol/L标准浓度的系数；

50—每1mL0.05mol/L氢氧化钠相当脂肪酸50x10-6mol；

200是指稀释倍数；

M—试样质量。

表5中蛋白酶活力检测方法见实施例1。

表5中糖化力检测方法如下：

（1）检测试剂：

a：5g/L次甲基蓝指示剂，5g/L次甲基蓝指示剂，称取0.5g次甲基蓝溶于100mL蒸馏水中；

b：斐林氏甲、乙液，其配制和标定；

①斐林氏甲液的配制：

称取结晶纯硫酸铜(CuSO₄·5H₂O)138.56g,加水溶解成2000ml。

②斐林氏乙液的配制：

称取四水合酒石酸钾钠(C₄H₄O₆KNa·4H₂O)692g及氢氧化钠200g，分别在两个烧杯中溶解后，混和加水定容至2000ml。放置两日后，如液面降低，须加水至刻度，摇匀。

③标准葡萄糖液的制备：

称取已经在105℃温度下干燥3小时(已冷却)的葡萄糖1g，准至0.0002g加水溶解后稀释至500ml。

④斐林氏甲、乙液的标定：

预备试验：取斐林氏甲液、乙液各2.5ml于三角瓶中，加水25～30ml，加热煮沸，逐渐滴入标准葡萄糖液。滴定时，保持试液沸腾，待蓝色即将消失时，滴入1～2滴次甲基蓝指示剂，使复呈蓝色，此时继续滴入糖液，直至蓝色消失为止，以上滴定手续应在4min内结束。

正式试验：取斐林氏甲液、乙液各2.5ml于三角瓶中，加入水25～30ml，然后加入少于预备试验1ml左右的标准葡萄糖液，加热煮沸2min，加入次甲基蓝指示剂1～2滴,再以糖液滴定至蓝色完全消失为止。本试验由沸腾时计算起，3min结束。同样试验两份，两个平衡样误差不得超过0.05mL。

⑤计算:F=G×V/500

式中:F──斐林氏液各2.5ml相当葡萄糖

G──秤取标准葡萄糖的重量，克；

V──滴定消耗糖液毫升数。

⑥注意事项：

斐林氏液配制一星期后才可过滤标定，由于斐林氏液的含铜量是定量还原糖的关键。在配制时硫酸铜的量要称准，并且以后每三个月标定一次，否则相当糖量会改变。如果用甲、乙液各2.5mL滴定时所消耗的葡萄糖量为12.5mL，则斐林氏液校正系数为1，相当于1个当量(即每毫升斐林氏液相当葡萄糖量为0.005克)，若超出或未达到1个当量，需按公式：K=V/12.5计算其浓度。为了方便测定后计算结果，一般把斐林氏液配制到1个当量。当试剂浓度不足1个当量时，需加入硫酸铜的量按69.28:12.5=X：V计算；当试剂浓度超过1个当量时，需加入蒸馏水量按1000:12.5=X:V计算。

c：2.0mol/LpH=4.6醋酸─醋酸钠缓冲液，称取272.0g三水合醋酸钠（NaCOOH·3H₂O），用水溶解后加入114.28mL冰乙酸，然后定容至1000mL。

d：0.20g/mL氢氧化钠；称取200gNaOH溶于1000mL蒸馏水中。

e：0.02g/mL可溶性淀粉溶液；称取4.0g可溶性淀粉，加少量水调成糊状，在不断搅拌下注入100mL水中，煮沸2min，冷却，加水定容至200mL。

f：0.01g/mL酚酞指示剂，称取1.0g酚酞溶于100mL无水乙醇中。

（2）样品预处理：

a:样品制备:每只饼丸取四分之一，再用小型粉碎机粉碎。

b：酶液制备：称取已粉碎的饼丸样5.0g于三角瓶中，加入28～32℃温水90mL、醋酸─醋酸钠缓冲液10mL，摇匀；在28～32℃下浸3小时，泡浸过程每隔30分钟摇拌一次，泡浸三小时后，用滤纸过滤，滤液作待测酶液。

c：分别量取0.02g/ml可溶性淀粉溶液50mL于100mL、200mL的容量瓶中，加入酶液各20mL。

d:100ml的容量瓶加入酶液后为空白试验，加入酚酞指示剂1～2滴，用0.20g/mL氢氧化钠中和到溶液微红色，然后用蒸馏水定容至刻度。

e:200mL的定量瓶加入酶液后加温至60℃±1℃糖化一小时。糖化一小时后，取出迅速加入酚酞指示剂1～2滴，用0.20g/mL氢氧化钠中和至微红色(目的是终止继续糖化，因为糖化酶在pH=5左右时活力最高)，冷却后加水定容至刻度。

