CN105176846A - 产生物铁载体化合物的fedt-866真菌菌株及制备方法 - Google Patents

Abstract

产生物铁载体化合物的FEDT-866真菌菌株及制备方法，属于微生物分离和培养。本发明以碱性及富含不溶解铁环境土壤样品分离微生物真菌菌株，筛选获得铁载体活性较强的塔宾曲霉（<i>Aspergillus？tubigensis</i>？）菌株FEDT-866，保藏号CGMCC？No.10985。制备包括菌株液体培养，发酵液前处理及精制铁载体活性物质等步骤。本发明菌株产孢丰富，培养基原料廉价，液体培养条件简单，易于工业化放大，具有生物医药、农业、环境修复等的应用前景。

Description

产生物铁载体化合物的FEDT-866真菌菌株及制备方法

技术领域

本发明属于微生物工程，涉及塔宾曲霉（Aspergillus tubigensis ）菌株及其制备生物铁载体的方法。

背景技术

铁离子对于生命体维持细胞内多种酶的活性必不可少，但在自然界，铁大多是不溶解的氧化铁或氢氧化铁，生物可利用性极低。上世纪50年代，人们发现微生物中存在一种对Fe³⁺有极高亲和性的小分子化合物，其分子量界于500～1500 Da，命名为铁载体（Siderophore），该类化合物存在于绝大部分类型的微生物中，但含量稀少。目前已知的铁载体化合物约500种，根据其配位结构的特征，分为四种类型：异羟肟酸型（hydroxamaces）、儿茶酚型（catecholates）、羧酸盐型（carboxylates）和混合型。研究显示，铁载体类化合物并非仅亲和Fe³⁺，还可螯合锰、锌，甚至对生物体具有毒性的铅、汞、铬以及镉等重金属离子。因此，它在生物医药、农业、环境修复等领域具有广泛的应用前景。例如，对于感染性疾病，利用微生物特异的铁载体转运系统将结合体定向的转入到病原微生物体内，像单克隆抗体一样定向杀死靶向病原微生物，避免病原微生物对药物的抗性（Roosenberg JM, Lin YM, Lu Y, etal . Studies and syntheses of siderophores, microbial iron chelators, and analogs as potential drug delivery agents[J]. Current Medicinal Chemistry, 2000, 7: 159~197.），而真菌铁载体本身可以作为治疗心血管疾病的潜在药物（Pocsi I, Jeney V, Kertai P, et al . Fungal siderophores function as protective agents of LDL oxidation and are promising anti-atherosclerotic metabolites in functional food[J]. Mol. Nutr. Food Res, 2008, 52, 1434~1447.）。农业上，产生铁载体的非病原真菌能够获取生长所需要的铁，具有种间竞争上的优势，抑制不能携带铁载体的病原微生物生长。对于重金属污染环境修复，铁载体促进植株根际周围矿物质溶解，使植株吸收包括铁在内的多种金属离子（Mishra B, Haack EA, Maurice PA, et al . A spectroscopic study of the effects of a microbial siderophore on Pb adsorption to kaolinite[J]. Chemical Geology, 2010, 275,199~207.）。

近10年文献中，以原核生物，特别是海洋微生物的研究占据了相当比例，真核微生物铁载体的研究只占了较少部分。相比其它微生物天然化合物，陆生碱性环境微生物铁载体的研究目前尚处于空白。

发明内容

本发明旨在通过分离、筛选、提供一种铁载体活性较强的活性真菌菌株，并以该菌株为出发菌株提供一种获得目的铁载体活性物质和化合物的制备方法。

本发明通过以下技术方案实现上述技术发明目的：

（一）产生物铁载体化合物的真菌菌株FEDT-866

所述菌株为塔宾曲霉（Aspergillus tubigensis）FEDT-866，保藏编号为CGMCC No：10985。

（二）真菌菌株FEDT-866的制备方法

包括以下步骤：

（1）制备孢子悬液及液体培养液

将菌株FEDT-866接种于去铁查氏琼脂培养基的琼脂斜面上，每支斜面试管规格为ø15×150 mm，该琼脂培养基体积5 mL，28℃培养4～7 d，待菌丝体形成大量孢子后，向斜面加入5 mL无菌去离子水，灭菌竹签轻刮洗菌苔制成孢子悬液；

