CN111269840B - 一种玫烟色棒束孢发酵与孢子粉制备工艺 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种玫烟色棒束孢发酵与孢子粉制备工艺，包含液体发酵过程、固体发酵过程和干燥粉碎过程三个阶段，与现有技术相比，本发明采用低值固液培养基，通过优化培养基配方与发酵工艺，使其具有产孢量大、生产周期短成本低廉、所产孢子具有一定的环境耐逆性等优点，同时采用低温干燥工艺使所制备的孢子粉具有更高的存活率与更长的贮存周期，特别适用于玫烟色棒束孢气生孢子与菌丝混合体的大规模生产。

Description

一种玫烟色棒束孢发酵与孢子粉制备工艺

技术领域

本发明涉及微生物农药领域，尤其涉及一种玫烟色棒束孢发酵与孢子粉制备工艺。

背景技术

昆虫病原真菌作为一类昆虫病原微生物，在害虫生物防治中起着非常重要的作用，其中尤以真菌农药技术的应用效果最为显著。真菌农药具有寄主范围广、药效显著、对环境安全、防治害虫不产生抗药性等优点，具有广阔的应用前景。

玫烟色棒束孢(Isaria fumosorosea)是一种重要的丝孢类昆虫病原真菌，对粉虱、蚜虫、木虱等刺吸式口器害虫具有较高致病力。国外目前已有多种玫烟色棒束孢生防制剂产品面世，约占到所有真菌农药产品的6％左右。我国目前尚未有玫烟色棒束孢商品制剂登记上市。

丝孢类虫生真菌侵染体的发酵大量生产是制备真菌生物农药的基础，虫生真菌发酵大量生产工艺主要有三种：液体发酵、固体发酵、液固双相发酵。虫生真菌主要的侵染体包括菌丝体、芽生孢子和分生孢子3种。分生孢子较菌丝体和芽生孢子对环境的抵抗力更强，因而被更多地被作为活性物应用于害虫防治。当前广泛应用的虫生真菌工业化生产工艺为液固双相发酵，即首先通过液体发酵获得大量虫生真菌的菌丝体和芽生孢子，再将其接种于固体基质上进行固体发酵，从而获得大量的分生孢子。

2.与本发明最相似的现有技术实现方案及其缺点

目前可见的玫烟色棒束孢发酵产孢方法中，一类为实验室条件下的小试级的单相发酵方法(如：“一种玫烟色棒束孢菌菌株的分离及培养方法201310392214.3”和“温室采集分离用玫烟色棒束抱分生孢子培养基及制备方法201710389324.2”)，其均不具有规模化应用前景。一类虽具备规模应用前景，但其存在发酵成本高、产孢量低、孢子耐逆性不高和发酵周期长等缺陷(如：一种玫烟色棒束孢的发酵培养方法201611096775.9)。

发明内容

本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种玫烟色棒束孢发酵与孢子粉制备工艺，其具有工艺简单、产孢量大、生产周期短成本低廉、制得的孢子具有一定的环境耐逆性和萌发率高和贮存期长等特点，是一种适合规模条件下大量培养具有规模应用前景的玫烟色棒束孢气生孢子与菌丝混合体的新方法。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的：

本发明提供的制备工艺通过以下技术方案实现：

(1)本制备工艺包含液体发酵过程、固体发酵过程和干燥粉碎过程三个阶段，其中液体发酵为生产接种液阶段，固体发酵为发酵产孢阶段，干燥粉碎为制备孢子粉阶段。

(2)液体发酵过程包括以下几个步骤：

1)初始接种液

菌种活化后接种于PDA培养基中培养7-10天产孢后用0.1％吐温80无菌水刮洗孢子并过滤制成孢子，以血球计数板调整孢子浓度至10⁷个孢子/ml，形成初始接种液。

2)液体培养基制备

取普通大米以粉碎机粉碎，过120-200目筛(优选200目筛)制成大米粉。取一定量过筛后的大米粉与去离子水混合，配制能浓度为30-50g/L(优选50g/L) 大米浆；同时在米浆中加入1％-1.5％的磷酸二氢钾(分子式：KH₂PO₄)(优选 1.2％)、0.1％-0.3％的氯化钙(分子式：CaCl₂)(优选0.2％)、0.1％-0.3％的硫酸锰(分子式：MnSO₄)(优选0.1％)。

