CN112501031B - 拟球孢白僵菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及农业微生物领域，公开了一株拟球孢白僵菌及其应用。本发明公开的拟球孢白僵菌的保藏编号为CGMCCNo.21047。此外，本发明还提供了所述拟球孢白僵菌在制备异羟肟酸型铁载体和调控植物病害中的应用。本发明的拟球孢白僵菌为高产铁载体的优势菌株，能合成分泌异羟肟酸型铁载体。本发明的拟球孢白僵菌的次生代谢产物对青枯假单胞菌(Pseudomanas solanacearum)、软腐胡萝卜果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum)和青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)均具有抑菌活性。

Description

拟球孢白僵菌及其应用
技术领域
本发明涉及农业微生物领域，具体涉及一株拟球孢白僵菌及其应用。
背景技术
铁元素在土壤与地壳中含量较为丰富，同时铁元素作为自然界中几乎所有生物体必须的微量元素之一。在生物体的酶促反应和代谢活动中铁元素发挥着重要作用；但铁元素在自然界中主要以不溶性的三价态稳定形式存在，生物体可利用的二价铁含量较匮乏，铁元素利用率十分低。农业生产中植株存在较为普遍的缺铁现象，导致植株正常生长发育受到限制，降低植株的抗性，此外土壤微生物群落中菌群丰度的失衡可使植株病害加重。因此，为适应二价铁离子含量较低的环境，微生物通过自身诱导合成，分泌一类对高价铁离子具有较强螯合能力的小分子化合物—铁载体，并通过微生物自身的氧化还原反应将高价态的铁离子转化为有利于生物体吸收的低价铁离子，为土壤环境中提供足够的可利用铁元素，同时有效的调节土壤中微生物种群丰度，增强植株抗病性。
根据铁载体官能团和中心结构的多样性，铁载体类型可分为异羟肟酸型(hydroxamates)、儿茶酚型(catecholates)和羧酸盐型(carboxylates)。铁载体在农业生产中的应用包括多个方面：1)利用铁载体可为重金属污染的土壤进行合理修复，有成本低，效率高，无环境污染。2)植物的根系存在大量微生物菌群，利用微生物所分泌的铁载体，争取环境中的铁元素，以满足植株自身生长需要，促进生长发育。3)植物根系在土壤环境中充分利用能够产铁载体的有益微生物菌群，合理调节微生物群落间种群丰度，有利于植株健康生长。
拟球孢白僵菌(Beauveria pseudobassiana)属于有益真菌，具体分类为子囊菌门、粪壳菌纲、肉座菌目、虫草菌科、白僵菌属。目前还没有报道同时具有抑菌活性与铁载体活性的拟球孢白僵菌。
发明内容
本发明目的是为了克服现有存在的问题，提供一株拟球孢白僵菌及其应用，该拟球孢白僵菌有很强的分泌铁载体活性和抗菌活性。
以上述目的为出发点，本发明的第一方面提供一株拟球孢白僵菌菌株，该菌株的保藏编号为CGMCC No.21047。
本发明的第二方面提供了一种制备异羟肟酸型铁载体的方法，包括：将上述拟球孢白僵菌接种于液体培养基中进行培养。
本发明的第三方面提供了一种防治植物病害的方法，该方法包括将含有如上所述的拟球孢白僵菌的代谢产物的制剂施用于植物。
本发明的第四方面提供了如上所述的拟球孢白僵菌在制备异羟肟酸型铁载体中的应用。
本发明的第五方面提供了如上所述的拟球孢白僵菌和/或其代谢产物在防治植物病害中的应用。
本发明的拟球孢白僵菌作为高产铁载体活性的菌株，能够分泌异羟肟酸型铁载体。因此，本发明能够为产铁载体微生物的代谢产物在用于植物健康管理的研究中提供理论基础。而且，本发明的拟球孢白僵菌还具有较高的抑菌活性，特别是对番茄青枯病、马铃薯青枯病和烟草青枯病，具有较佳的防治效果。
生物保藏
本发明的拟球孢白僵菌(Beauveria pseudobassiana)，于2020年11月9日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)(保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.21047。
具体实施方式
