JP5116270B2 - 鉄により生産が抑制される生物生産物の製造方法 - Google Patents
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Description
本発明の培地は、鉄により生産が抑制される生物生産物の製造のための培地であって、穀類を用いた醸造により得られるもろみまたはその粕のプロテアーゼ分解物を含む培地である。
(II)鉄により生産が抑制される生物生産物の製造方法
本発明の方法は、鉄により生産が抑制される生物生産物の製造方法であって、穀類を用いた醸造により得られるもろみまたはその粕のプロテアーゼ分解物を含む培地を用いて生物を培養する工程と、培養物から鉄により生産が抑制される生物生産物を回収する工程とを含む方法である。
実施例
以下、本発明を実施例を示してより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例1(窒素源の種類の検討)
(1―1)供試菌株
麹菌アスペルギルス・オリゼO−1013株(平成9年11月20日にFERM P−16528として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(日本国茨城県つくば市東1-1-1 つくばセンター中央第6)に寄託済み)、及びアスペルギルス・オリゼO−1018株(平成8年9月4日にFERM P−15834として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託済み)を用いた。
(1―2)清酒粕のプロテアーゼ分解物の調製
液化粕の凍結乾燥品10 gに蒸留水50mlを加え均一にし、市販プロテアーゼであるサモアーゼ(アマノエンザイム社製)を0.2g加え60℃で3時間攪拌しながら反応させた。100℃で10分加熱し酵素を失活させた後、遠心分離により不溶性の残渣を除去し、上清液を凍結乾燥し、液化粕サモアーゼ分解物の乾燥粉末を得た。
(1―3)培地の調製
培地1:基本培地としては、鉄制限ツァペックドックス培地 (0.2w/v% NaNO3, 0.1w/v%K2HPO4, 0.05w/v%KCl, 0.05w/v%MgSO4・7H2O, 2w/v% glucose, pH 6.0)を用いた。
培地2:鉄含有の対照培地として、上記鉄制限ツァペックドックス培地に最終濃度0.001w/v%となるようにFeSO4・7H2Oを添加した培地を調製した。
培地3:上記鉄制限ツァペックドックス培地にカザミノ酸(Difco社製)を最終濃度0.5w/v%となるように添加した。
培地4:上記鉄制限ツァペックドックス培地にイーストエキス(Difco社製)を最終濃度0.5w/v%となるように添加した。
培地5:上記鉄制限ツァペックドックス培地にダイゴポリペプトン(日本製薬社製)を最終濃度0.5w/v%となるように添加した。
培地6:上記鉄制限ツァペックドックス培地に液化粕サモアーゼ分解物を最終濃度0.5w/v%となるように添加した。
培地7:上記鉄制限ツァペックドックス培地にスピルリナ(大日本インキ社製)を最終濃度0.5w/v%となるように添加した。
(1―4)培養
上記2麹菌株を保存スラントからポテトデキストロースアガープレート(ニッスイ社製)に塗布し、胞子を形成させた。各株の胞子を回収し、上記の各培地40mlに106個/ml胞子を植菌し、30℃で7日間、振盪培養した。
(1―5)菌体湿重量の測定
培養終了後の菌糸を回収し、乾いた布を用いて水分を搾り取った後の菌体湿重量を測定した。これを培養液の液量で除し、培地あたりの菌体湿重量(mg/ml―broth)を算出した。
(1―6)デフェリフェリクリシン生産量の測定
培養上清100μlに10μlの0.2M クエン酸バッファー(pH4.0)、10μlの3000ppm FeCl3溶液を添加し、デフェリフェリクリシン(Dfcy)に鉄をキレートさせフェリクリシン(Fcy)とした。
(1―7)フコース特異的レクチンの調製および活性測定
