CN106998696A - 稳定的真菌芽生孢子及其生产、稳定化和使用的方法 - Google Patents

Abstract

本文描述的是虫生真菌的基于芽生孢子的昆虫防控产品的方法，所述虫生真菌包括B.bassiana或I.fumosorosea，其通过识别用于快速生产高浓度的稳定且感染性酵母样芽生孢子组合物所需要的营养条件和环境条件来生产高浓度的稳定高效孢子。

Description

稳定的真菌芽生孢子及其生产、稳定化和使用的方法

交叉引用

本申请要求2014年9月15日提交的美国临时申请号62/050,473的优先权。

技术领域

本发明一般性地涉及与采用虫生真菌防控节肢动物害虫有关的方法和组合物。具体公开了用于生产和干燥用于防控软体昆虫类害虫的Beauveriabassiana(白僵菌)和Isaria fumosorosea(玫烟色棒束孢)的耐干燥芽生孢子(营养细胞)的方法和组合物。

背景技术

由节肢动物害虫引起的植物病害和损害导致了对以植物为基础的农业和工业产生巨大的经济损失。已经追求了多种多样的方法来防控攻击植物尤其是商业上有价值的植物的害虫。尽管如此，植物和植物产品的害虫破坏仍然是一个主要问题。

传统上，已经通过施用化学杀虫剂来追求节肢动物害虫的防控。使用化学品有许多缺点。昆虫类害虫能够对化学物质产生耐受性并且随着时间的推移对化学物质产生耐受性，从而产生抗性种群。事实上，对除害剂的抗性是对农业和园艺产业中化学害虫防控的可行性的一个重大挑战。此外，化学除害剂在其目标中并不总是有选择性的，从而通常会对有益物种(例如传粉者)造成负面影响。由于这种不利影响和其它不利影响(例如对人类健康和环境的影响)，已经对其它生物防控方法研究了很长时间。一种这样的方法是使用某些虫生真菌作为生物防控剂。正是由于应对关于化学毒性的担忧时的公众压力，过去20年来，已经直接重新兴起了对生物防控(诸如微生物杀虫剂)的兴趣。生物防控提供了一种防控节肢动物害虫的替代方法，该方法比目前的方法是潜在地更有效的和特异的，并且减少了对化学物质的依赖。

由于能够感染各种各样的昆虫类害虫以及大规模生产的潜力，昆虫真菌病原体可用作生物防控剂。生产和配制是作为商业产品成功的关键组成部分。有不同的大规模生产方法，包括用于气生分生孢子的固体底物发酵(SSF)和用于酵母样芽生孢子、微循环分生孢子和微核菌的液体培养发酵(LCF)。迄今为止，在淹没式生物防控策略中部署的大部分子囊菌真菌虫生病原体(子囊菌(Ascomycota)：肉座菌目(Hypocreales))包括Beauveriabassiana sensu lato(Bals.)Vuill.、B.brongniartii(Sacc.)Petch、Isariafumosorosea Wise(之前称为Paecilomyces fumosoroseus)、Lecanicillium longisporum和L.muscarium(Petch)R.Zare和W.Gams(之前称为Verticillium lecanii)以及Metarhizium anisopliae sensulato(Metsch.)Sorokin.，并且气生分生孢子包括通常使用固体培养技术生产的这些真菌杀虫剂的主要活性成分。不幸的是，在固体底物上形成孢子的发酵时间通常需要几周，并且该过程是劳动密集型的，具有高的污染风险，从而导致高生产成本。另一方面，液体发酵技术可以克服这些生产的障碍/缺点，并且在受控的营养条件和环境条件下提供更经济的大规模产生不同的真菌繁殖体的能力。由于几天的短的发酵时间、产品易于回收、工艺的自动化以及廉价的培养基成分的可用性，液体发酵被认为是生产真菌生物防控剂的最具成本效益的方法。

因此，在液体培养物中产生感染性真菌繁殖体的方法是期望的。但是，需要克服技术障碍。首先，无性型肉座菌(hypocrealean)虫生真菌(例如B.bassiana和I.fumosorosea)在液体培养中产生芽生孢子，而不是分生孢子。虽然被称为芽生孢子，但这些细胞实际上是营养型酵母样细胞，并且是不耐干燥的，并且贮存期相对有限(Chong-Rodriquez等，2011；Lohse等，2014)。因此，需要开发在液体培养物中产生耐干燥、贮存稳定的芽生孢子的方法，以使得可以利用芽生孢子进行有害生物防控。在本文中，我们描述这样的方法。

真菌因通过表达分解代谢酶和渗透酶来代谢各种化合物的能力而众所周知。在碳和氧之后，氮是真菌细胞中最丰富的元素，是发酵培养基中最昂贵的营养成分之一。对于开发合适的生物除害剂生产培养基来说识别低成本氮源是至关重要的。廉价的氮源(例如棉籽粉和大豆粉)通常是主要含有蛋白质和寡肽的未精制料。这些农产品和食品加工副产品比含有大量游离氨基酸的精制氮源(诸如酸或酶水解酪蛋白、大豆水解物或肉蛋白质)更便宜。之前的研究已经证明了，使用更精制的氮源(例如酸水解酪蛋白)可以在较短的发酵时间(≤3天)内产生具有良好的耐干燥性的I.fumosorosea的芽生孢子。

因为真菌虫生病原体具有广泛的遗传变异性，并且当在液体培养基中生长时会有不同的反应，因此必须考虑合适的菌株特异性参数，同时评估和优化液体培养物生产参数。使用I.fumosorosea的工作已经定义了营养条件和环境条件，所述营养条件和环境条件支持快速生产具有合理贮存期的高浓度耐干燥芽生孢子。然而，由于芽生孢子制品需要较长的发酵时间和较差的耐干燥性和短的孢子贮存期限，B.bassiana的芽生孢子的商业用途是不存在的。展现出具有贮存稳定性同时具有作为生物防控剂的生物效能的耐干燥芽生孢子的生产尚未得到实现，因此是期望的。

发明内容

在本发明的一个实施方式中，提供了一种生产包含芽生孢子的组合物的方法，其中组合物包含通过如下步骤生产的Beauveria物种或Isaria物种的耐干燥芽生孢子，所述步骤包括：用Beauveria物种或Isaria物种的真菌繁殖体接种包含碳源和氮源的液体培养基；在提供高于零的溶解氧水平和大于0.5MPa的渗透压的培养条件下孵育繁殖体，将繁殖体孵育足够的时间以产生芽生孢子，收集芽生孢子；并且将芽生孢子干燥，从而产生耐干燥芽生孢子。在一些实施方式中，Beauveria物种是B.bassiana。在其它实施方式中，Isaria物种是I.fumosorosea。在一个具体的实施方式中，碳源以至少6％的初始浓度存在于液体培养基中。碳源可以是葡萄糖。在另一个具体的实施方式中，氮源以至少1.5％的初始浓度存在于液体培养基中。氮源可以是棉籽粉或水解酪蛋白。在一个特定的实施方式中，碳源是葡萄糖并且氮源是棉籽粉。

本文中所提供的另一个实施方式是一种杀虫组合物，其包含农学上可接受的载体以及Beauveria物种或Isaria物种的耐干燥芽生孢子，其中载体和芽生孢子被包含在气密包装中并且其中芽生孢子是通过如下步骤产生的：用Beauveria物种或Isaria物种的真菌繁殖体接种包含碳源和氮源的液体培养基；在提供高于零的溶解氧水平和大于0.5MPa的渗透压的培养条件下孵育所述繁殖体，将繁殖体孵育足够的时间以产生芽生孢子，收集芽生孢子；并且将芽生孢子干燥，从而产生耐干燥芽生孢子。在一些实施方式中，Beauveria物种是B.bassiana。在其它实施方式中，Isaria物种是I.fumosorosea。在一些情形中，杀虫组合物还包含除氧化合物、除湿化合物或者二者的组合。在一些实施方式中，当在储存超过6个月后再水合时，大于60％的芽生孢子是有活力的。在一个具体的实施方式中，杀虫组合物可以储存在28℃或更低的温度下。

在本发明的另一个实施方式中，提供了一种昆虫防控的方法，所述方法包括在所述昆虫的地点施用杀虫有效量的Beauveria物种或Isaria物种的耐干燥芽生孢子。在一些情形下，耐干燥芽生孢子是通过上文中所描述的方法产生的。在一些实施方式中，Beauveria物种是B.bassiana。在其它实施方式中，Isaria物种是I.fumosorosea。在一个具体的实施方式中，在芽生孢子产生过程中，碳源是葡萄糖并且氮源是棉籽粉或水解酪蛋白。昆虫的地点可以是农作物。

通过引用并入

本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体地和单独地指明通过引用并入的程度一样。

附图简要说明

本发明的新颖特征在权利要求中具体阐述。本发明的特征和优点将参考下面的详细描述和附图，其中：

图1提供了在液体培养物中使用不同氮源产生的B.bassiana分离株GHA和ESALQ1432的芽生孢子产生和芽生孢子耐干燥性的图示。

图2提供了在增加的氮含量的存在下生长时增加的芽生孢子产量和耐干燥性的图示。

图3提供了两个真菌属的经空气干燥的芽生孢子中的水活度(a_w)和水分含量之间的关系的图。

图4提供了证明在4℃下储存的几种B.bassiana菌株的长期存活率的图。

图5提供了证明在4℃下储存的几种I.fumosorosea菌株的长期存活率的图。

图6提供了在除氧和湿剂的存在下在28℃下显示B.bassiana芽生孢子存活率的图。

图7提供了在除氧和湿剂的存在下显示B.bassiana芽生孢子存活率的图。将细胞用或不用抗坏血酸(ASA)进行喷雾干燥。

图8提供了显示出在不同的葡萄糖浓度和渗透压点下培养B.bassianaESALQ1432的芽生孢子产生速率的图。

图9提供了在增加的渗透压的存在下生长的芽生孢子的形态学分析。

图10提供了显示出溶解氧水平受培养物体积影响的图。

图11提供了显示出在不同体积和不同氮源的培养物中芽生孢子产量和耐干燥性的两个平板。

图12提供了显示出在高渗透压培养中生长的芽生孢子对虫生病原体效力的影响的两个平板。

具体实施方式

本文显示和描述了本发明的优选实施方式。对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施方式仅以示例的方式提供。在不背离本发明的情况下，本领域技术人员将想到许多变体、变化和替换。可以在实施本发明时采用本文中所描述的本发明的实施方式的各种替代方案。旨在由所包括的权利要求限定本发明的范围，并且从而涵盖在这些权利要求及其等同的范围内的方法和结构。