本文里所使用的数值范围的端点都不限于本发明的精确的范围或值，对于这些范围或值可理解为包含精确的值或范围。对于本发明涉及的数值或范围，其中包括各个范围的端点值和单独的点值之间、各个端点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
在本发明中，在未对本文术语作相关说明情况下，使用的术语“铁载体”指的是具有螯合铁元素的小分子化合物，“高产铁载体活性的菌株”指的是能够高效分泌铁载体的微生物，“发酵代谢产物”指的是菌株通过发酵，分泌许多的代谢产物，“抑菌活性”指的是对植物病原菌具有抑制或阻碍生长的活性。
本发明提供的拟球孢白僵菌的保藏编号为CGMCC No.21047。
本发明提供的菌株产铁载体活性验证提供了一种制备异羟肟酸型铁载体的方法，包括：将上述拟球孢白僵菌接种于液体培养基中进行培养。
根据本发明，所述液体培养基可以为常规的能够培养拟球孢白僵菌的培养基，在优选情况下，所述液体培养基含有葡萄糖25-30g/L，硝酸钠1-2g/L，三水合磷酸钾1-2g/L，氯化钾0.3-0.8g/L，七水合硫酸镁0.3-0.8g/L，8-羟基喹啉0.5-1g/L，pH6.8-7。
根据本发明，所述培养的条件可以包括：温度为20-30℃，时间为48-96h。优选地，所述培养的条件包括：温度为25-30℃，时间为75-96h。
根据本发明，所述方法还可以包括对培养产物进行提取操作，以从中获得异羟肟酸型铁载体。提取操作的方式可以为甲醇浸提，也即使用甲醇浸泡培养产物。相对于每升的培养产物，甲醇的用量可以为0.5-1L。浸提的温度可以为25-30℃，时间可以为24-48h。
根据本发明，可以在发酵前对拟球孢白僵菌进行扩大培养，对扩大培养的条件没有特别要求，但优选的情况下，使用大米培养基(蒸熟的大米)对拟球孢白僵菌进行扩大培养，培养的方式可以为于25-30℃、黑暗条件下培养30-60天。
本发明所提供的菌株为高产铁载体活性的拟球孢白僵菌，其通过菌株的发酵与扩大培养有效提取菌株的代谢产物，为验证其代谢产物的抑菌功能择番茄青枯、马铃薯青枯、烟草青枯等植物病原菌进行抑菌活性测定。
根据本发明，保藏编号是CGMCC No.21047的拟球孢白僵菌具有分泌异羟肟酸型铁载体，对多种植物病原菌具有抑制或阻碍其正常生长的能力，但优选情况下，对番茄青枯病、马铃薯青枯病、烟草青枯病的病原菌抑菌活性较突出，一定程度上实现防治植物青枯病的目的。
因此，本发明还提供了一种防治植物病害(或促进植物生长)的方法，其特征在于，该方法包括将含有如上所述的拟球孢白僵菌的代谢产物的制剂施用于植物。
根据本发明，所述代谢产物可以由拟球孢白僵菌的培养物提供。也即拟球孢白僵菌的代谢产物可以按照如上所述的方法制备，具体地，将拟球孢白僵菌接种至液体培养基中进行培养。根据本发明的一种优选实施方式，培养的条件如前所述，在此不再赘述。
根据本发明的另一种优选实施方式，所述培养在蒸熟的大米培养基中进行培养，培养的方式为于25-30℃、黑暗条件下培养30-60天。所述方法还可以包括对培养产物进行提取操作，以从中获得异羟肟酸型铁载体和抑菌活性物质。提取操作的方式可以为甲醇浸提，也即使用甲醇浸泡培养产物。相对于每克的培养产物，甲醇的用量可以为0.25-0.5L。浸提的温度可以为25-37℃，时间可以为24-48h。
本发明中，所述制剂中加入Fe3+后其抑菌活性明显下降，表明本发明的菌株中铁载体活性与抑菌活性存在密切关联。因此，在优选情况下，所述制剂不含铁离子，也即所述方法不包括向植物施用含铁离子的药剂的步骤。
根据本发明，所述植物可以为各种农作物，优选为容易受青枯病影响的植物，更优选情况下，所述植物选自番茄、马铃薯和烟草中的至少一种。
根据本发明，本发明的菌株的代谢产物对番茄青枯病、马铃薯青枯病、烟草青枯病的病原菌抑菌活性较突出，因此，所述植物病害优选选自青枯假单胞菌(Pseudomanassolanacearum)、软腐胡萝卜果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum)和青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)中的至少一种引起的植物病害。