3)液体发酵

在灭菌后的液体培养基中接入5％的初始接种液，在温度为25℃-30℃(优选30℃)下、转速为150rpm-200rpm(优选180rpm)下培养3天。

4)制备接种液

以多层啥灭菌纱布过滤产孢后的发酵液，滤除菌丝与培养基杂质，以无菌水稀释至浓度为10⁷孢子/ml，形成接种液。

(3)固体发酵阶段包括以下几个步骤：

1)固体培养基制备

取500g大米加入等量去离子水浸泡10-12小时，之后沥干水分灭菌备用，灭菌条件为121℃、30min。

配制浓度为0.1％维生素B₂溶液和1％精氨酸溶液并灭菌，在灭菌后的大米培养基中分别加入5-10质量份维生素B2溶液和5质量份精氨酸溶液，混合均匀后平铺于灭菌后的托盘中。

2)接菌与发酵产孢

使用灭菌后的喷雾器将接种液均匀喷洒在制备好的培养基上，用保鲜膜覆盖托盘，放置于25℃培养箱培养7-10天。

(4)干燥与粉碎阶段包括以下几个步骤：

产孢完成后，将培养基托盘揭去保鲜膜，置于低温气流干燥箱中干燥，干燥条件为5-15℃，直至物料水分含量≤5％(w/w)。

将干燥后的物料置于气流粉碎机粉碎，之后使用120目筛过筛制得孢子粉，以铝箔纸袋包装并真空密封。

本发明的有益效果在于：

本发明是一种玫烟色棒束孢发酵与孢子粉制备工艺，与现有技术相比，本发明采用低值固液培养基，通过优化培养基配方与发酵工艺，使其具有产孢量大、生产周期短成本低廉、所产孢子具有一定的环境耐逆性等优点，同时采用低温干燥工艺使所制备的孢子粉具有更高的存活率与更长的贮存周期，特别适用于玫烟色棒束孢气生孢子与菌丝混合体的大规模生产。

附图说明

图1是不同氨基酸对大米培养基发酵玫烟色棒束孢IF-1106产孢量的影响图；

图2是不同维生素对大米培养基发酵玫烟色棒束孢IF-1106孢子耐热性的影响图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步说明：

使用本发明工艺成本低且产孢量大，所生产的玫烟色棒束孢气生孢子具有存活率高、耐贮存和耐热性高等特点，所产孢子粉主要性能指标入下：

表1本发明主要技术指标

下面实验例用于进一步说明本发明，但不限于本发明。

试验例一、液体发酵培养基的筛选试验

以产孢量为评价指标筛选几种常见液体培养基，具体试验方法为：在250ml 三角瓶中加入50ml液体培养基(试验液体培养基见表2)，灭菌后在无菌条件下按5％的接种量接入接种液，在25℃和150rpm的摇床培养72小时后镜检孢子数。

表2试验液体培养基及其组成

表3不同液体培养基的产孢量

试验结果显示：不同的液体培养基产孢量差异较大，其中大米粉培养基的产孢量最大，且单位质量培养基产孢效率最高。

试验例二、液体发酵培养基浓度条件试验

以产孢量为评价指标筛选大米粉培养基浓度，具体试验方法为：取一定量 (按质量体积浓度计算加入量)米糊溶解于一定量水中，加热煮沸后定容至30g/L, 40g/L、50g/L(浓度＞50g/L培养基黏度太大，培养室通气条件变差)制成系列浓度的大米粉培养基，灭菌后在无菌条件下按5％的接种量接入接种液，在25℃和150rpm的摇床培养72小时后镜检孢子数。

表4不同浓度大米粉培养基的产孢量

试验结果显示：随着大米粉培养基浓度增大产孢量也在增大，当培养基浓度达到极限值50g/L时大米粉培养基具有最大的产孢量。

试验例三、液体发酵接种量条件试验

以产孢量为评价指标确定大米粉培养基发酵产孢的最佳接种量，具体试验方法为：在250ml三角瓶中加入50ml浓度为50g/L液体培养基，灭菌后在无菌条件下分别以1％，5％，10％，15％的接种量接入接种液，在25℃和150rpm 的摇床培养72小时后镜检孢子数。

表5不同接种量的大米粉培养基的产孢量

试验结果显示：不同的接种量的发酵产孢量存在差异，其中接种量为5％时，培养基产孢量最大。

试验例四、液体发酵温度条件试验

以产孢量为评价指标确定大米粉培养基发酵产孢的最佳发酵温度，具体试验方法为：在250ml三角瓶中加入50ml浓度为50g/L液体培养基，灭菌后在无菌条件下按5％的接种量接入接种液，在20℃、25℃、30℃，150rpm的摇床培养72小时后镜检孢子数。