アスペルギルス・オリゼのフコース特異的レクチンを、Biosci.Biotechnol.Biochem.66,1002−1008(2002)に記載の方法に準拠して調製した。即ち、培養物から菌糸を回収し、1.0mM PMSFを含む50mMリン酸カリウムバッファー (pH7.0)中で海砂を用いて磨り潰し、細胞抽出液を得た。このホモジネートを10,000×gで10分間遠心し、上清を分離した。こうして得た細胞抽出液上清を用いフコース特異的レクチンの赤血球凝集活性を測定した。即ち、U型96穴マイクロプレートのウェル中で、50μlの500―7.8μg/mlの2倍希釈系列の細胞抽出液上清に50μlのウサギ赤血球2%(v/v)を加え、室温で1時間放置後、赤血球凝集を目視で判定し、最小凝集濃度を算出した。レクチン活性を1U(1%ウサギ赤血球に対して1mg/mlが最小凝集濃度である凝集素1μgの凝集活性)と定義し、各々の最小凝集濃度とたんぱく質量を乗じて得られた総活性を培地量で除することで培地あたり活性(U/dl)を各培地でのレクチン生産量として比較した。なお、細胞抽出液、赤血球溶液の希釈には50mM PBS(pH7.2)を用い、たんぱく質濃度の測定はブラッドフォード法で行い、BSA換算量として求めた。
(1―8)結果
培地容量当たりの菌体湿重量、培養上清中のDfcy濃度、培養上清中のフコースレクチン活性を、図1に示す。図1横軸の数値1〜7は培地1〜7を示す。アスペルギルス・オリゼO―1013株、及びO―1018株の双方において、液化粕サモアーゼ分解物を添加した培地では、その他の窒素源を添加した培地に比べて、Dfcy濃度、及びフコースレクチン濃度のいずれも格段に高かった。特にレクチンは、実質的には、窒素源として液化粕サモアーゼ分解物を使用した場合のみ生産された。特に、鉄含有量が少ないと考えられるカザミノ酸を添加した培地より、液化粕サモアーゼ分解物を添加した培地を使用する方が、Dfcy、及びレクチンの生産量が格段に高くなることは注目すべきことである。
(2―1)供試菌株
実施例1と同様である。
(2―2)清酒粕のプロテアーゼ分解物の調製
プロテアーゼ1:実施例1と同様にして、液化粕サモアーゼ(アマノエンザイム社製)分解物を調製した。
プロテアーゼ2:サモアーゼに代えてプロチンFA(アマノエンザイム社製)を用いた他は、実施例1と同様にした。
プロテアーゼ3:サモアーゼに代えてYP―SS(ヤクルト社製)を用いた他は、実施例1と同様にした。
プロテアーゼ4:サモアーゼに代えてスミチームLP(新日本化学工業社製)を用いた他は、実施例1と同様にした。
プロテアーゼ5:サモアーゼに代えてプロテアーゼSアマノ(アマノエンザイム社製)を用いた他は、実施例1と同様にした。
プロテアーゼ6:サモアーゼに代えてトリプシン(和光純薬社製)を用いた他は、実施例1と同様にした。
(2―3)培地組成
実施例1と同様の、鉄制限ツァペックドックス培地 (0.2w/v%NaNO3, 0.1w/v%K2HPO4, 0.05w/v%KCl, 0.05w/v%MgSO4・7H2O, 2w/v%glucose, pH6.0)を用いた。これに、液化粕の各種プロテアーゼ分解物を全体に対して0.5w/v%添加した。
(2―4)培養
実施例1と同様にした。
(2―5)菌体湿重量測定・Dfcy濃度測定・フコース特異的レクチンの調製および活性測定
実施例1と同様にした。
(2―6)フコース特異的レクチンの生産量の確認
実施例1と同様にして、培養物から菌糸を回収し、1.0mM PMSFを含む50mMリン酸カリウムバッファー(pH7.0)中で海砂を用いて磨り潰し、細胞抽出液を得た。この細胞抽出液上清を各レーン5μgとなるようにSDS―PAGEに供しフコース特異的レクチンの生産量を確認した。精製フコース特異的レクチンはSDS―PAGEにおいて単一バンドを与えることが上記文献によって示されておりその分子量は35,000である。分子量35,000の位置に出現するバンドから、各種培養におけるフコース特異的レクチンの生産性を比較した。
(2―7)結果