本发明还提供了如上所述的拟球孢白僵菌在制备异羟肟酸型铁载体中的应用。
本发明还提供了如上所述的拟球孢白僵菌和/或其代谢产物在防治植物病害(植物青枯病)中的应用。如前所述，所述植物病害优选选自青枯假单胞菌、软腐胡萝卜果胶杆菌和青枯雷尔氏菌中的至少一种引起的植物病害。
本发明还涉及如上所述的拟球孢白僵菌和/或其代谢产物在抑制青枯假单胞菌、软腐胡萝卜果胶杆菌和青枯雷尔氏菌中的至少一种中的应用。
本发明中述及的青枯假单胞菌、软腐胡萝卜果胶杆菌和青枯雷尔氏菌可以自行分离得到，也可以商购获得。
通过以下实施例将对本发明进行详细地描述。以下实施例中，青枯假单胞菌购自北京百欧博伟生物技术有限公司，编号为bio-51812；胡萝卜软腐病菌(胡萝卜软腐果胶杆菌)购自北京百欧博伟生物技术有限公司，编号为bio-02810；青枯雷尔氏菌购自北京百欧博伟生物技术有限公司，编号为bio-103869。
实施例1
本实施例可说明本发明涉及的菌株的形态鉴定与分子遗传学分类鉴定的结果。
从中国云南省哀牢山国家级自然保护区原始森林土壤(100°49'-101°53'E，23°95'-24°17'N，海拔2600m)中分离到一株真菌，将其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21047。
将拟球孢白僵菌在平板培养基上(土豆300g，葡萄糖30g，琼脂27g，去离子水1.5L，pH 7)培养，菌落形态为圆形，白色，不透明，菌落表面有绒毛状菌丝；扫描电镜放大20000倍后菌株的分生孢子间隔稀疏，为椭圆形，长2μm-3.5μm，宽1.5μm-2μm，分生孢子表面有褶起。在形态观察基础上，菌株ITS测序结果在Gen Bank数据库中进行相似性搜索，并与同源性高于80％的标准菌株序列进行同源比对，与拟球孢白僵菌(NR 111598)同源性高达99.98％，故将其鉴定为子囊菌门、粪壳菌纲、肉座菌目、虫草菌科、白僵菌属微生物。目前对于拟球孢白僵菌的应用主要存在于农业害虫方面主要有草地贪夜蛾、玉米螟、松墨天牛，但是在关于马铃薯，番茄，烟草青枯病害的应用还没有详细报道。
实施例2
本实施例可说明本发明涉及的菌株的产铁载体性能。
(1)试管种培养
将拟球孢白僵菌接种于固体斜面培养基上，于25℃下培养84h，则获得试管种；所述的固体斜面培养基配方是：土豆300g，葡萄糖30g，琼脂27g，去离子水1.5L，pH 7；
(2)固体平板种子培养
采用平板培养基培养，方法如下：
配制无铁查氏固体培养基：葡萄糖30g·L-1，硝酸钠2g·L-1，三水合磷酸钾1g·L-1，氯化钾0.5g·L-1，七水合硫酸镁0.5g·L-1，8-羟基喹啉0.75g·L-1，去离子水1L，固体加琼脂18g。
双层显色培养基：下层：去离子水100ml，琼脂1.8g，15ml CAS液；上层：无铁查氏固体培养基。再将拟球孢白僵菌接种于双层平板培养基上，出现红色表明菌株分泌铁载体。
(3)对该菌株的产铁载体活性进行初筛和定量复筛
将单个菌株接种于PDA固体平板培养基中心，将平板培养基放置在25℃的恒温培养箱中培养7天(为单菌株平板培养)，对培养完成的单菌落用打菌饼器取菌饼(直径6mm)，接种在双层显色培养基的中心上层，每菌株3重复，将完成接种的培养基放置在25℃恒温培养基中培养7天，测量红色晕圈的直径R，计算晕圈面积S＝π×r2(π＝3.1415，r＝R/2)。
菌株用无铁查氏液体培养基于28℃、150r/min的恒温摇床(型号：HS-200B)上培养48h，培养结束后吸取约3mL培养液用0.22μm无菌滤膜过滤后加入等体积的CAS检测液，静置1h后用全波长酶标仪(型号：Multiska GO)测定其OD630(记作“As”)，用相同方法测定未接菌的液体培养基的OD630作为参比值(记作“Ar”)。铁载体的浓度用铁载体活性单位(siderophore unit,SU)表示，SU＝[(Ar-As)/Ar]×100％，测定重复3次，取平均值进行比较分析。