本文使用的技术术语和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义，除非另有定义。在本发明的说明书中使用的术语仅用于描述具体的实施方式，而不旨在限制本发明。如在本发明的说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一”、“一个”、“一种”和“该”以及不使用量词的情形也旨在包括复数形式，除非上下文另有明确指出。

除非另有说明，否则在说明书和权利要求中使用的表示成分数量、性质诸如分子量、反应条件等的所有数字应被理解为在所有情况下被术语“约”修饰。因此，除非另有说明，否则在如下的描述和权利要求中阐述的数值性质可根据在本发明的实施方式中寻求获得的期望性质而变化。尽管展示本发明的广泛范围的数值范围和参数是近似值，但是在具体实例中列出的数值是尽可能精确地报告的。然而，任何数值固有地包含由其各自测量中发现的误差必然导致的某些误差。术语“约”被定义为所述值的正或负10％。例如，约1.0g意指0.9g至1.1g。

本文中使用时，术语“分离的”、“纯化的”或“生物纯的”是指基本上或本质上不含通常伴随其天然状态下的参考材料的组分的材料。

如本文中所描述，术语“贮存稳定”及其语法变体通常是指在4℃下储存时表现出一年或更长时间活力的经空气干燥或喷雾干燥(小于5％的水分)的芽生孢子，其中活力被测量为在将干燥的芽生孢子在合适的液体培养基中再水合和孵育6-7小时后至少约60％的发芽。

如本文中所描述，术语“耐干燥性”及其语法变体通常是指当在六至七小时孵育内在合适的培养基(例如马铃薯葡萄糖液)中再水合并生长时显示出50％或更多发芽的干燥的芽生孢子。

真菌虫生病原体被认为是管理许多昆虫类害虫(包括粉虱)群体的生物合理性前沿工具，其具有与合成化学杀虫剂的应用相结合的潜力，以减轻昆虫对杀虫剂的抗性的发展。大量的文献集中在使用B.bassiana和I.fumosorosea的气生分生孢子作为接触生物杀虫剂来防控粉虱。多项研究表明，I.fumosorosea的酵母相(芽生孢子)在防控粉虱、地下白蚁、蚱蜢、蚜虫和甲虫方面比气生分生孢子更有效。在我们最近的一项使用气生分生孢子的粉虱防控研究中，我们确认了B.bassiana和I.fumosorosea的剧毒的Brazilian分离株，它们有效地感染并杀死各种生命阶段的银叶白粉虱Bemisia tabaci生物型B(半翅目：粉虱科)。

本文中描述了用于在液体培养条件下生产耐干燥性、贮存稳定性芽生孢子的液体培养发酵方法。在一个有利的实施方式中，培养条件包括高曝气速率、至少0.5兆帕(MPa)的渗透压、至少1.5％的合适氮源和至少6％的合适碳源。液体培养技术可用于Beauveria属虫生病原物种的生长，以促进上述的贮存稳定性、耐干燥性和改善的对昆虫病原体的生物效能的质量。可以与如上所述的液体培养发酵方法一起使用的Beauveria物种包括包括Beauveria alba、Beauveria amorpha、Beauveria arenaria、Beauveria asiatica、Beauveria australis、Beauveria bassiana、Beauveria brongniartii、Beauveriabrumptii、Beauveria caledonica、Beauveria chiromensis、Beauveria coccorum、Beauveria cretacea、Beauveria cylindrospora、Beauveria delacroixii、Beauveriadensa、Beauveria dependens、Beauveria doryphorae、Beauveria effusa、Beauveriaepigaea、Beauveria felina、Beauveria geodes、Beauveria globulifera、Beauveriaheimii、Beauveria kipukae、Beauveria laxa、Beauveria malawiensis、Beauveriamelolonthae、Beauveria nubicola、Beauveria oryzae、Beauveria paradoxa、Beauveriaparanensis、Beauveria parasitica、Beauveria petelotii、Beauveria pseudobassiana、Beauveria rileyi、Beauveria rubra、Beauveria shiotae、Beauveria sobolifera、Beauveria spicata、Beauveria stephanoderis、Beauveria sulfurescens、Beauveriasungii、Beauveria tenella、Beauveria tundrensis、Beauveria velata、Beauveriavarroae、Beauveria vermiconia、Beauveria vexans、Beauveria viannai、Beauveriavirella。包括Metarhizium spp.、Hirsutella spp.、Lecanicillium spp.、Isaria spp.和Nomuraea spp.的二态性的其它丝状虫生真菌很可能会有效且毫不吝惜地使用由高曝气、渗透压以及合适的氮源和浓度的组合构成的目前产生条件来生产芽生孢子。

本发明的虫生真菌的芽生孢子可以用于感染和杀死各种各样的经济上重要的节肢动物，包括地面昆虫、土生昆虫和居树荫(canopy-dwelling)昆虫。不限于此，可由本发明组合物防控的节肢动物包括根象鼻虫、根虫、线虫、果蝇、土蛆、根蛆、白蚁、蜱、跳蚤、蚱蜢、蚂蚁和具有农业、园艺、医疗和兽医重要性的各种其它昆虫。目标昆虫的一些非限制性实例包括玉米根虫(Diabrotica spp)、葡萄黑象甲(Otiorhynchus sulcatus)、柑橘根象鼻虫(Diaprepes abbreviatus)、甘薯象鼻虫(Cylas formicarius)、甜菜根蛆(Tetanopsmyopaeformis)、卷心菜蛆(Delia radicum)、洋葱蛆藜藜(Delia antigua)、萝卜蛆(Deliafloralis)、种蝇(Delia platura)、胡萝卜锈飞虱(Psila rosae)、日本甲虫(Popilliajaponica)、欧洲马鞭毛草(Rhizotrogus majalis)、地下白蚁(Reticulitermes andCoptotermes spp.)、翡翠灰螟(Agrilus planipennis)、吉普赛蛾(Lymantria dispar)和山核桃象鼻虫(Curculio caryae)、烟草毛虫(Spodoptera litura)、烟芽夜蛾、棉铃虫(Helicoverpa armigera)、秋季夜蛾(Spodoptera frugiperda)、玉米螟蛉(Helicoverpazea)、欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)、亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis Guenee)、高粱茎螟(Chilo partellus,Coniesta ignefusalis,Busseola fusca,Chilo spp.)、水稻三化螟(Scirpophaga incertulas)、稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalisi)、褐稻虱(Nilaprvata lugens)、稻蓟马(Stenchaetothrips biformis)、叶蝉(Hishimonusphycitis)、蚱蜢(Melanoplus spp.)、仙人掌象鼻虫(Metamasius spinolaei)、银叶粉虱(Bemisia argentifolii)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、守瓜(Diabroticaundecimpunctata)、苜蓿环纹夜蛾(Autographa californica)、棉花蚜虫(Aphisgossypii)、白蚁(Odontetermes obesus,Odontotermes spp.,Trinervitermesbiformis)、浮尘子科动物(Emboasca kerri)、牧草虫(Frankliniella schultzei,Scirtothrips dorsalis,Podothrips bicolor)、小菜蛾(Plutella xylostella)、桃蚜(Aphis gossypii)、马铃薯蚜(Macrosiphum euphorbiae)、蓟马(Anephothrips dorsalis,Thrips palmi)、水蜡虫(Maconellicoccus hirsutus)、蚱蜢(Melanoplus spp.)、粉虱(Bemisia tabaci)、茄子茎螟(Leucinodes orbonalis)、螟虫、甜菜夜蛾、(Spodopteraexigua,Spodoptera spp.)、甘蓝银纹夜蛾(Trichoplusia ni,Trichoplusia spp.)、多刺棉铃虫(Earias insulana)、斑螟蛉(spotted bollworm)(Earias vitella)、卷叶蛾(Sylepta derogata)、螨(Leyranychus telari)、秋葵叶蝉(Amrasca biguttula)、蚊子(Anopheles gambiae,Culex quinquefasciatus)、家蝇(Musca domestica)、蟑螂(Periplanata americana)和蜱(Ixodes dammini)、骚扰锥蝽、长红猎蝽、蜱-软蜱(Argaspersicargas persicus)、牛蜱(Rhipicephalus microplus)、果氏巴贝虫、黑脚硬蜱或鹿蜱(Ixodes scapularis)、绵羊螨(Psoroptes ovis)、热带家禽螨(Ornithonyssus bursa)、跳蚤-蚤目、猫蚤(Ctenocephalides felis)和牛虱(Haemaptopinus eurysternus)。

培养条件

根据分离株差异、年龄、培养基和培养条件，可用于实践本发明的真菌(特别是B.bassiana和I.fumosorosea的真菌)展现出从分生孢子到假菌丝、菌丝和芽生孢子(酵母样营养细胞)的多态形式。像大多数真菌一样，它们生长的培养条件影响生物体的多个生物学方面，包括形态形式和生物产物谱。

因此，本领域技术人员将认识到，在实践本文公开的本发明时可以修改多个培养条件。在本文公开的本发明的应用和实践中可以修改的培养条件的非限制性示例包括：1)温度；2)主要碳源；3)氧气浓度；4)主要氮源；5)pH；6)矿物等离子浓度；7)培养年龄/成长期；8)工业发酵罐的配置；和9)占主导地位的形态形式。本领域技术人员将认识到，可以修改影响所期望的生物产物生产和生物产物产量的其它培养参数。