制备所述的去铁查氏琼脂培养基（g/L）：NaNO₃ 2.0 g、K₂HPO₄ 1.0 g、KCl 0.5 g、MgSO₄ 0.5 g、蔗糖30.0 g、琼脂20.0 g、去离子水1 L、pH自然，配好后121℃灭菌20 min；

（2）制备种子液

取步骤（1）按一支FEDT-866菌株制备孢子悬液接种200 mL灭菌去铁查氏基础培养基，28℃，180 rpm培养5 d，待培养液内有大量菌丝球生长即停止培养，以该培养液为种子液；

（3）制备发酵粗提的铁载体制剂

取种子液接种于去铁查氏基础培养基的三角瓶，种子液与去铁查氏基础培养基体积比为5mL：200 mL，灭菌28℃，180 rpm培养5 d，待培养液内有大量菌丝球生长即停止培养，收集培养液，过滤，弃菌渣，滤液用硅藻土吸附烘干即为发酵粗提的铁载体制剂；

所述的去铁查氏基础培养基与去铁查氏琼脂培养基的成分区别是：去铁的查氏基础培养基不加入琼脂，其余成分相同。

进一步的精制工艺中，所述的制备方法是：

（1）取步骤（3）滤液缓慢加入填充75~150 μm精细填料且高度为60 cm的110×2 cm玻璃柱中，常压吸附，收集过柱液，循环3次；甲醇冲洗玻璃柱，收集洗脱液，保留过柱液与洗脱液的活性部分；

（2）精制过柱液与洗脱液的活性部分

取步骤（1）过柱液减压蒸干，用丙酮溶解，过滤，蒸干丙酮，甲醇溶解，过滤，收集的白色颗粒物放入去离子水中，45℃水浴，溶解白色颗粒物，4℃结晶，待短粗的无色透明棱形结晶析出后重结晶3次，过滤，烘干，得到过柱液的精制品，该精制品与CAS显色液反应呈鲜艳的桃红色；

取步骤（1）洗脱液蒸干，用石油醚洗涤，甲醇溶解，4℃结晶，待大量细长无色针状晶体析出后重结晶3次，过滤，烘干，得到洗脱液的精制品，该精制品与CAS显色液反应呈紫红色。

本发明具有以下积极进步和意义：

选择前期从云南省永胜县碱性湖泊-程海泥样pH为8.85~9.05，湖水呈高硬度，Fe³⁺与Fe²⁺浓度分别为0.0005 mg/L及0.0002 mg/L以及个旧大屯矿坝不溶解状态铁氧化类物质pH：8.64-8.93，金属质量百分比：铁14.64%、锡0.29%、铅0.044%、砷0.18%、铜0.12%的碱性尾矿土壤样品中，分离获得100株真菌菌株；以CAS显色原理为指导比较不同层次的产铁载体的活性及类型，筛选得到一株铁载体活性较强的活性真菌菌株FEDT-866。经过分子生物学鉴定，FEDT-866被鉴定为塔宾曲霉（Aspergillus tubigensis）菌株，该菌株于2015年6月17日在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”有效保藏，保藏号为：CGMCC No.10985，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。

本发明以FEDT-866为出发菌株进行培养，培养物制备的方法包括发酵粗提的铁载体制剂和进一步精制重结晶，获得目的铁载体活性化合物。该菌株所产铁载体为大极性化合物，水溶解性好、活性高、可作为相关铁载体产品开发的优良候选材料，且菌株发酵工艺简单、结晶工艺流程容易。

附图说明

图 1为菌株FEDT-866 ITS序列系统发育树状图。

图 2为菌株FEDT-866扫描电子显微镜形态。

以下结合实施例做进一步说明。本发明实施例包括但不限制本发明的保护范围。

具体实施方式

实例 1. 菌株初筛

将前期分离自云南程海泥样及个旧大屯碱性尾矿土壤的100株真菌接种于去铁查氏琼脂培养基斜面上，试管规格为ø15×150 mm，培养基为5 mL，每株菌接种2支斜面（1支为备用），28℃培养4~7 d，待菌丝体形成大量孢子后，除备用斜面外，向斜面中加入5 mL无菌去离子水，灭菌竹签轻刮洗菌苔制备孢子悬液备用。

每株菌的孢子悬液分别接种到装有去铁查氏基础培养基的试管中（试管规格为ø15×150 mm,液体培养基体积5 mL），每株菌接种3支试管，设置未接菌的3支试管为阴性对照，28℃培养7 d，待试管液体培养基表面有大量菌丝生长及孢子出现时进行初筛。