结果显示，拟球孢白僵菌菌株定性测定中晕圈的直径为2.82cm(0.20)，则红色晕圈的面积为12.5cm2(1.77)。定量测定中OD630为0.43(0.01)，As/Ar比值为0.38(0.01)，铁载体活性(SU)为62.02％，说明本发明的拟球孢白僵菌为高产铁载体的优势菌株。
实施例3
本实施例用来说明本研究发明的菌株所产铁载体化合物的化学结构初步鉴定。
鉴定方法如下：
异羟肟酸型(hydroxamates)铁载体的鉴定：1mL培养滤液中加入1mL 2％FeCl3溶液，出现红色或紫色表明测试样品中含有铁载体物质。用紫外分光光度计检测(EU-2200R)，在420-450nm之间出现吸收峰则说明螯合物质为异羟肟酸型铁载体。结果显示，通过使用分光光度计(EU-2200R)全波段扫描后发现菌株培养滤液均在420-450波段下均出现最高波峰，故判定拟球孢白僵菌菌株产异羟肟酸型(Hydroxamaces)铁载体。
实施例4
本实施例用来说明本研究发明的菌株培养、发酵代谢产物提取。
选择发酵配方为：10g、25g、50g、100g蒸熟大米进行高压灭菌处理，装入到100ml、250、500ml、1000ml组培瓶中。接种拟球孢白僵菌浓度分别100μl、250μl、500μl、1000μl的菌悬液(1×109/ml)于28℃，黑暗条件下培养45天。在发酵产物中加入甲醇在37℃下浸泡48h(每升发酵产物甲醇的用量为1L)，溶解，使用滤纸片、漏斗进行过滤后进行装瓶，再选择旋转蒸发仪(R-210BUCHI)，温度设置45℃，转数700rpm/min，直到有机溶剂完全蒸发。结果显示，得到固体的菌株代谢产物，加水溶解得到抑菌待测液(浓度为20mg/mL)，为后续的抑菌活性验证提供原材料。
实施例5
本实施例用来说明本研究发明的菌株代谢产物对植物青枯病原菌的抑菌结果。
实施方法：用双层平板培养基(底层：水琼脂固体培养基，上层：NA培养基(具体组成为蛋白胨10g，牛肉粉3.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g，pH值7.0-7.4))培养，选择圆形滤纸片(直径6mm)在抑菌待测液中浸泡5min，在融化完成的NA培养基(约55℃)中加入400μl菌悬液(植物青枯病原菌，1×109/ml)，充分摇匀，倒在平板培养基上层，在双层平板培养基上层接种圆形滤纸片(滤纸片叠加1、2、3层)，并设置未加抑菌待测液的空白对照，每处理3重复。放置25℃，培养72h后，记录抑菌圈面积：对青枯假单胞菌18.92cm2(2.29)，对软腐胡萝卜果胶杆菌7.61cm2(0.69)，对雷尔氏青枯菌4.19cm2(0.29)。
使用96孔板A/B/C/D/E/F/G/H行，1-12列板孔(比如A1，A2，A3...A12；B1，B2...B12等)，每个菌株3重复。在板孔中加入菌悬液100μl与NA液体培养基100μl，之后分别在A/B两排第一孔中加稀释好的抑菌待测液(浓度为20mg/mL)100μL，并设置空白对照加100μL无菌水，后用移液枪充分吹打(至少三次以上)使抑菌待测液与液体培养基充分混匀，然后吸取100μL加入第二孔再充分吹打使之与液体培养基充分混匀，照此重复直至最后一孔，吸取100μL弃去。将96孔板放入37℃恒温培养箱18h后，酶标仪OD625测定吸光度。换算成麦氏比浊浓度或微生物的近似浓度(×108/ml)，从而计算杀菌(抑菌)率。其计算公式为：抑制率＝“生长对照组微生物浓度(或麦氏比浊浓度)”—“抑菌待测组微生物浓度(或麦氏比浊浓度)”/“生长对照组微生物浓度(或麦氏比浊浓度)”×100％。结果显示：代谢产物浓度下降，抑菌活性(百分比)降低。针对不同植物病原菌的代谢产物抑菌活性也存在显著性差异。代谢产物浓度分别为：10mg/ml,5mg/ml,2.5mg/ml,1.25mg/ml,0.625mg/ml,0.3125mg/ml,0.15625mg/ml,0.0781mg/ml,0.039mg/ml,0.019mg/ml,0.0097mg/ml和0.004mg/ml，各个浓度下，对青枯假单胞菌的抑菌率为92.83％，82.27％，72.77％，63.83％，42.5％，23.33％，13.93％，12.7％，9.33％，8.3％，7.1％，4.93％；对软腐胡萝卜果胶杆菌抑菌率为62.4％，32.1％，13.3％，12.4％，10.7％，9.9％，8.4％，8.2％，7.8％，7.7％，4.8％，2.8％；对雷尔氏青枯菌为68.47％，55.53％，37.23％，25.77％，22.2％，20.93％，13.57％，7.47％，6.73％，4.3％，3.27％，2.2％。