表6大米粉培养基在不同发酵温度下的产孢量

试验结果显示：不同发酵温度下发酵产孢量存在明显差异，其中发酵温度为30℃时培养基产孢量最大。

试验例五、液体发酵转速条件试验

以产孢量为评价指标确定大米粉培养基发酵产孢的最佳摇床转速，具体试验方法为：在250ml三角瓶中加入50ml浓度为50g/L液体培养基，灭菌后在无菌条件下按5％的接种量接入接种液，在30℃条件下，分别在150rpm、180rpm 和200rpm的摇床转速下培养72小时后镜检孢子数。

表7大米粉培养基在不同摇床转速下的产孢量

试验结果显示：不同摇床转速下发酵产孢量存在明显差异，其中摇床转速为180rpm时培养基产孢量最大。

试验例六、液体发酵芽生孢子的耐逆性评价试验

以液体发酵所产芽生孢子在40℃下暴露7h后的孢子萌发率评价不同培养基条件所产孢子的耐热性，具体试验方法为：以表8所示配方配制培养基，灭菌后在无菌条件下按5％的接种量接入接种液，在25℃和150rpm转速下培养72 小时后产孢。用四层无菌纱布过滤掉菌丝，将过滤后的菌液倒入灭菌后的离心管中离心(摸索离心条件)，离心后以无菌吸管吸走上清液，得到纯孢子。取一定量的离心后的纯孢子，用含2％的葡萄糖和1％的蛋白胨的萌发液洗脱并配成孢子悬浮液，使孢子浓度达到在显微镜(10×40)下每个视场有50个孢子左右。采取凹玻片悬滴法，每一个处理3次重复，高温处理并培养24h后在显微镜下检测孢子萌发率(以孢子产生芽管为孢子存活标准)，记录视场内的萌发孢子数和总孢子数，计算孢子存活率，每次观察3个视场，计算平均值。试验结果显示：优化大米粉培养基所产孢子具有最好的耐热性

表8试验液体培养基及其组成

表9不同液体培养基所产孢子的耐热性

试验例七、固体培养基筛选试验

以产孢量为指标评价几种常见低值固体培养基，具体试验方法为：按照表 10制备培养基1-5以及大米培养基，取培养基质量5％的液体发酵所产接种液均匀喷洒与固体培养基表面，置于25℃和12:12h(L:D)光照条件下培养7-10天。产孢并干燥后粉碎过筛形成孢子粉并镜检孢子数。

表10试验低值固体培养基及其组成

表11不同固体培养基的产孢量

试验结果显示：不同的培养基产孢量差异明显，其中大米培养基的产孢量最大，且单位质量培养基的产孢效率最高。

试验例八、固体培养基氨基酸筛选试验

以产孢量为指标评价在大米培养基中加入几种不同浓度的维生素的作用，具体实验方法为：在大米培养基中加入丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)、精氨酸 (Arg)、丙谷氨酸(Phe)至每种氨基酸的浓度为0.005％、0.01％、0.05％。将配置好的含药培养基平铺于90mm培养皿中，用6mm打孔器在滤纸上打出小圆片，装在干燥的培养皿内，用报子密封后在灭菌锅进行灭菌后用镊子夹取放在培养基中心，再用1-10uL的移液枪，量取2.5uL的孢子悬浮液润湿在滤纸片上，全部接种后，倒放于25℃恒温培养箱7天直至完全产孢。用6mm无菌打孔器用五点取样法，在菌斑上取样置于灭过菌的小烧杯中，加10mL 0.1％的吐温-80 和玻璃珠打散，用玻璃棒搅拌均匀，用四层纱布过滤后，用玻璃棒沾取少量菌液，滴加在血球计数板上，用吸水纸搽去多余的菌液后在生物显微镜下计数。

图1是不同氨基酸对大米培养基发酵玫烟色棒束孢IF-1106产孢量的影响图

试验结果显示：加入一定量的甘氨酸、丙氨酸和精氨酸可有效提高大米培养基的产孢量，其中0.05％的精氨酸(Arg)对产孢量的促进作用最大，孢子数达到了1.50×10⁷个/mL。

试验例九、固体培养基维生素筛选试验

以40℃暴露7h孢子存活率为指标评价在大米培养基中加入几种不同浓度的维生素的作用，具体实验方法为：在大米培养基中加入维生素B₂(Vb₂)维生素 C(Vc)、维生素E(Ve)和复合维生素B(Vb)至每种维生素的浓度为0.005％和0.01％。将配置好的含药培养基平铺于90mm培养皿中，用6mm打孔器在滤纸上打出小圆片，装在干燥的培养皿内，用报子密封后在灭菌锅进行灭菌后用镊子夹取放在培养基中心，再用1-10uL的移液枪，量取2.5uL的孢子悬浮液润湿在滤纸片上，全部接种后，倒放于25℃恒温培养箱7天直至完全产孢。用含2％的葡萄糖和1％的蛋白胨的萌发液洗脱并配成孢子悬浮液，使孢子浓度达到在显微镜(10×40)下每个视场有50个孢子左右。采取凹玻片悬滴法，每一个处理3次重复，高温处理并培养24h后在显微镜下检测孢子萌发率(以孢子产生芽管为孢子存活标准)，记录视场内的萌发孢子数和总孢子数，计算孢子存活率，每次观察3个视场，计算平均值。