在本发明的一个方面，本文中所描述的真菌菌株的培养物可以在促进一种或多种生物产物生产的任何温度下生长。例如，培养物可以在15℃-30℃的温度下或在该范围内的任何全部或部分温度下生长，包括但不限于15.0℃、15.5℃、16.0℃、16.5℃、17.0℃、17.5℃、18.0℃、18.5℃、19.0℃、19.5℃、20.0℃、20.5℃、21.0℃、21.5℃、22.0℃、22.5℃、23.0℃、23.5℃、24.0℃、24.5℃、25.0℃、25.5℃、26.0℃、26.5℃、27.0℃、27.5℃、28.0℃、28.5℃、29.0℃、29.5℃和30.0℃。

在一些实施方式中，本文中所描述的真菌菌株可以在培养物的pH促进产生感兴趣的一种或多种形态形式生产的条件下生长。例如，培养物可以在pH在3.0和8.5之间、4.5和6.5之间或在该范围内的任何值的培养基中生长，包括但不限于pH 3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5。本领域技术人员将认识到，在产生感兴趣的生物产物的菌株的整个生长过程中，不需要维持稳定的pH。因此，在一些实施方式中，本发明的微生物培养物的pH将变化。在其它实施方式中，可以加入pH缓冲液以保持相对稳定的pH，其中在培养物的寿命期间培养基的pH不会从所选的起始点变化大于±0.5。

在一些实施方式中，本发明的微生物菌株可以在特定碳源的存在下生长。例如，培养物可以在简单的碳源中生长，例如(D-或L-)阿糖醇、蔗糖、果糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖醇、葡萄糖醇、半乳糖醇、木糖醇、核糖醇、苏糖醇、甘油、葡糖酸、葡糖胺或内消旋赤藓糖醇。或者，培养物可以在复合碳源中生长，例如纤维素、淀粉、甜菜糖蜜、角豆荚、玉米面水解物、玉米糖浆、燃料乙醇发酵酒糟、葡萄皮浆、菜油、泥炭水解物、水解马铃薯淀粉和亚硫酸盐废液。可以利用也可用于其它营养需求(例如氮)来源的碳源。例如，用于本发明的培养基可以包括天冬氨酸、苏氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸及其代谢中间体。这些列表是非限制性的，并且在实践本发明时利用其它碳源完全在本领域技术人员的能力范围内。任何碳源可以单独使用或与其它碳源组合使用。

其它营养参数也可以变化，包括氮源。氮源的非限制性示例包括有机氮源(例如棉籽粉、酸水解酪蛋白、自溶酵母、谷氨酸、蛋白胨、大豆渣、酵母提取物、食物肉汁、麦芽提取物、玉米浆和大豆粉)和无机氮氮源(例如尿素、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵)可以包括在实践本发明中采用的生长培养基中。在一些实施方式中，氮源以1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、10％、10.5％、11％、11.5％、12％、12.5％、13％、13.5％、14％、14.5％、15％或更多的量存在。优选地，浓度在1.5％和9％之间。

根据需要，磷酸盐源(例如磷酸二氢钾、磷酸氢二钾及其相应的含钠盐)可以被包含在生长培养基中。可以根据需要包含金属盐和矿物盐，例如锌、铁、镁、锰、钙和铜的盐。还可以包括其它营养补充剂，例如维生素(例如生物素、硫胺素)。本领域技术人员将认识到，可以利用不同的培养营养补充剂来最大限度地生产感兴趣的生物产品并减少不期望的副产物的产生。这些营养物中的任一种都可以单独使用或与任何其它营养物组合使用。

在一些实施方式中，渗透剂用于控制液体培养物的渗透压。可以利用诸如糖(葡萄糖、半乳糖、果糖、海藻糖等)、多元醇(甘露糖醇、甘油、赤藓糖醇等)、蛋白质、氨基酸、盐、聚合物(聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等)的渗透剂以及能够用来改变用于浸没式发酵的液体培养基中渗透压的任何化合物。通常，根据本发明，通过增加渗透压>0.5MPa来实现芽生孢子形式和生产的改进。

在本发明的一个具体实施方式中，用于产生耐干燥孢子的液体培养技术利用至少1.5％-9％氮源和约4％至25％碳源的浓度，并且至少0.5MPa的渗透压。

可以以任何进料方案将营养物加入到培养物中，包括但不限于高细胞密度培养、间歇培养、补料分批培养、不断补料分批培养、指数分批培养、连续培养或这些方法的混合用于不同营养物。

在一些情况下，可以修改培养物生长的时间长度以增强或开始生产感兴趣的生物产物。例如，在开始收获生物产物之前，培养物可以生长10-300小时，或更长时间，或在该范围内的任何时间点，例如10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300小时或更多。

在搅拌的液体培养物中，本发明的培养物可以生长以增加溶解氧。影响溶解氧水平的因素包括培养体积、容器体积、旋转速度、以及在发酵罐中的曝气速率、搅拌器速度、叶轮设计、发酵罐设计、罐头压力和曝气气体混合物。在一些实施方式中，培养物可以以50-400rpm的任何可行的速度在旋转振荡器上振荡。发酵罐的曝气速率可以是从零至700标准升每分钟(slpm)的任何可行的速率，包括但不限于50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700或更多slpm。根据发酵罐尺寸，搅拌器速度可以从50-1000rpm。发酵罐头压力可以从0-30psi变化，以增加溶解氧水平。曝气气体混合物的氧含量可以从正常空气(其为21％氧气)到纯氧改变。在优选实施方式中，溶解氧水平将维持在零以上。

另外，真菌细胞生产的优化可以取决于培养物生长到生命周期中的特定点。例如，培养物可以生长到早期滞后期、中间滞后期、晚期滞后期、早期指数期、中间指数期、晚期指数期、早期固定期、中期固定期或死亡期。在一些情况下，培养物可以保持在生长阶段(例如通过补料分批培养)，以维持培养物的特定生长期。

在其它情况下，可以改变培养条件，使得真菌菌株的一种形态形式优于其它形态形式。例如，可以控制培养条件，使得酵母样形式(芽生孢子)占主导地位、分生孢子占主导地位或者菌丝/假菌丝占主导地位。

在一些优选的实施方式中，使用本发明产生的芽生孢子可以在作为生物防控剂使用之前被干燥。对于空气干燥的芽生孢子来说，通过过滤、离心或本领域已知的任何其它方法从培养肉汤中收获含有芽生孢子的培养肉汤(2-5天发酵)，以除去废培养基。芽生孢子可以与合适的助滤剂混合，例如但不限于粘土、硅藻土、滑石、二氧化硅或硅酸钙。可以将该混合物进行真空过滤以除去废培养基并形成滤饼。可以使用任何合适的造粒设备将滤饼破碎。然后使用空气干燥、真空干燥或流化床干燥将经造粒的芽生孢子滤饼干燥至最终水分含量小于5％或水活度(aw)低于0.3。或者，通过喷雾干燥具有或不具有载体或稳定剂的经分离的芽生孢子悬浮液或含有芽生孢子的培养肉汤，来进行芽生孢子制品的喷雾干燥或流化床干燥。载体或稳定剂可以包括改善芽生孢子制品的流动性、悬浮性、耐干燥性和/或贮存稳定性的化合物，并且可以包括但不限于蛋白质、碳水化合物、脱脂乳、麦芽糖糊精、二糖、简单糖、糖蜜、PVP、粘土、硅藻土、滑石、二氧化硅或硅酸钙。在入口/出口温度下进行喷雾干燥，使暴露于高温的芽生孢子最小化，并导致易流动的芽生孢子制品被干燥至小于6％的水分。优选的是例如使用90℃入口/50℃出口温度的喷雾干燥方案。其它的喷雾干燥入口/出口温度方案是适用的，只要经干燥的芽生孢子制品仅短暂暴露于高温下即可。流化床干燥可采用先前描述的载体并且在有利于孢子存活的温度下操作。

生物防控组合物

在一些实施方式中，将通过本发明的方法产生的芽生孢子与一种或多种其它组分组合以产生通常用作杀虫剂的生物防控组合物。在一些情况下，生物防控组合物包含至少一种农学上可接受的载体。这种载体的一些非限制性实例包括填料刺激剂、抗结块剂、润湿剂、乳化剂、营养修饰剂和抗氧化剂。这种载体可以单独使用或以任何组合使用。本领域技术人员能够选择合适的载体用于特定应用。填料刺激剂可以是碳水化合物源，例如二糖，包括例如海藻糖和蔗糖，或者单糖，例如果糖或葡萄糖。潜在的抗结块剂可以包括滑石、二氧化硅、硅酸钙或高岭土。润湿剂包括但不限于表面活性剂或脱脂乳粉。乳化剂可以包括大豆基乳化剂例如卵磷脂、或者蔬菜基的乳化剂例如单甘油酯。抗氧化剂可以包括但不限于谷氨酸钠、抗坏血酸和柠檬酸。

在各种实施方式中，生物防控组合物是能够支持真菌细胞组分的生殖活力或能够在2周至2年之间保持杀虫效力的稳定组合物。在一些情况下，这个时间段约为2周、约3周、约4周、约一个月、约二个月、约三个月、约四个月、约五个月、约六个月、约七个月、约八个月、约十九个月、约十二个月、约十三个月、约十四个月、约十五个月、约十六个月、约十七个月、约十八个月、约十九个月、约二十个月、约二十一个月、约二十二个月、约二十三个月、二十四个月或更长时间。这样的储存期可以在0-35℃之间的任何储存温度下实现。