其中，去铁的查氏琼脂培养基（g/L）配制方法是：NaNO₃ 2.0 g；K₂HPO₄ 1.0 g；KCl 0.5 g；MgSO₄ 0.5 g；蔗糖30.0 g；琼脂20.0 g；去离子水1 L；pH自然；配好后121℃灭菌20 min。去铁的查氏基础培养基成分与去铁的查氏琼脂培养基相同，但其中不加琼脂。

初筛是在96孔板中每孔中加入20微升CAS染液和等体积的上述菌株试管液体培养液，二者充分混合，记录变为红色、紫色或黄色的培养液样品所对应的菌株编号作为下一步复筛菌株。未接种真菌的培养液样本为阴性对照。乙二胺四乙酸（EDTA）饱和去离子水溶液为阳性对照。根据CAS染液特有的颜色反应，共从100株真菌中筛选出36株有颜色变化的真菌，其中24株颜色反应为红色或橘红色，7株为黄色，5株为紫色，将其作为复筛的目标菌株。

其中，CAS染液的配制参照文献（Brian C. Louden; Daniel Haarmann; Aaron Lynne.Use of Blue Agar CAS Assay for Siderophore Detection. JM&BE.，2011，12 (1): 51-53.）进行。

本发明将CAS液体检测法与96孔板法相结合来作为对产铁载体真菌的筛选，操作简单、快速，适合于大批量的筛选。

实例2. 菌株复筛

1. 培养液96孔板快速复筛

将初筛选出来的36株真菌分别制备孢子悬液（实例1），分别接种到100 mL液体去铁查氏培养基中，每菌株接种250 mL三角瓶 3瓶，孢子悬液接种量为5 mL/100 mL，未接种真菌的培养液样本为阴性对照。各摇瓶统一在28℃、180 rpm摇床上培养5 d，待培养基内有大量菌丝球出现即进行复筛。

复筛中，以未接种真菌的培养液样本为阴性对照，EDTA饱和去离子水溶液为阳性对照。向96孔板每孔加入40微升CAS染液和等体积的上述菌株试管液体培养液，轻微摇晃，充分混合。用秒表测定混合后颜色变化时间，记录所对应的菌株编号，反应用时短、反应颜色红的菌株产铁载体的螯合能力强，将其作为复筛入选菌株。

在36株复筛菌株中，有7株菌的培养液与CAS染液的显色时间≤5秒，显色橘黄、橘红及桃红，作为复筛入选菌株。而阳性对照EDTA饱和去离子水溶液的显色时间为2±0.12秒，颜色为紫红色。

2. CAS双层平板对照筛选验证

以CAS双层平板法进一步验证上述筛选程序获得的菌株是高产铁载体的真菌。将前期复筛获得的7株真菌每株菌接种2支斜面，1支为备用，28℃培养4~7 d，待菌丝体形成大量孢子后，向斜面中加入5 mL无菌去离子水，用灭菌竹签轻刮洗菌苔制备孢子悬液备用。

在无菌条件下，每菌株孢子悬液用无菌滴管各吸取10微升菌悬液滴入事先放置于CAS双层琼脂平板上的ø5 mm灭菌滤纸片上。处理好的平板用封口膜封好，28℃培养3~5 d后观察结果。未接菌的空白培养基作为阴性对照。用0.2微米滤头过滤的乙二胺四乙酸（EDTA）饱和去离子水溶液作为阳性对照。

其中，CAS双层平板配制方法为：当1％琼脂温度下降到65℃时，按5 mL CAS染液100 mL 1％琼脂的比例，将65℃水浴30 min的CAS蓝色检测液与其混合均匀，按20 mL／皿量倒入ø105 mm平板，室温下凝固作为下层平板。之后将灭菌之后的去铁的查式培养基按15 mL／皿量倒入下层CAS平板上，室温下凝固作为上层平板，放ø5 mm灭菌滤纸片备用。

去铁的查氏琼脂培养基配制方法同上。

CAS双层平板验证结果：3 d后7株菌株在平板上都具有明显菌落生长，与阴性空白对照相比，在菌落的下方或周围具有明显的颜色变化。其中，与阳性空白对照相比，FEDT-866菌落周围颜色变化非常明显，呈鲜艳桃红色，且扩散趋势强烈，菌落迅速将整个平板颜色改变，说明菌株FEDT-866产铁载体的活性很强，亲水性好，并且所产铁载体随着菌丝体生长不断分泌到细胞外，符合铁载体的筛选要求，将其作为最终入选菌株。