（3）样品滴定：

取斐林氏甲液、乙液各2.5mL于三角瓶中，加入水25～30mL，然后加入上述d中100ml容量瓶中的液体20～35mL或上述e200ml容量瓶中的液体7～14mL糖液，加热煮沸，加入次甲基蓝指示剂1～2滴,再以糖液滴定至蓝色完全消失为止。记录消耗糖液的毫升数。

（4）计算：

a：糖化力(空白)%=[5mL斐林氏液相当葡萄量×200(空白100)]/100

×滴定时消耗糖液量(ml)

b：当斐林氏液的校正系数为1时，计算公式为：

式中：V—糖液消耗体积数，ml

c：糖化力%=样品糖化力%-空白糖化力%。

所得结果保留两位小数。

表5中的发酵力检测方法如下：

1）称取大米50g于500mL三角瓶中，加自来水55～65mL蒸煮50～60min，取出用竹棒拌散后冷却至30℃～35℃；

2）加入粉碎饼丸1g拌匀，用胶纸封好瓶口；于32±2℃恒温箱糖化24小时后加自来水65mL，放回恒温箱发酵4天。

3）糖化发酵5天后，取出发酵液全部倒入1000mL三角瓶中，用200ml自来水清洗剩余酵液入三角瓶内，装上蒸馏装置进行蒸馏。

4）测定酒精度：

a：取馏液100mL于100mL量筒中，静止数分钟，待酒中气泡消失后，放入洗净、拭干的酒精计，轻按一下；静止后，水平目测酒精计与弯月面相切处的刻度示值；

b：然后放进温度计于量筒中，读取温度；

c：根据测定的温度和酒精计示值，查《酒精计温度浓度换算表》,换算成20℃的酒精度，%。

5）计算或从“表6发酵力表”查得。

式中：4.06──纯酒精折30度酒的折算率；

50──大量；

0.7──大米淀粉含量以70%计算；

2.31──1克淀粉产30度酒理论系数。

所得结果保留两位小数。

表6：发酵力表

（计算公式：发酵力=5.021×酒精重量%）

表5中总酸检测方法如下：

1）吸取蒸馏酒液10.0mL于100mL三角瓶中，加入酚酞指示剂1～2滴;

2）用0.1mol/L氢氧化钠溶液滴定至微红色，在30秒内不褪色。记录滴定耗去的0.1mol/L氢氧化钠亳升数。

3）计算：总酸(g/L)=0.6×V

式中：0.6──0.1mol/L氢氧化钠溶液的计算系数；

V──滴定耗去的0.1mol/L氢氧化钠亳升数。

所得结果保留两位小数。

（3）成品斋酒主要检测数据如表7：

表7成品斋酒主要检测数据

名称	乙酸乙酯g/L	总酯g/L	乙酸g/L	总酸g/L	杂醇油g/L
						日常斋酒	152.77	0.62	209.37	0.28	1.64
试验斋酒	312.04	1.56	462.51	0.31	1.37

表7中的“日常斋酒”是指表5中以日常酒饼（酒饼1）采用豉香香型白酒发酵工艺（以大米为原料，蒸煮后加入约20%酒饼，以1：2～2.5的水比，发酵15～18天后蒸馏）发酵蒸馏而成的30vol新酒；而“试验斋酒”是指表5中以试验酒饼（酒饼2）采用豉香香型白酒发酵工艺（以大米为原料，蒸煮后加入约20%酒饼，以1：2～2.5的水比，发酵15～18天后蒸馏）发酵蒸馏而成的30vol新酒。

从表7中可看到，采用试验酒饼投料发酵而成的试验斋酒中，乙酸乙酯、总酯、乙酸和总酸均比以日常酒饼投料而成的日常斋酒要高得多，而且，试验斋酒杂醇油相对较低（对人体不利成分）。

酒饼中（测定酒饼中的杂醇油、总酯等含量，实际意义是指预测以该酒饼以豉香型白酒发酵工艺发酵后的30vol新酒中的含量，测定方法见如下）杂醇油、总酯、乙酸乙酯、乙酸测定方法：