为了促进长期储存，在一些实施方式中，诸如除氧剂和除湿剂(干燥剂)的组分可以与组合物的包装结合使用。通常，包装是不透气(气密)且不透水的设计。包装的具体材料对于本发明并不重要，并且任何可商购的材料可用于包装，例如可密封的铝膜或麦拉膜。干燥剂是通常位于密封包装内的多孔袋或小袋中的吸湿物质。有利的干燥剂是化学稳定的或化学惰性的，并且包括硅胶、活性炭、硫酸钙(Drierite)、氯化钙、分子筛(通常为沸石)、incozol 2、 Trixene AS、IBAY、AMP 95、AMPD、A3、A-171、547、TAFTIC^TM等。除氧剂可以包括通常通过氧化反应吸收氧的任何有效物质。可用于本发明的除氧剂的非限制性实例包括酶介导的氧化(BiokaS-100、BiokaS-75)、铁基氧化(AgelessFX-100、FreshPax)、抗坏血酸和碳酸氢钠等。

本发明的生物防控组合物可以与可统称为农用化学品的其它组分组合使用。可以与本发明的真菌繁殖体组合的农用化学品类别的实例包括但不限于杀菌剂、除草剂、杀虫剂和杀螨剂、植物生长调节剂、生物刺激剂和杀真菌剂等。这些附加组分可以单独使用或以任何组合使用。

在一些情况下，本发明的生物防控组合物还包括虫生病原真菌的芽生孢子和一种或多种杀菌剂，所述杀菌剂可以包括：克菌丹、秋兰姆、福美锌、代森锌、代森锰、代森锰锌、丙森锌、代森福美锌、百菌清、五氯硝基苯、敌菌丹、异菌脲、腐霉利、氟氯菌核利、灭锈胺、氟酰胺、戊菌隆、氧化萎锈灵、乙磷铝、霜霉威、三唑酮、三唑醇、丙环唑、苄氯三唑醇、联苯三唑醇、己唑醇、腈菌唑、氟硅唑、乙环唑、三氟苯唑、粉唑醇、戊菌唑、烯唑醇、环唑醇、氯苯嘧啶醇、氟菌唑、咪鲜胺、抑霉唑、稻瘟酯、十三吗啉、丁苯吗啉、嗪氨灵、丁硫啶、啶斑肟、敌菌灵、多抗霉素、甲霜灵、恶霜灵、呋霉灵、稻痕灵、稀丙苯噻唑、吡咯尼群、灭稻瘟菌素S、春雷霉素、井冈霉素、硫酸双氢链霉素、苯菌灵、多菌灵、甲基硫菌灵、恶霉灵、碱式氯化铜、碱式硫酸铜、薯瘟锡、三苯基氢氧化锡、乙霉威、灭螨猛、乐杀螨、卵磷脂、碳酸氢钠、二噻农、敌螨普、敌磺钠、哒菌清、双胍盐、多果定、IBP、敌瘟磷、嘧菌胺、嘧菌腙、水杨菌胺、磺菌威、氟啶胺、艾拓喹(ethoquinolac)、烯酰吗啉、叶绿醌、叶枯酞、苯酞、叶枯净、噻菌灵、三环唑、乙烯菌核利、霜脲氰、库布坦(cyclobutanyl)、双胍盐、霜霉威盐酸盐、恶喹酸、环氟菌胺、双胍辛烷乙酸盐、醚菌酯、三嗪、环酰菌胺、氰霜唑、嘧菌环胺、丙硫菌唑、腈苯唑、肟菌酯、嘧菌酯、己唑醇、亚胺唑、戊唑醇、苯醚甲环唑和环丙酰菌胺等。本领域技术人员将认识到，这不是穷尽的列表，并且可以利用任何农学上或园艺上可接受的杀菌剂。

在一些情况下，本发明的生物防控组合物包含虫生病原真菌的芽生孢子和一种或多种除草剂，所述除草剂包括但不限于：2,4-D、MCPA、稗草胺、麦草畏、绿麦隆、敌草隆、利谷隆、异恶隆、非草隆、草不隆、西玛津、莠去津、西草净、扑草净、环嗪酮、扑灭津、敌草净、特丁通、敌稗、溴苯腈、碘苯腈、哒草特、氯草敏、苯达松、甲氧除草醚、甲羧除草醚、三氟羧草醚钠盐、丙炔氟草胺、噻二嗪、恶草酮、磺酰唑草酮、环戊恶草酮、双唑草腈、吡唑特、苄草唑、吡草酮、甲基磺草酮、异恶唑草酮、异恶氯草酮、杀草强、苯草醚、吡氟酰草胺、双环磺草酮、禾草灵、吡氟禾草灵、禾草灭、烯草酮、稀禾定、肟草酮、吡喃草酮、苄嘧磺隆、吡嘧磺隆、玉嘧磺隆、唑吡嘧磺隆、氟磺隆、氟唑嘧磺草胺、双氯磺草胺、磺草唑胺(metosulfam)、灭草烟、灭草喹、嘧草硫醚、双草醚、嘧草醚、氟唑磺隆、丙苯磺隆、草甘膦、草甘膦铵盐、草铵膦、氟乐灵、二甲戊乐灵、氟草胺、氨基丙氟灵、苯胺灵、氟硫草定、甲草胺、异丙甲草胺、烯草胺、乙草胺、毒草胺、二甲噻草胺、草乃敌、敌草胺、苯噻酰草胺、四唑酰草胺、草达灭、哌草丹、草灭特、戊草丹、禾草丹、硫脲安、地散磷、茅草枯、磺草灵、DNOC、地乐酚、氟胺草唑、三嗪氟草胺、快杀稗、环庚草醚、棉隆、杀草隆、乙氧苯草胺、恶嗪草酮和稗草畏等。本领域技术人员将认识到，这不是穷尽的列表，并且可以利用任何农学上或园艺上可接受的除草剂。

在一些情况下，本发明的生物防控组合物包括虫生病原真菌的芽生孢子和一种或多种植物生长调节剂，所述植物生长调节剂包括赤霉素(例如赤霉素A3、赤霉素A4和赤霉素A7)、IAA和NAA等。本领域技术人员将认识到，这不是穷尽的列表，并且可以利用任何农学上或园艺上可接受的植物生长调节剂。

在一些情况下，本发明的生物防控组合物包括虫生病原真菌的芽生孢子和一种或多种化学杀虫剂。本领域技术人员能够选择一种或多种化学杀虫剂来适当地防控一种或多种昆虫类害虫物种。这种化学杀虫剂可以包括以下：乙酰胆碱酯酶抑制剂(氨基甲酸酯、有机磷酸酯)、GABA-门控氯离子通道阻断剂(环二烯有机氯，苯基吡唑)、钠通道调节剂(拟除虫菊酯，除虫菊酯)、烟碱乙酰胆碱受体竞争性调节剂(新烟碱、尼古丁、氟啶虫胺腈、丁稀酸内脂)、烟碱乙酰胆碱受体别构调节剂(多杀菌素)、谷氨酸门控氯离子通道别构调节剂、保幼激素模拟物(激素类似物、苯氧威、吡丙醚)、非特异性(多位点)抑制剂(烷基卤化物、氯化苦、硫酰氟、硼酸盐、吐酒石、异硫氰酸甲酯发生器)、弦音器官调节剂(吡蚜酮、氟啶虫酰胺)、螨生长抑制剂(四螨嗪、氟螨嗪、噻螨酮、乙螨唑)、线粒体ATP合成酶抑制剂(丁醚脲、有机锡杀螨剂、克螨特、四氯杀螨砜)、氯化物通道激活剂(阿维菌素、米尔倍霉素)、质子梯度干扰物/氧化磷酸化解偶联剂(溴虫腈、DNOC、氟虫胺)、烟碱乙酰胆碱受体通道阻断剂(沙蚕毒素类似物)、几丁质生物合成抑制剂(苯甲酰脲、布比芬嗪)、蜕皮干扰物(灭蝇胺)、蜕皮激素受体激动剂(二酰基肼)、章鱼胺受体激动剂(氨喋呤)、电子传递抑制剂(氟蚁腙、灭螨醌、嘧螨酯、METI杀螨剂、鱼藤酮、膦、氰化物、β-酮腈衍生物、羧酰苯胺)、电压依赖性钠通道阻滞剂(茚虫威，氰氟虫腙)、乙酰CoA羧化酶抑制剂(季酮酸和特特拉姆酸衍生物)、利阿诺定受体调节剂(二酰胺类)和不确定作用模式的化合物(印楝素、苯螨特、联苯肼酯、溴螨酯、灭螨猛、冰晶石、三氯杀螨醇、三氟甲吡醚、吡氟喹虫唑、硫磺、石硫合剂)。本领域技术人员将认识到，这不是穷尽的列表，并且可以利用任何农学上或园艺上可接受的杀虫剂。

在另外的其它实施方式中，本发明的生物防控组合物包含虫生病原真菌的芽生孢子和一种或多种杀真菌剂，例如：代森锰锌、三环唑、多菌灵、己唑醇、甲霜灵、苯菌灵、苯醚甲环唑、丙环唑、稻瘟净、戊唑醇、王铜、氢氧化铜、三孢霉素、丙森锌、沙芬(safin)、孢子(sporrin)、胚素和生物硫酸(bio-vitrioll)等。通常，使用的杀真菌剂对组合物的真菌芽生孢子没有活性或者几乎没有活性。本领域技术人员将认识到，这不是穷尽的列表，并且可以利用任何农学上或园艺上可接受的植物生长调节剂。

用作昆虫防控剂的生物防控组合物制品可以从已经从例如上文所述的培养基中收获的芽生孢子来制备。实际上，可以设想这样的制品可以直接从培养物中制备，从而避免了任何纯化步骤的需要。尽管可以直接使用液体培养物，但是在优选的实施方式中，如上文所述，使用本领域中的常规技术，从培养物中将水除去至部分干燥或基本干燥，并将干燥的培养物破碎或研磨成适合由常规施粒机具应用的小颗粒。可以通过空气干燥(例如将收集的芽生孢子与干燥剂例如硅藻土混合)或喷雾干燥进行干燥。