实例3. 目的菌株FEDT-866铁载体含量和结构类型检测

1. FEDT-866铁载体定量测定

制备FEDT-866菌株孢子悬液（实例1），取100 mL孢子悬液在250 mL三角瓶的去铁查氏培养基上接种，接种量为5 mL/100 mL，共3瓶，28℃、180 rpm培养5 d，待体培养基出现大量菌丝球即作为发酵液进行铁载体定量测定。未接种的去铁查氏培养基作为空白对照。

分别取5 mL发酵液用0.2微米微孔滤膜过滤除菌，与5 mL CAS染液混匀，静止1 h，测定其OD₆₈₀ (As)，以双蒸水作为对照调零，处理重复3次。用相同方法测定未接菌空白培养基吸光值作为参比值（Ar），铁载体的浓度用铁载体活性单位（Siderophoreunit, SU）表示，SU=[(Ar−As)/Ar]×100%，SU值与铁载体活性正相关。一般产铁载体能力较高的微生物As/Ar低于0.5。结果显示（见表1），菌株FEDT-866的As/Ar小于0.5，表明其为高产铁载体真菌。

表 1 阳性菌株 FEDT-866 产铁载体的定量测定

	OD680	SU	As/Ar
				空白对照	3.843(Ar)	-	-
FEDT-866	1.254(As)	0.674	0.326

2. FEDT-866铁载体的化学结构类型检测

用氯化铁检测法（FeCl₃ test）对异羟肟酸型铁载体和儿茶酚型铁载体进行检测。

异羟肟酸型铁载体检测方法：将5 mL FEDT-866菌株发酵液用0.2 μm微孔滤膜过滤除菌，取1 mL滤液加入1~5 mL 2%氯化铁溶液。紫外分光光度计检测，螯合物为异羟肟酸型铁载体的吸收峰在420~450nm之间。

儿茶酚型铁载体检测方法：将5 mL FEDT-866菌株发酵液用0.2 μm微孔滤膜过滤除菌，取1 mL滤液加入1 mL 250 μmol CuSO₄溶液和2 mL pH =4的醋酸盐缓冲液。紫外分光光度计检测，螯合物为羧酸型铁载体的吸收峰在190~280 nm之间。

表 2 FEDT-866 铁载体的化学结构类型检测

结果显示，FEDT-866铁载体的化学结构类型同时包括异羟肟酸型和羧酸型。

实例4. 目的菌株FEDT-866的分子生物学鉴定

1、基因组DNA提取、扩增和测序

将高产铁载体菌株FEDT-866接种在已灭菌的50 mL PDA液体培养基中， 180 rpm，28 ℃下培养3 d，提取基因组DNA及其扩增、测序。

其中，PDA培养基的成分为（g/L）：马铃薯200.0 g，蔗糖20.0 g，水1 L，pH自然。马铃薯去皮，切块煮沸30 min，过滤，加糖溶化，补足水至1 L，121℃灭菌30 min。

基因组DNA的提取方法为：取3~5 mL培养物，13000 rpm，离心1 min，弃培养基。加入真菌DNA提取裂解液300 μL，涡旋沉淀，65℃水浴30 min：加入等体积氯仿与异戊醇混合液，氯仿：异戊醇=24:1，涡旋混匀，13000 rpm离心5 min，取上清；加入等体积的异丙醇，混匀，13000 rpm，离心5 min，弃上清；加入70%乙醇混匀，13000 rpm离心1 min，弃乙醇，倒置离心管，晾干。加入30 μL ddH₂O，溶解DNA，进行下游PCR扩增。