1）称取大米50g于500mL三角瓶中，加自来水55～65mL蒸煮50～60min，取出用竹棒拌散后冷却至30℃～35℃；

2）加入6.6.3.1a酒饼1g拌匀，用胶纸封好瓶口；于32±2℃恒温箱糖化24小时后加自来水65mL，放回恒温箱发酵4天。

3）糖化发酵5天后，取出发酵液全部倒入1000mL三角瓶中，用200ml自来水清洗剩余酵液入三角瓶内，装上蒸馏装置进行蒸馏。

4）取上述蒸馏液摇匀，色谱进样测定杂醇油、总酯、乙酸乙酯、乙酸、乳酸乙酯等。

式中：600——杂醇油按600酒度折算

所得结果保留两位小数。

总酯g/L=（乳酸乙酯×0.745+乙酸乙酯）×K

式中：0.745——乳酸乙酯折算为乙酸乙酯即乙酸乙酯分子量/乳酸乙酯分子量

K——总酯（化学法、色谱法测定）校正系数

所得结果保留两位小数。

6）杂醇油、总酯、乙酸乙酯、乙酸的气相色谱测定方法(参考GB/T10345《白酒分析方法》）。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一株高酸性蛋白酶华根霉，其特征在于该高酸性蛋白酶华根霉命名为华，于2013年12月16日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.8589。

2.根据权利要求1所述的高酸性蛋白酶华根霉，其特征在于：所述的高酸性蛋白酶华根霉为绒毛状，稠密或疏松，初期呈白色，老化后呈灰黑色；生长温度为30℃，生长pH为6.5～7.5。

3.权利要求1或2所述的高酸性蛋白酶华根霉的培养方法，其特征在于具体步骤为：将高酸性蛋白酶华根霉接种于发酵培养基中，培养条件为28～35℃，pH值为6.5～7.5，培养100～140小时。

4.根据权利要求3所述的高酸性蛋白酶华根霉的培养方法，其特征在于：所述发酵培养基的组成：40～80g大米和8～16g黄豆粉，58ml水，混合煮熟。

5.根据权利要求3所述的高酸性蛋白酶华根霉的培养方法，其特征在于：所述发酵培养基的组成为：50g大米和10g黄豆粉，58ml水，混合煮熟。

6.根据权利要求3所述的高酸性蛋白酶华根霉的培养方法，其特征在于：所述的pH值为用0.1mol/L的氢氧化钠和0.1mol/L的柠檬酸进行调节；

所述培养条件为30℃，pH6.8，培养120小时。

7.根据权利要求3所述的高酸性蛋白酶华根霉的培养方法，其特征在于：所述高酸性蛋白酶华根霉在接种之前，将斜面菌种活化，培养成液体菌种，液体菌种经过二级种子培养后，接种到发酵培养基中进行发酵培养。

8.根据权利要求7所述的高酸性蛋白酶华根霉的培养方法，其特征在于：所述的斜面菌种是将高酸性蛋白酶华根霉接种于总糖含量为2～20g/L的土豆固体斜面上，在25～35℃条件下培养30～72小时后，放入4℃冰箱保存；

所述的斜面菌种活化为将菌种点置于总糖含量为2～20g/L的土豆平板，28～32℃平板倒置培养38～42小时；

所述的液体菌种是将保存的高酸性蛋白酶华根霉菌种活化后，接种一环菌丝体于装有100毫升总糖含量为10～50g/L的米曲汁液体培养基的三角瓶中，于25～35℃条件下搅拌培养16～22小时，即为液体菌种；

所述的米曲汁液体培养基的成分为：500g大米，加水600ml，蒸煮至熟透，摊凉至室温，加入糖化酶，米饭在糖化酶的作用下，产生米曲汁，糖度调制20波美度；添加2％琼脂，混合煮沸；

所述的二级液体种子培养是指：一级液体种子培养，是将液体菌种按体积百分数2～5％的接种量，接入装有200毫升，总糖含量为10～50g/L的米曲汁的三角瓶中，于25～35℃条件下搅拌培养16～22小时，即为一级液体种子培养物；所述二级液体种子培养，是将一级种子培养液按体积分数2～5％的接种量，接入装有100升，总糖含量为10～50g/L的米曲汁的种子培养罐，在25～35℃条件下搅拌培养16～22小时，即为二级液体种子培养物。

9.权利要求1或2所述的高酸性蛋白酶华根霉用于制备麸曲在酿酒中的应用。

10.一种权利要求1或2所述的高酸性蛋白酶华根霉制作麸曲的方法，其特征在于具体步骤如下：麸皮蒸煮30分钟，培养水分为40％，冷却后拌曲，接种质量分数为0.4％的高酸性蛋白酶华根霉，30±1℃培养2天，入箱至培养18小时培养湿度为90～92％，然后湿度调整为85～87％，接着提高箱温为36±1℃干燥24小时，再提温至38±1℃干燥24小时，获得高酸性蛋白酶华根霉制作麸曲；培养期间温度高于35℃时，每小时翻曲一次。