为了促进应用和随后的真菌生长，收获的芽生孢子可以替代地配制在合适的农学上可接受的营养的或惰性的载体或载剂中，以用作可湿性粉末、粉尘、颗粒剂、钓饵(bait)、溶液、可乳化的浓缩物、乳液、悬浮浓缩物和喷雾剂(气溶胶)。例如，对于液体应用，生物防控组合物可以被配制为悬浮液或乳液。在这样的实施方式中，优选的载体包括但不限于水、缓冲液或菜油或植物油。在一个特别适用于固体颗粒应用的替代的优选实施方式中，生物防控组合物可以用固体惰性载体或稀释剂来配制，所述固体惰性载体或稀释剂例如硅藻土、滑石、粘土、蛭石、CaCO₃、玉米芯砂粒、藻酸盐凝胶，淀粉基质或合成聚合物，或者它们可以被包含到传统的控释微粒或微胶囊中。本领域技术人员将认识到，真菌还可以与常规添加剂例如粘着剂或粘附剂、乳化剂、表面活性剂、泡沫材料、保湿剂或润湿剂、抗氧化剂、UV保护剂、营养添加剂、肥料、杀虫剂组合配制，或甚至与对对象真菌显示出低毒性的杀真菌剂组合配制。为了应用于植物和树的树皮或树冠上，生物防控组合物也可以与吸湿或亲水的佐剂一起配制。

与未处理的对照相比，可以选择芽生孢子的绝对量及其在最终组合物中的浓度以有效地减少目标昆虫的群体。实际用量不是关键的，并且是受实际考虑因素(例如载剂或载体的性质、目标昆虫群体的密度，应用的方法和地点)的影响，并且可以通过常规测试容易地确定。由于本发明的芽生孢子用于产生和递送高浓度的感染性营养真菌细胞以通过感染和死亡来防控目标昆虫，出于配制和应用的目的，“有效量”被定义为足以随后在目标栖息地中产生足够的细胞以相对于未处理的对照感染和杀死目标昆虫的任何数量的芽生孢子。作为实例但不限于此，可以设想，合适的制品通常将含有从液体培养物回收的每克生物质中约1×10⁶个或更高的芽生孢子(基于生物质的干重)，优选地为每克生物质中至少1.5×10⁷个芽生孢子。对于典型的中耕作物的应用，但不限于此，可以设想，合适的施用率是每公顷至少1×10⁷个芽生孢子。在其它实施方式中，施用率可以是每公顷至少1×10⁶、5×10⁶、1×10⁷、5×10⁷、1×10⁸、5×10⁸、1×10⁹、5×10⁹、1×10¹⁰、5×10¹⁰、1×10¹¹、5×10¹¹、1×10¹²、5×10¹²、1×10¹³、5×10¹³、1×10¹⁴、5×10¹⁴、1×10¹⁵、5×10¹⁵、1×10¹⁶、5×10¹⁶个或更多的芽生孢子。

在使用中，可以使用常规技术将本发明的生物防控组合物施用于目标昆虫的位置或附近或待保护的植物的表面上(例如施用于树皮上)或者作为种子包衣。在一个优选的实施方式中，将芽生孢子以颗粒形式施用于土壤或无土壤灌封混合物，例如在温室中使用，并且以可喷雾悬浮液形式施用于地上植物表面。根据目标昆虫类害虫，芽生孢子可以被施用在农田、果园、温室、花园或草坪中，或者施用于观赏植物、树木或商业或住宅结构体上或其附近。生物防控组合物可以施用于土壤、无土壤灌封混合物、植物表面或其组合。

已经一般性地描述了本发明，下面是说明本发明的产生和功效的实施例。实施例和上文的一般性描述都不应被解释为限制本发明的范围。

实施例

真菌和接种物制备

在本研究中测试了B.bassiana的五个分离株和I.fumosorosea的五个分离株。大部分真菌分离株源自巴西(Brazil)，详细情况见表1。I.fumosorosea的分离株ARSEF 3581和B.bassiana的GHA(ARSEF 6444)目前被指定为称为(Laverlam,Butte,MT,USA)的商业生物杀虫剂的活性成分，作为液体培养物研究的美国标准。先前使用基于结构域基因测序的分子技术识别了巴西真菌分离株。这些真菌的储备培养物在马铃薯葡萄糖琼脂([PDA]Detroit,MI,USA)上在培养皿中在22±2℃下采用12:12小时(L:D)光周期生长2-3周直到孢子形成，切成1毫米²琼脂塞，并在-80℃下在无菌冷冻管中储存在10％甘油中。为了产生分生孢子接种物，使用冷冻的储备培养物接种PDA平板，并孵育2-3周，直到培养物在平板上形成孢子。

表1.B.bassiana和I.fumosorosea分离株

培养基和培养条件

用于预培养物和芽生孢子产生的液体培养基包含以下基础盐(每升)：KH₂PO₄，2.0g；CaCl₂·2H₂O，0.4g；MgSO₄·7H₂O，0.3g；CoCl₂·6H₂O，37mg；FeSO₄·7H₂O，50mg；MnSO₄·H₂O，16mg；ZnSO₄·7H₂O，14mg；硫胺素、核黄素、泛酸盐、烟酸、吡哆胺、硫辛酸，各500mg；叶酸、生物素、维生素B12，各50mg。除另有说明外，所使用的所有化学品均得自Sigma(St.Louis，MO，USA)。用80g/L(40％碳)的葡萄糖(Fisher)和25g/L(8.5％N和53％C)的酸性水解酪蛋白(从牛奶中获得，Hy-case^TM MSF，Kerry Bioscience，New York，NY，USA)补充预培养物基础盐培养基，其产生碳氮比(C:N)为23:1的培养基。预培养基的初始pH为5.8，培养物生长期间pH未调整。在接种前，单独将葡萄糖储备溶液(20％w/v)高压灭菌并加入。液体培养物和葡萄糖储备溶液的灭菌在123℃下进行20分钟。所有培养基均用蒸馏去离子水(ddH₂O)制备。通过用10mL的0.04％聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯(吐温80，Sigma)的无菌水溶液刮板来收获用于预培养物的分生孢子接种物。用分生孢子悬浮液接种预培养物，以在液体培养基中提供最终浓度为5×10⁵个分生孢子体/mL的I.fumosorosea和1×10⁶个分生孢子/mL的B.bassiana。使用旋转振荡器培养箱(INNOVA 4000,NewBrunswick Scientific,Edison,NJ)，使所有真菌的100mL预培养物在28℃和350rpm下在250mL带挡板的锥形瓶(BellcoGlass，Vineland，NJ，USA)中生长3天。使用具有DIC光学的光学显微镜(BH2，Olympus America，Center Valley，PA，USA)，使用血细胞计数器(400×放大倍率)显微测量分生孢子和芽生孢子浓度。

液体发酵研究的实验设计

为了测试用于进一步实验的最佳营养组分，测试了几种氮源，研究它们诱导芽生孢子产生和耐干燥性的能力。测试的氮源为3％酸水解酪蛋白、棉籽粉、大豆油、自溶酵母、玉米浆、L-谷氨酸和1％硝酸铵[NH₄NO₃]。所有培养基含有12％葡萄糖。将50mL培养物在28℃和350rpm下在250mL带挡板的锥形瓶中生长3天。用硅藻土(7.5％w/v)从培养肉汤中分离芽生孢子，然后空气干燥至<4％的水分。通过测量在马铃薯葡萄糖肉汤中再水合并在28℃和300rpm下孵育7小时的经空气干燥的芽生孢子的发芽来评估芽生孢子耐干燥性。

采用因子实验设计来研究氮源对在浸没的液体培养物中生长的不同B.bassiana和I.fumosorosea分离株的影响。在旋转摇床培养箱中在28℃和350rpm下，使100mL体积的Isaria和Beauveria培养物在250mL锥形瓶中生长并孵育。所述芽生孢子产生培养基含有前文描述的补充有葡萄糖(100g/L)和浓度为25g/L的酸水解酪蛋白或棉籽粉(9.4％N和40％C；Traders Protein，Memphis，TN，USA)的基础盐培养基。培养基的初始pH为5.5，C:N比为21:1。从3日龄的预培养物(指数期)获得芽生孢子接种物，提供5×10⁶个芽生孢子/mL的最终接种物浓度。烧瓶在发酵过程中经常手动摇动，以使烧瓶壁上的菌丝生长和孢子形成最小化。在所有实验中，在培养物生长期间未控制pH。

在培养肉汤取样和稀释期间，不断涡旋震荡芽生孢子悬浮液以确保均匀性。使用干重作为生物质积累的量度。从烧瓶中收集重复的1-mL培养肉汤样品，通过真空过滤(型号1225，)从废培养基中分离生物质到预先称重的2.4cm玻璃纤维滤盘(G6，FisherPittsburgh，PA，USA)上，然后在测量前在80℃下干燥24小时直到重量恒定。在发酵过程结束时，使用葡萄糖计(CESCO，Atlanta，GA，USA)测量剩余的葡萄糖(g/L)以作为测定真菌葡萄糖利用率的手段。另外，记录所有培养肉汤的最终pH。重复进行所有摇瓶培养实验，并且在不同的日期重复实验至少三次。

我们还试图确定其它培养条件对芽生孢子产生、耐干燥性、储存和虫生病原性能的影响。测试的参数包括渗透压和增加的曝气量。为了测试渗透压变化的影响，将培养物在含有2.5％棉籽粉的基础盐培养基中在28℃和350rpm下在250mL带挡板的锥形烧瓶中培养。测试从20g/L至200g/L的葡萄糖浓度，葡萄糖(10％)用2％、4％或6％聚乙二醇(PEG 200)和无毒盐NaCl和KCl修饰，均为0.25mol/L(分别为14.32g/L和18.64g/L)。