其中，rDNA-ITS的PCR扩增体系组成为：5微升10×KOD buffer；5微升2 mm dNTPs；1微升Genomic DNA；1微升Forward Primer (10um)；1微升Reverse Primer (10um)；1微升KOD DNA Polymerase；36微升ddH₂O。扩增程序为：94℃ 3 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 3 min，35个循环；72℃ 10 min。PCR 产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，再扩增1个50 μL体系的PCR后回收产物。PCR回收产物程序为：加入4倍体积（800 μL）的Buffer CP到1.5 mL离心管，剧烈震荡，短暂离心；把吸附柱放在收集管里；把PCR扩增产物混合物按每次750微升转入吸附柱，13000 rpm离心1 min，弃废液；加入700微升洗脱液，13000 rpm离心1 min，弃废液；加入500 μL洗脱液，13000 rpm离心1 min，弃废液；将吸附柱放入收集管，空管13000 rpm离心2 min，以去除吸附柱上的乙醇。把吸附柱转到一个新的1.5 mL离心管，在吸附柱中心加入30微升ddH₂O，室温放置1min，13000 rpm离心1min，回收滤液即获DNA。PCR产物T载体连接体系为：4微升5×Reaction Buffer；10微升PCR Product；2微升pTZ57R/T Vector；1微升T4 DNA Ligase；3微升ddH₂O。PCR产物T载体连接程序：摇匀，离心，22℃放置1 h，连接产物直接转化。解冻化学感受态细胞TOP10，转移到1.5 mL离心管中，加入连接产物，冰上放置30 min。将离心管放于42℃水浴90 s，冰浴2 min，室温放置5 min。每管加800微升无抗生素LB液体培养基，37℃振荡45 min复苏。8000 rpm离心2 min，去掉800微升上清液，重悬后均匀涂布到Amp抗性平板上，室温吹干，倒置于37℃培养箱，培养12~16 h长出菌落，进行菌落PCR鉴定和测序。

2. 分析ITS序列

FEDT-866菌株rDNA序列经PCR扩增和测序，获得长度为606个有效碱基的ITS序列。

测得的DNA序列经NCBI BLAST引擎搜索后获取相关种属的ITS基因序列，用ClustalX 1.8软件进行排列。系统发育分析时排除碱基缺失位点，用邻接法构建系统发育树。距离矩阵按照Kimura’s双参数模型进行计算，Bootstrap检验进行1000次取样。结果显示，菌株FEDT-866在进化树上的位置可靠(Bootstrap值>70)。线段标尺(0.01)表示1%序列差异的分支长度。由系统进化树得知菌株FEDT-866与标准菌株Aspergillus tubigensis CBS 134.48 ITS序列最大相似性达到99.65%（见图1）。

3. FEDT-866扫描电子显微镜观察

取FEDT-866菌株制备孢子悬液（实例1）200微升均匀涂布到PDA培养基上，以30~45°角斜插入已灭菌的盖玻片，28℃培养5 d，待培养基表面大量着生孢子菌丝蔓延至盖玻片即停止培养。取出盖玻片，置于灭菌105 mm培养皿内，室温下充分干燥5 d，菌丝体表面喷金，扫描电子显微镜观察。

其中，PDA培养基的成分为（g/L）：马铃薯200.0 g，蔗糖20.0 g，琼脂20.0 g，水1 L，pH 自然。马铃薯去皮，切块煮沸30 min，过滤，加糖溶化，补足水至1 L，121℃灭菌30 min。

扫描电子显微镜观察结果：菌株FEDT-866呈曲霉属微生物典型特征，分生孢子梗由一根直立的菌丝形成，菌丝的末端形成球状膨胀。菌株分生孢子梗及孢子粗糙有棘（见图2）。在自然光下观察，该菌株分生孢子呈深褐绿色。

综合以上信息，推断菌株FEDT-866菌株属于塔宾曲霉Aspergillus tubigensis。

实例5.菌株FEDT-866铁载体的制备

将1支FEDT-866菌株制备孢子悬液（实例1）接种于200 mL灭菌液体去铁查氏培养基中（实例1），28℃，180 rpm培养5 d，待培养液内有大量菌丝球生长即停止培养。以该培养液为种子液，按5%接种比例将其平均接种到20瓶各装有200 mL灭菌液体去铁查氏培养基的500 mL三角瓶内，28℃，180 rpm培养5 d。待培养液内有大量菌丝球生长即停止培养，收集培养液，过滤，弃菌渣，滤液用硅藻土吸附烘干即为铁载体制剂。

实例6.菌株FEDT-866铁载体的精制

将1支FEDT-866菌株制备孢子悬液（实例1）接种于200 mL灭菌液体去铁查氏培养基中（实例1），28℃，180 rpm培养5 d，待培养液内有大量菌丝球生长即停止培养。以该培养液为种子液，按5%接种比例将其平均接种到20瓶各装有200 mL灭菌液体去铁查氏培养基的500 mL三角瓶内，28℃，180 rpm培养5 d，待培养液内有大量菌丝球生长即停止培养，收集培养液，过滤，弃菌渣，滤液备用。