实施例6
本实施例用来说明本研究发明的菌株代谢产物在富铁情况下对植物病原菌的抑菌结果。
实施方法：菌株的代谢产物中添加1mol/ml FeCl3溶液(菌株代谢产物与FeCl3溶液体积比为1:1)，配制成浓度为20mg/mL菌株代谢产物+FeCl3溶液，使用96孔板A/B/C/D/E/F/G/H行，1-12列板孔(比如A1，A2，A3...A12；B1，B2...B12等)，每个菌株3重复。与实施例5的试验方法相同，测定对青枯假单胞菌的最低抑制浓度(抑菌率)。结果显示：菌株代谢产物中添加1mol/ml FeCl3溶液后，代谢产物抑菌活性会出现显著下降：针对青枯假单胞菌，拟球孢白僵菌代谢产物对青枯假单胞菌在高浓度(5mg/ml)下的抑菌率约为82.27％，而添加FeCl3后，抑菌率则下降到37％。针对软腐胡萝卜果胶杆菌在高浓度(5mg/ml)下的抑菌率约为32.1％，而添加FeCl3后，抑菌率则下降到15.25％，针对青枯雷尔氏菌在高浓度(5mg/ml)下的抑菌率约为55.53％，而添加FeCl3后，抑菌率则下降到25.21％。该现象表明：代谢产物中的铁载体与拟球孢白僵菌发挥抑菌作用有重要关联。
以上详细地描述本发明的多种实施方案并得出优选的目标致病菌，浓度等，但是本发明并不仅限于此。在本发明的实施方法，技术构思，浓度配比等在内的，可以对本发明的技术方案进行简单的多种变型，也包括各个技术要点、特征以及其它任何方式进行组合，以上的简单变型与组合等同样应当被视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一株拟球孢白僵菌（Beauveria pseudobassiana），其特征在于，该拟球孢白僵菌的保藏编号为CGMCC No. 21047。
2.一种制备异羟肟酸型铁载体的方法，其特征在于，该方法包括：将权利要求1所述的拟球孢白僵菌接种至培养基中进行培养。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述培养基含有：葡萄糖25-30g/L，硝酸钠1-2g/L，三水合磷酸钾1-2g/L，氯化钾0.3-0.8 g/L，七水合硫酸镁0.3-0.8 g/L，8-羟基喹啉0.5-1g/L，pH6.8-7。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其中，所述培养的条件包括：温度为20-30℃，时间为48-96h。
5.一种防治植物病害的方法，其特征在于，该方法包括将含有权利要求1所述的拟球孢白僵菌的代谢产物的制剂施用于植物，其中，所述植物病害选自青枯假单胞菌（Pseudomanas solanacearum）、软腐胡萝卜果胶杆菌（Pectobacterium carotovorum）和青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）中的至少一种引起的植物病害。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述代谢产物由拟球孢白僵菌的培养物提供；
或者，所述制剂不含铁离子。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其中，所述植物选自番茄、马铃薯和烟草中的至少一种。
8.权利要求1所述的拟球孢白僵菌在制备异羟肟酸型铁载体中的应用。
9.权利要求1所述的拟球孢白僵菌和/或其代谢产物在防治植物病害中的应用；
其中，所述植物病害选自青枯假单胞菌、软腐胡萝卜果胶杆菌和青枯雷尔氏菌中的至少一种引起的植物病害。
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