为了测试不同曝气量的效果，分析在补充有2.5％棉籽粉(A)或酸性水解酪蛋白(B)和10％葡萄糖的基础盐培养基中生长的B.bassiana的各种分离株的液体培养物产生的芽生孢子。在28℃和175rpm或350rpm下，使50和100mL培养物在振荡器培养箱中的250mL带挡板的锥形瓶中生长。改变培养体积以增加(50mL)或减少(100mL)曝气。将三日龄的芽生孢子悬浮液与硅藻土混合，过滤以除去废培养基，并空气干燥至<4％的水分。通过评估在鼓泡培养箱中在28℃和300rpm下在马铃薯葡萄糖肉汤中将经空气干燥的芽生孢子再水合并孵育7小时后的发芽，来测量芽生孢子存活力。

收获、干燥和储存研究

在B.bassiana和I.fumosorosea生长3天后，将整个培养物与7.5％(w/v)硅藻土[DE(Celite Corp.，Lompoc，CA，USA)]混合。使用具有12.5cm滤纸盘(Whatman#1，Maidstone，England)的布氏漏斗对芽生孢子-DE混合物进行真空过滤。将来自每个重复烧瓶的所得滤饼粉碎，置于10cm培养皿上，并在具有侧向空气流入(RH～50-60％)的空气干燥室中在～22℃下空气干燥过夜16-20h至小于4％的水分。通过在搅拌器(MiniPlus,Cuisinart,EastWindsor,NJ,USA)中脉冲震动来将经干燥的芽生孢子制品破碎，在尼龙聚乙烯袋(15.3×21.8厘米)中真空包装(Multivac Inc.，Kansas City，MO，USA)，并在4℃下储存。在储存之前，分别使用水分分析仪(Mark II，Denver Instruments，Arvada，CO，USA)和水活度分析仪(AquaLab 4TEV,Decagon Devices,Inc.,Pullman,WA,USA)测量这些制品的水分含量(基于湿分[w.b.])和水活度(a_w)，并且水分含量和水活度被认为是潜在的协变量。

从不同的发酵批次获得每个真菌分离株的至少4个包装并随时间监测，以评估空气干燥的芽生孢子的存活。在干燥后和储存期间使用先前描述的发芽试验立即测定所有空气干燥的芽生孢子制品的活力。简言之，通过在125mL带挡板的锥形瓶中将～25mg空气干燥的芽生孢子制品加入到25mL马铃薯葡萄糖肉汤[PD]中，来进行发芽试验。在旋转振荡器培养箱中，在28℃和300rpm下孵育6小时I.fumosorosea和孵育7小时B.bassiana后，通过检查每个重复瓶中200个离散的芽生孢子的发芽管形成，来显微确定百分比活力。发芽没有在团块上进行评估，而是在芽生孢子离散的地方进行评估，并且当发芽管长度至少是芽生孢子直径的一半时被认为是发芽的。在储存于冷藏条件(4℃)下的样品上进行稳定性研究，并使用上述发芽方案在13个月内每月监测芽生孢子活力。

为了确定a_w和水分含量之间的关系，建立了用7.5％DE(w/v)配制的B.bassiana和I.fumosorosea的吸附等温线。使用以下盐制备不同的饱和盐溶液以产生不同的平衡相对湿度(ERH)：氢氧化钠(NaOH)、氯化锂(LiCl)、氯化镁(MgCl₂·6H₂O)、碳酸钾(K₂CO₃)、氯化钠(NaCl)、氯化钾(KCl)和硫酸钾(K₂SO₄)，分别对应于0.082、0.113、0.33、0.432、0.753、0.843和0.973的a_w值。所有盐均购自为了实现非常低的ERH，使用(无水硫酸钙，8目，W.A.Hammond Drierite Company，Xenia，OH，USA)作为标准干燥剂，并提供0.0221a_w。将盐溶液加入到真空干燥器(206mm高×149mm内径)(Bel-ArtWayne，NJ，USA)的底部，并将样品在25℃下孵育7天，然后读数。

昆虫

B.tabaci生物型B的菌落最初从2013年的Apopka,FL,USA获得，并且在白菜cv上培养。“Bravo”(Brassica oleracea L.；Harris Seeds，Rochester，NY，USA)和蓝色湖矮灌木豆(Phaseolus vulgaris L.[Kelly Seed Co.，Peoria，IL，USA])，在温室条件(温度范围：24-30℃)下将植物限制在用细丝织物(灰白色雪茄材料，BioQuip Products Inc.，RanchoDominguez，CA，USA)覆盖的0.6m³PVC框架笼子中。所有的植物都在用含有77.5L巴氏灭菌的Redi生长混合物(Sun Gro Horticulture Canada Ltd.,Vancouver,Canada)制备的土壤灌注培养基中生长，该培养基用60g锰矿粉(micromax)颗粒和400g奥妙肥(osmocote)14-14-14修饰。使用未处理的种子，植物在不含化学农药的情况下生长。

真菌孢子对粉虱的毒性

为了比较B.bassiana和I.fumosorosea的芽生孢子和气生分生孢子之间的毒性，如先前的研究中所述，对新出现的第二龄B.tabaci生物型B幼虫进行昆虫生物测定。实验室生物测定用B.bassiana(B.ALB1432)和I.fumosorosea(CG1228)进行。如上所述，在含有10％葡萄糖和2.5％棉籽粉的液体培养基中产生芽生孢子，并在28℃和350rpm下孵育3天后收获。用7.5％DE配制芽生孢子制品(尺寸范围3-11μm)，并空气干燥至<4％的水分，而气生分生孢子(尺寸范围1.8-5.0μm)在PDA平板上在22℃和12:12(L:D)h光周期下生长10-14天，然后用于生物测定。用Tween 80的0.01％溶液制备两种孢子的原始悬浮液，并通过无菌双层干酪布进行过滤。通过以1×10⁵、5×10⁵、2.5×10⁶、1.25×10⁷和6.25×10⁷个孢子/mL使用吐温80(0.01％)连续稀释法调节所需浓度，这反过来分别对应于1.26×10²、6.82×10²、3.7×10³、2.0×10⁴和1.09×10⁵个孢子/cm^-2的沉积速率(剂量)。对照组由用0.01％吐温80溶液喷洒的幼虫组成。在所有生物测定中，在PD肉汤中孵育6小时(对于I.fumosorosea)和7小时(对于B.bassiana)后，使用的芽生孢子的活力>75％，而在25℃下在PDA上孵育17小时后，气生分生孢子保留>90％的活力。

将单独的豆叶放在用20mL水琼脂(2％，w/v)排列的聚苯乙烯培养皿(100×15mm)中，以下称为“通风板”。将用50-70个早第二龄幼虫侵染的每个豆叶用设定为10PSI和3秒的微型喷雾塔喷雾。每个真菌浓度有五次重复样本，并且同时测定所有浓度。使用不同的真菌批次和昆虫队列，在不同的日期重复整个实验至少两次。处理后，将通风板倒置，使得叶片的背面朝下，近轴侧接触琼脂，然后在生长室中在27±1℃、70％(48-78％)RH和14:10(L:D)h光周期下孵育六天，然后评估死亡率。在应用后6天，对仅显示真菌病(即真菌病)感染或症状迹象的幼虫的死亡个体进行评分，以估计中位致死浓度(LC₅₀)，以孢子cm^-2表示。为了比较芽生孢子和气生分生孢子之间的杀死速度，使用前面提到的相同方案，但浓度为1.25×10⁷个孢子/mL(即2.7×10⁴个孢子/cm^-2)，并且在处理6天后每24小时记录死亡率。

我们还决定比较在具有低渗透压和高渗透压的培养基中产生的芽生孢子的杀死速度和致死剂量以确定任何效果。在2.5％棉籽粉和4％、10％或14％的葡萄糖的液体培养基中生产B.bassiana的芽生孢子(ESALQ1432)。生长3天后，如上所述分离出芽生孢子。用硅藻土从培养肉汤中分离芽生孢子，并空气干燥。粉虱幼虫(B.tabaci生物型B)的暴露如上所述。

统计分析

用完全随机化的设计进行实验并重复两到三次以确保重现性。使用广义线性混合模型(GLMM)，采用SAS macro PROC GLIMMIX从发酵研究中用高斯(正态)分布拟合生物质积累上的数据并具有泊松分布拟合芽生孢子数量上的数据。真菌分离株、氮源和发酵日(时间)作为固定因素实施，而摇瓶(即随时间重复测量)和实验重复在这些模型中被宣称为随机效应。将从耐干燥性测定获得的的芽生孢子活力的比例数据拟合到具有二项分布误差的GLMM，其中实验重复包括在随机项中，而真菌分离株和氮源构成固定因子。固定效应的统计数据及其相互作用项也由Wald III型F检验确定。一旦检测到显著性，以P≤0.05使用Tukey's检验进行事后对数多重比较，用于固定效应及其相互作用项。将4℃储存的芽生孢子存活(％发芽)的时间序列数据适拟合到回归的4-参数非线性模型，以评估用不同氮源产生的空气干燥胚芽孢子的半衰期(t_1/2)。该模型具有以下符号：S＝S0+(α/(1+(t/t0)β))，其中S是芽生孢子存活(％发芽)，t是储存时间(以月计)并且α、β(斜率)、S0和t0是通过在SASmacro PROC NLIN中执行的交互式分析来估计得到的最佳拟合常数。为了测试氮源可以影响空气干燥的芽生孢子在孵化时间上的贮存稳定性的假设，采用平方和减少(sum-of-squares reduction)测试来比较其非线性回归。通过将实验结果与GAB(Guggenheim-Anderson-de Boer)模型拟合以绘制吸湿等温线曲线，解释了空气干燥的DE配制的芽生孢子的a_w与水分含量之间的关系。我们还测试了基于Spearman相关性(PROC CORR)的a_w或水分含量是否与芽生孢子活力数据有任何关系。在通过回归模型(PROC PROBIT)估计不同真菌孢子和第二龄幼虫之间的剂量-反应死亡率关系之前，应用Abbott’s公式来纠正百分比死亡率。选择回归模型是因为它的最低偏差提供了最佳的拟合。对于每个孢子类型，连续计算其斜率和相应的置信限(95％CL)的中位致死浓度(LC₅₀)。通过以α＝5％应用于LC₅₀的成对比试验来比较孢子型的毒性。使用前文的回归模型分析芽生孢子和气生分生孢子之间杀死速度(中位致死时间，LT₅₀)之间的差异，以通过在P≤0.05下t-Student检验中用成对比较进行处理来绘制累积存活函数。所有分析均在统计分析系统v.9.2(Statistical AnalysisSystem v.9.2,SAS Institute Inc.,Cary,NC)中进行。