将75~150 μm精细填料填充到110×2 cm玻璃柱中，填充高度大约为60 cm，纯甲醇冲洗后，将滤液缓慢加入玻璃柱，常压吸附，过柱液收集后再加入到玻璃柱，循环3次，纯甲醇冲洗玻璃柱，收集洗脱液，用CAS检测试剂检测过柱液与洗脱液的活性，保留活性部分。

以上过柱液减压蒸干后用丙酮溶解，过滤除去不溶物，蒸干丙酮，纯甲醇溶解，过滤，白色颗粒物在45℃水浴中用去离子水溶解，4℃结晶，待短粗的无色透明棱形结晶析出后再反复重结晶3次，过滤，烘干，得到菌株FEDT-866铁载体的精制品1 ，该精制品与CAS显色液反应呈鲜艳的桃红色，为菌株FEDT-866主要的铁载体活性化合物之一。

以上洗脱液蒸干后用石油醚洗涤去掉油状物，甲醇溶解，4℃冰箱结晶，待大量细长无色针状晶体析出后再反复重结晶3次，过滤，烘干，得到菌株FEDT-866铁载体的精制品2 ，该精制品与CAS显色液反应呈紫红色，为菌株FEDT-866另一主要的铁载体活性化合物。

Claims (3)

1.产生物铁载体化合物的真菌菌株FEDT-866，其特征是：所述菌株为塔宾曲霉（Aspergillus tubigensis）FEDT-866，保藏编号为CGMCC No：10985。

2.如权利要求1所述的真菌菌株FEDT-866的制备方法，包括以下步骤：

（1）制备孢子悬液及液体培养液

将菌株FEDT-866接种于去铁查氏琼脂培养基的琼脂斜面上，每支斜面试管规格为ø15×150 mm，该琼脂培养基体积5 mL，28℃培养4～7 d，待菌丝体形成大量孢子后，向斜面加入5 mL无菌去离子水，灭菌竹签轻刮洗菌苔制成孢子悬液；

制备所述的去铁查氏琼脂培养基（g/L）：NaNO₃ 2.0 g、K₂HPO₄ 1.0 g、KCl 0.5 g、MgSO₄ 0.5 g、蔗糖30.0 g、琼脂20.0 g、去离子水1 L、pH自然，配好后121℃灭菌20 min；

（2）制备种子液

取步骤（1）按一支FEDT-866菌株制备孢子悬液接种200 mL灭菌去铁查氏基础培养基，28℃，180 rpm培养5 d，待培养液内有大量菌丝球生长即停止培养，以该培养液为种子液；

（3）制备发酵粗提的铁载体制剂

取种子液接种于去铁查氏基础培养基的三角瓶，种子液与去铁查氏基础培养基体积比为5mL：200 mL，灭菌28℃，180 rpm培养5 d，待培养液内有大量菌丝球生长即停止培养，收集培养液，过滤，弃菌渣，滤液用硅藻土吸附烘干即为发酵粗提的铁载体制剂；

所述的去铁查氏基础培养基与去铁查氏琼脂培养基的成分区别是：去铁的查氏基础培养基不加入琼脂，其余成分相同。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是：

（1）取步骤（3）滤液缓慢加入填充75~150 μm精细填料且高度为60 cm的110×2 cm玻璃柱中，常压吸附，收集过柱液，循环3次；甲醇冲洗玻璃柱，收集洗脱液，保留过柱液与洗脱液的活性部分；

（2）精制过柱液与洗脱液的活性部分

取步骤（1）过柱液减压蒸干，用丙酮溶解，过滤，蒸干丙酮，甲醇溶解，过滤，收集的白色颗粒物放入去离子水中，45℃水浴，溶解白色颗粒物，4℃结晶，待短粗的无色透明棱形结晶析出后重结晶3次，过滤，烘干，得到过柱液的精制品，该精制品与CAS显色液反应呈鲜艳的桃红色；

取步骤（1）洗脱液蒸干，用石油醚洗涤，甲醇溶解，4℃结晶，待大量细长无色针状晶体析出后重结晶3次，过滤，烘干，得到洗脱液的精制品，该精制品与CAS显色液反应呈紫红色。