菌体湿重量、Dfcy濃度、及びレクチン活性の結果を図2に示す。図2横軸の数値1〜6は、プロテアーゼ1〜6を示す。また、細胞抽出液のSDS―PAGEの結果を図3に示す。いずれのプロテアーゼを用いた場合も、高い菌体湿重量、及びDfcy濃度が得られた。また、レクチン活性は、プロテアーゼ3(YP―SS)及びプロテアーゼ4(スミチームLP)を用いた場合に、他のプロテアーゼを用いる場合より低かったが、SDS―PAGEにより、プロテアーゼ3、4を用いる場合にもレクチンが十分に生産されていることが分かる。細胞抽出液中に活性測定を阻害する因子が含まれているために測定できなかったと考えられる。
実施例3(粕の種類の検討)
(3―1)供試菌株
アスペルギルス・オリゼO−1018株を用いた。
(3―2)清酒粕のプロテアーゼ分解物の調製
粕として、清酒粕(普通粕および液化粕)、米焼酎粕、及び味醂粕をそれぞれ用いた。プロテアーゼSアマノ(アマノエンザイム社製)を用いて、実施例1と同様にして各種粕のプロテアーゼ分解物を得た。
(3―3)培地組成
基本培地としては、実施例1と同様の上記鉄制限ツァペックドックス培地を用いた。これに、各種粕のプロテアーゼ分解物を全体に対して0.5w/v%添加した。また、粕分解物を添加しない培地も対照として用いた。
(3―4)培養
実施例1と同様とした。
(3―5) 菌体湿重量測定・Dfcy濃度測定・フコース特異的レクチンの調製および活性測定
実施例1と同様とした。
(3―6)鉄濃度測定
各種粕プロテアーゼ分解物の0.1w/v%溶液を調製し、原子吸光(Perkin Elmer社製、AAnalyst800)にてFe含量を測定した。この結果から、各種粕プロテアーゼ分解物の粉末あたり、又は粕プロテアーゼ分解物を0.5w/v%添加した培地あたりの鉄含量を算出した。
(3―7)結果
菌体湿重量、Dfcy濃度、及びレクチン活性の結果を図4に示す。図4横軸の1は液化粕、2は普通粕、3は焼酎粕、4は味醂粕のプロテアーゼ分解物を全体に対して0.5w/v%添加した培地での各値、5は粕分解物を添加しない培地での各値を示す。また、各種粕のプロテアーゼ分解物の鉄濃度を以下の表1に示す。
実施例4(清酒粕のプロテアーゼ分解物添加量の検討)
(4―1)供試菌株
アスペルギルス・オリゼO−1013株を用いた。
(4―2)清酒粕のプロテアーゼ分解物の調製
実施例1と同様にして、液化粕サモアーゼ(アマノエンザイム社製)分解物の乾燥粉末を調製した。
(4―3)培地組成
実施例1と同様の、鉄制限ツァペックドックス培地 (0.2w/v%NaNO3, 0.1w/v%K2HPO4, 0.05w/v%KCl, 0.05w/v%MgSO4・7H2O, 2w/v%glucose, pH6.0)を用いた。これに、液化粕のサモアーゼ分解物の乾燥粉末を全体に対して0.5〜1.5w/v%添加した。
(4―4)培養
実施例1と同様にした。
(4―5)Dfcy濃度測定
実施例1と同様にした。
(4―6)結果
Dfcy濃度の結果を図5に示す。図5横軸の数値は、清酒粕のプロテアーゼ分解物の添加濃度w/v%を示す。いずれの濃度で清酒粕のプロテアーゼ分解物を添加した場合も、高いDfcy濃度が得られた。
Claims (7)
- 麹を用いて醸造された酒類の粕のプロテアーゼ分解物を含む培地を用いてアスペルギルス属微生物を培養する工程と、培養物からシデロフォアを回収する工程とを含む、シデロフォアの製造方法。
- 培養に使用する培地が、鉄濃度2ppm以下の基礎となる培地に麹を用いて醸造された酒類の粕のプロテアーゼ分解物を添加したものである請求項1に記載の方法。
- 培養に使用する培地の鉄濃度が2ppm以下である請求項1又は2に記載の方法。
- 培地が液体培地である請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 培地中の粕のプロテアーゼ分解物の含有量が、乾燥重量に換算して、0.05〜5w/v%である請求項4に記載の方法。
- 培地が固体培地である請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 培地中の粕のプロテアーゼ分解物の含有量が、乾燥重量に換算して、0.05〜5重量%である請求項6に記載の方法。
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