实验结果

芽生孢子产量和生物质积累

当在补充有不同氮源的液体培养基中培养时，真菌分离株在丝状生长方面的反应显著不同(图1-显示两种B.bassiana分离株的结果)。一般来说，结果表明，当氮源为棉籽粉、大豆粉、自溶酵母或酸水解酪蛋白(AHC)时，B.bassiana分离株以酵母样形式生长，具有改善的芽生孢子产量。此外，大多数氮源导致足够水平的耐干燥性。对于I.fumosorosea获得了类似的结果(数据未显示)。在这些氮源中选择其中两种氮源(AHC和棉籽粉)作为进一步实验的氮源。

如上所述生长补充有AHC或棉籽粉的25g/L的液体培养物，并分析它们的生长参数。基于日常观察，无论何种氮源，对于B.bassiana和I.fumosorosea的所有分离株来说，生长的第2天至第3天的芽生孢子产量以及生物质积累均显著增加(表2、3-小写字母是指每个发酵日(列)内的真菌分离株和氮源之间的比较，而大写字母是指每个分离株的发酵日(行)之间的比较)。

表2.B.bassiana菌株的液体培养物生产力

表3.I.fumosorosea菌株的液体培养物生产力

随着时间的推移，B.bassiana的分离株表现出不同的测量为芽生孢子浓度的生长速率，因为分离株和发酵日之间的相互作用项是显著的(F4,105＝5.97，P＝0.0002)，而对于I.fumosorosea分离株来说，随着时间的推移，芽生孢子产量以相同的速率增加(F4,62＝2.28，P＝0.0708)。尽管通过将第3天与第2天进行比较，一些分离株没有显著增加地产生更多的芽生孢子，但对于B.bassiana(F1,105＝71.89，P＝0.0001)和I.fumosorosea(F1,62＝53.29，P<0.0001)二者来说，第3天生长通常达到更高数量的芽生孢子数目。真菌分离株和氮源相互作用对I.fumosorosea芽生孢子产量有强烈的影响(F4,62＝5.53，P＝0.0007)，但仅对B.bassiana(F4,105＝2.42，P＝0.0531)产生杂散效应。对于B.bassiana来说，氮源本身对芽生孢子产生的影响更为显著(F1,105＝16.97，P<0.0001)，B.bassiana分离株在用棉籽粉生长时达到较高的浓度，除了不响应的分离株ESALQ-PL63外。观察到当使用酸水解酪蛋白而不是棉籽粉培养时，产生较高的芽生孢子数目的I.fumosorosea的分离株ESALQ1364和ARSERF3581的结果相反(F1,62＝13.61，P＝0.0005)，而其它分离株对氮源不会产生不同的反应。在各Isaria分离株中进行比较表明，无论用何种氮源(F4,62＝37.04，P<0.0001)，CG1228在第3天达到了最高的芽生孢子浓度(2.6-2.8×10⁹个芽生孢子/mL)。在相同的发酵条件下，B.bassiana的最好的生产芽生孢子的分离株是在含有棉籽而不是酸水解酪蛋白的液体培养基中生长的CG1229、GHA和ESALQ1432，在3天的生长中达到0.9-1.2×10⁹个芽生孢子/mL的产量(F4,105＝21.2，P<0.0001)。有趣的是注意到，I.fumosorosea的所有分离株在第3天能够产生超过1×10⁹个芽生孢子/mL，而只有2/5的B.bassiana分离株达到这么高的孢子浓度。此外，与B.bassiana分离株相比，I.fumosorosea分离株表现出更快的丝状生长。在测试的所有真菌分离株中，ESALQ-PL63通过更多的菌丝生长显示出最差的酵母样生长，这导致厚实粘稠的培养肉汤。

对于每个氮源来说，分别检查了生物质积累数据，因为与酸水解酪蛋白(0.07±0.01mg/mL)相比，用棉籽粉修饰的培养基包含事先较高的固体含量(15.54±0.08mg/mL)，使得难于比较。不论何种氮源，干燥生物质在I.fumosorosea分离株中没有变化(F4,62＝1.81，P＝0.1383)，尽管这些分离株中大多数随时间的推移而增加生物质(F1,62＝20.43，P<0.0001)(表2、3)。当在用酸水解酪蛋白补充的培养基中生长B.bassiana分离株时，培养物干重随着时间的推移相对于棉籽粉显著增加(F4,105＝7.77，P<0.0001)。在第3天，B.assiana和I.fumosorosea都积累了较多的干重(F1,105＝43.77，P<0.0001；F1,62＝583.36，P<0.0001)。除了氮源外，在所有分离株中，B.bassiana的ESALQ1432显示出最高的生物质(F4,105＝15.04，P<0.0001)。最后，在发酵后B.bassiana和I.fumosorosea培养物的最终pH值提高了酸度，分别类似于pH值范围3.8-4.8和3.6-4.9。芽生孢子产生和耐干燥性随着氮源浓度的增加而增加，可能在较高水平下稳定(图2)。

耐干燥性

将3天龄的芽生孢子干燥至<4％的水分含量(a_w<0.3)，显示出氮源和真菌分离株对I.fumosorosea(F4,29＝4.90，P＝0.0038)和B.bassiana(F4,56＝5.26，P＝0.0011)的芽生孢子活力存在显著的相互作用。通过测量在马铃薯葡萄糖肉汤(PD)中再水合并在28℃和300rpm下分别孵育B.bassiana和I.fumosorosea 7小时和6小时的空气干燥的芽生孢子的发芽，来评估耐干燥性。当检测B.bassiana中的活力时，分离株ESALQ1432和ESALQ447的芽生孢子具有更强的耐干性，当用棉籽粉生产时比用酸水解酪蛋白(F1,56＝14.06，P＝0.0004)生产时具有更大的孢子活力(71-79％)(表4-非对应的字母表示统计差异，其中小写字母是指每个氮源(列)内的分离株之间的比较，而大写字母是指每个分离株的氮源(行)之间的比较。

表4.B.bassiana和I.fumosorosea芽生孢子中的耐干燥性

相比之下，当在含有酸水解酪蛋白而不是棉籽粉的培养基中培养时，I.fumosorosea分离株显示出更好的耐干燥性，具有更大的孢子活力(F1,29＝8.37，P＝0.0072)，预期分离株ESALQ1409和ARSEF3581。空气干燥后的芽生孢子存活在整个B.bassiana(F4,56＝16.5，P<0.0001)和I.fumosorosea(F4,29＝12.96，P<0.0001)内的分离株之间显著变化。B.bassiana内的分析表明，两种氮源在空气干燥后支持较高的初始活力率(70-86％)，而I.fumosorosea分离株获得62-82％的芽生孢子初始存活率。

空气干燥后，在25℃下测定吸湿等温线，以描述用7.5％DE配制的真菌生物质(芽生孢子+菌丝体)的a_w与水分含量(％，基于湿重)之间的关系。实验数据主要通过假设反曲形状曲线(图3)的GAB模型(B.bassiana：R2＝0.99，F3,28＝3666.55，P<0.0001；I.fumosorosea：R2＝1.00，F3,21＝2738.01，P<0.0001)来解释。B.bassiana分离株的空气干燥芽生孢子的水活度(a_w)范围为0.251-0.364，相应水分含量为1.38-2.70％，而I.fumosorosea分离株的水活度(a_w)从0.270-0.323变化，相应水分含量为1.76-2.63％。水活度和水分含量与真菌物种干燥后的初始芽生孢子存活率都不相关(Spearman相关：-0.02≤r≤0.30，0.06≤P≤0.86)。在本文所描述的条件下生长的B.bassiana的芽生孢子在喷雾干燥(与脱脂奶粉(SMP)或SMP+2.5％抗坏血酸混合)和空气干燥(与硅藻土混合)都良好地存活。这些结果报告在表5中，无论何种配方或干燥过程，都没有显著差异。耐干燥性被测定为在28℃和300rpm下孵育7小时后在PD肉汤中再水合后发芽的芽生孢子百分比。

表5.空气干燥和喷雾干燥B.bassiana芽生孢子

储存

在冷藏条件下空气干燥芽生孢子的长期贮存稳定性随真菌分离株和氮源而变化(图4、5)。对于用氮源生产的B.bassiana和I.fumosorosea的所有分离株来说，具有四个参数的回归模型良好地拟合(R2＝0.74-0.99，P<0.01)在整个储存时间上芽生孢子存活的实验数据。根据用于比较芽生孢子存活曲线的非线性回归的平方和减少测试，发现在13个月时间的冷却存储上，氮源不影响B.bassiana的空气干燥芽生孢子的存活率，除了分离株CG1229和GHA外，分离株CG1229和GHA分别在用棉籽粉和酸水解酪蛋白生产时，其存活显著更长的时间(图4)。特别是对于I.fumosorosea，分离株ARSEF3581、ESALQ1296和ESALQ1364的芽生孢子在棉籽粉中生长时保持较高的活力较长一段时间，而其它分离株的长期活力不受氮源的影响(图5)。一般来说，不管何种氮源，I.fumosorosea芽生孢子的存活曲线都显示出比B.bassiana更快的衰退模式。在4℃下储存的B.bassiana空气干燥芽生孢子的半衰期估计对于在棉籽粉中生长的GHA来说展现出最短14.1个月的时间，而大多数分离株的半衰期长于14个月(表5)。相比之下，I.fumosorosea空气干燥芽生孢子示出了在酸水解酪蛋白中生长的ESALQ1296的半衰期最短(9.2个月)。由I.fumosorosea实现的最长半衰期(13.1个月)是在棉籽粉中生长的ARSEF3581。在大多数情况下，棉籽粉支持较长的I.fumosorosea分离株的半衰期。

我们还测试了本发明的杀虫组合物的各种包装和储存方案，特别是测试在“高室温”(28℃)下有利于长期储存的储存条件。对于表6中所示的结果，半衰期计算为ln(2)/b。所有真空包装在999mbar压力下，从而在铝(麦拉)袋中提供≤0.021％的大气氧气。硅胶(SG)用作吸湿剂。ZM-1和ZPT-50分别用作除氧剂。RP-3A是一种组合除氧剂和除湿剂。

表6.在不同包装中高室温储存影响

为了进一步研究储存方法之间的差异，我们分析了不同的除氧和湿剂。

使用上述每种包装组合测量除氧和湿剂对于在28℃下储存的空气干燥的Beauveria bassiana芽生孢子的贮存稳定性的影响。结果如图6中所示(RP-3A＝“O₂+吸湿剂”；ZM-1＝“O₂A型吸收剂”；ZPT-50＝“O₂A型吸收剂”；硅胶＝“吸湿剂”)。存活性被报告为，相对于新鲜干燥的芽生孢子样品，剩余的有活力的孢子的百分比。在马铃薯葡萄糖肉汤中，在28℃和300rpm搅拌下孵育7小时后，以发芽管伸长率测定发芽。用SMP(含和不含抗坏血酸(ASA))喷雾干燥的B.bassiana芽生孢子的类似分析结果表明：向配方中加入ASA可提高喷雾干燥制品的存活率(图7)。

渗透压

我们的结果表明，增加的渗透压导致增加的芽生孢子产量，这不仅仅是由于葡萄糖对酵母样细胞的可用性增加(图8，表7–后面标有不同字母的平均值(±SE)表示显著不同。对于表7所列的渗透剂，葡萄糖、NaCl和KCl的所列浓度分别为200、14.32和18.64g/L。含有NaCl和KCl修饰的培养基包含100g葡萄糖(0.56M)作为碳源)。小写字母是指每个采样日(列)的菌株中的比较，而大写字母是指菌株内发酵日(行)的比较。在高渗透压(>0.5MPa)下产生的本发明的芽生孢子表现出较小的球形形态，与典型的生长培养基中产生的长圆形芽生孢子不同(图9)。芽生孢子的这种球形形状与目标害虫的较大感染力相关，并且代表了以前没有报道的独特的芽生孢子形式(见下文)。

表7.由渗透压增加诱导的芽生孢子产生增加

高曝气

尽管先前的研究已经表明，通过使用带挡板的烧瓶获得较高的曝气速率并且较高的搅拌为液体培养物提供更多的氧气，并且增强了I.fumosorosea的芽生孢子产量，反之亦然，但是存在相反教导，即没有增加孢子产生量B.bassiana高于200rpm(Pham et al.,Mycobiology 2009)。

初始结果表明，重要的是培养物的体积。当我们比较50mL培养物与100mL培养物(250mL挡板锥形瓶中的10％葡萄糖，基础盐培养基，2.5％棉籽粉，在28℃和350rpm下)时，我们注意到溶解氧水平在较小体积中较高(图10)。我们还测试了不同的搅拌速度，发现更高的速度增加了在50和100mL培养物中的芽生孢子产生(表8-对于每个菌株和每个采样日来说，后面标有不同字母的平均值是显著不同的(Tukey检验，P<0.05)。使用深槽发酵生产高产量的B.bassiana还支持提高溶解氧水平的要求(数据未显示)。

表8.较高曝气对芽生孢子产量的影响

结果表明，在具有适当浓度的氮源(15g/L)、碳源(≥60g/L)、大于0.5MPa的渗透压的高曝气条件(大部分发酵时溶解氧水平高于零)下生长的B.bassiana和I.fumosorosea(数据未显示)培养物实现了迅速产生大量的芽生孢子(图11)。在这些条件下使用廉价的培养基成分产生的芽生孢子为Beauveria芽生孢子提供了可行的生产和稳定工艺。为了最大限度地提高产量，以前使用液体培养发酵方法生产Beauveria芽生孢子的尝试需要较长的发酵时间(6-8天)，并且产生了在干燥和储存后存活性差的细胞。

对粉虱的功效

为了比较芽生孢子和气生分生孢子之间的毒力，我们生物测定了第二龄B.tabaci生物型B型幼虫。毒力测试显示，B.bassiana的芽生孢子需要小于气生分生孢子的1/4的孢子浓度来杀死50％的幼虫(表9)。对每个真菌浓度测试总共十(10)个重复，每个均包含五十(50)个粉虱幼虫。输送的中位致死浓度(LC₅₀)以繁殖体/cm²表示，并通过回归模型来估算。在施用后第六天审查累积死亡率。对照死亡率平均为3.7±1.3％。相对效力是每个真菌物种内的芽生孢子对气生分生孢子的相对功效的量度：(LC₅₀分生孢子/LC₅₀芽生孢子)。在每个真菌物种中进行比较，并且如果LC比的置信限不包含1，则得出LC值显著不同的结论。χ²和P值表示斜率≠0的概率，而不是对回归模型的拟合。

表9.B.bassiana芽生孢子比分生孢子对粉虱防控更有效

与先前对B.bassiana的观察一致，气生分生孢子的中位死亡时间(LT₅₀，杀死50％幼虫的时间)与对于芽生孢子计算的中位死亡时间相比显著更长(t＝9.88，P<0.0001)，导致通过芽生孢子的杀死速度显著增加(>37％更快)(表10)。每次处理中测试10只昆虫(2.0×10⁴孢子/cm²)，并用0.01％的吐温80溶液喷洒对照昆虫。6天后死亡率平均为11.5±1.6％。当与分生孢子相比时，I.fumosorosea的芽生孢子需要的孢子少70％，以诱发50％的死亡率以及更快的幼虫死亡(t＝2.52，P＝0.0215)。被两种类型的繁殖体感染的大多数蛹虫体支持真菌生长，并随后形成孢子。

表10.B.bassiana(ESALQ1423)芽生孢子杀死粉虱比分生孢子快

为了检查在高渗透压下生长的芽生孢子对粉虱幼虫的效果是否良好，在生长3天后，在具有固定量(2.5％)的棉籽粉和以4％、10％和14％的葡萄糖的液体培养基中产生B.bassiana(ESALQ1432)的芽生孢子。将芽生孢子用硅藻土从培养肉汤中分离并空气干燥，或者包封在脱脂乳基质(SMP)中并喷雾干燥。图12所示的结果表明，在高渗透压(10％和14％葡萄糖)下产生的较小的圆形细胞显示出增加的感染性并更快地杀死昆虫。

Claims (20)

1.一种生产组合物的方法，其中所述组合物包含Beauveria物种或Isaria物种的耐干燥芽生孢子，所述方法包括如下步骤：

a)用Beauveria物种或Isaria物种的真菌繁殖体接种包含碳源和氮源的液体培养基；

b)在提供高于零的溶解氧水平和大于0.5MPa的渗透压的培养条件下孵育所述繁殖体；

c)将所述繁殖体孵育足够的时间以产生芽生孢子；

d)收集所述芽生孢子；以及

e)将所述芽生孢子干燥，从而产生耐干燥芽生孢子。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述Beauveria物种是B.bassiana。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述Isaria物种是I.fumosorosea。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述碳源以至少4％的初始浓度存在于所述液体培养基中。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述碳源是葡萄糖。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述氮源以至少1.5％的初始浓度存在于所述液体培养基中。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述氮源是棉籽粉或水解酪蛋白。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述碳源是葡萄糖并且所述氮源是棉籽粉。

9.一种杀虫组合物，其包含农学上可接受的载体以及Beauveria物种或Isaria物种的耐干燥芽生孢子，其中所述载体和所述芽生孢子被包含在气密包装中，并且其中所述芽生孢子通过包含如下步骤的方法产生：

a)用Beauveria物种或Isaria物种的真菌繁殖体接种包含碳源和氮源的液体培养基；

b)在提供高于零的溶解氧水平和大于0.5MPa的渗透压的培养条件下孵育所述繁殖体；

c)将所述繁殖体孵育足够的时间以产生芽生孢子；

d)收集所述芽生孢子；以及

e)将所述芽生孢子干燥，从而产生耐干燥芽生孢子。

10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述Beauveria物种是B.bassiana。

11.根据权利要求9所述的组合物，其中所述Isaria物种是I.fumosorosea。

12.根据权利要求9所述的组合物，其还包含除氧化合物、除湿化合物或二者的组合。

13.根据权利要求9所述的组合物，其中当在储存超过6个月后再水合时，大于60％的所述芽生孢子是有活力的。

14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述组合物储存在28℃或更低的温度下。

15.一种用于昆虫防控的方法，其包括在所述昆虫的地点施用杀虫有效量的Beauveria物种或Isaria物种的耐干燥芽生孢子。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述耐干燥芽生孢子通过权利要求1所述的方法产生。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述Beauveria物种是B.bassiana。

18.根据权利要求16所述的方法，其中所述Isaria物种是I.fumosorosea。

19.根据权利要求16所述的方法，其中所述碳源是葡萄糖并且所述氮源是棉籽粉或水解酪蛋白。

20.根据权利要求15所述的方法，其中所述地点是农作物。