图2是不同维生素对大米培养基发酵玫烟色棒束孢IF-1106孢子耐热性的影响图；

试验结果显示：加入一定量的维生素B2和维生素E以及复合维生素B均可有效提高大米培养基所产孢子的耐热性，其中加入0.005％和0.01％维生素B₂所产孢子的耐热性最好。

实施例一

液相发酵制备接种液：

以150目大米粉与去离子水混合配制成40g/L大米浆，在米浆中加入1％的磷酸二氢钾(分子式：KH₂PO₄)、0.2％的氯化钙(分子式：CaCl₂)、0.1％的硫酸锰 (分子式：MnSO₄)。在灭菌后的液体培养基中接入5％的初始接种液，设定摇床温度28℃、转速180rpm，培养3天，过滤菌丝与残余培养基并调整孢子浓度至 10⁷孢子/ml，制得发酵接种液。

固相发酵制备孢子粉：

取500g大米加入等量去离子水浸泡10小时后沥干水分灭菌。配制浓度为 0.1％维生素B2溶液和1％精氨酸溶液并灭菌，在灭菌后的大米培养基中分别加入 5质量份维生素B₂溶液和5质量份精氨酸溶液，混合均匀后平铺于灭菌后的托盘中。使用灭菌后的喷雾器将发酵接种液均匀喷洒在制备好的培养基上，用保鲜膜覆盖托盘，放置于25℃培养箱培养7天。产孢后将培养基托盘揭去保鲜膜，置于低温气流干燥箱中干燥，干燥条件为10℃，直至物料水分含量≤5％(w/w)。将干燥后的物料置于气流粉碎机粉碎，之后使用120目筛过筛制得孢子粉。

孢子粉主要性能指标：

实施例二

液相发酵制备接种液：

以150目大米粉与去离子水混合配制成40g/L大米浆，在米浆中加入1.5％的磷酸二氢钾(分子式：KH2PO4)、0.1％的氯化钙(分子式：CaCl₂)、0.1％的硫酸锰(分子式：MnSO4)。在灭菌后的液体培养基中接入5％的初始接种液，设定摇床温度25℃、转速150rpm下培养3天，过滤菌丝与培养基并调整浓度至10⁷孢子/ml，制得发酵接种液。

固相发酵制备孢子粉：

取500g大米加入等量去离子水浸泡10小时后沥干水分灭菌。配制浓度为 0.1％维生素B2溶液和1％精氨酸溶液并灭菌，在灭菌后的大米培养基中分别加入 10质量份维生素B₂溶液和5质量份精氨酸溶液，混合均匀后平铺于灭菌后的托盘中。使用灭菌后的喷雾器将发酵接种液均匀喷洒在制备好的培养基上，用保鲜膜覆盖托盘，放置于25℃培养箱培养8天。产孢后将培养基托盘揭去保鲜膜，置于低温气流干燥箱中干燥，干燥条件为5℃，直至物料水分含量≤5％(w/w)。将干燥后的物料置于气流粉碎机粉碎，之后使用120目筛过筛制得孢子粉。

孢子粉主要性能指标：

实施例三

液相发酵制备接种液：

以200目大米粉与去离子水混合配制成50g/L大米浆，在米浆中加入1.2％的磷酸二氢钾(分子式：KH2PO4)、0.2％的氯化钙(分子式：CaCl₂)、0.3％的硫酸锰(分子式：MnSO4)。在灭菌后的液体培养基中接入5％的初始接种液，设定摇床温度30℃、转速180rpm下培养3天。过滤菌丝与培养基并调整浓度至10⁷孢子/ml，制得发酵接种液。

固相发酵制备孢子粉：

取500g大米加入等量去离子水浸泡12小时后沥干水分灭菌。配制浓度为 0.1％维生素B2溶液和1％精氨酸溶液并灭菌，在灭菌后的大米培养基中分别加入 5质量份维生素B₂溶液和5质量份精氨酸溶液，混合均匀后平铺于灭菌后的托盘中。使用灭菌后的喷雾器将发酵接种液均匀喷洒在制备好的培养基上，用保鲜膜覆盖托盘，放置于25℃培养箱培养7天。产孢后将培养基托盘揭去保鲜膜，置于低温气流干燥箱中干燥，干燥条件为15℃，直至物料水分含量≤5％(w/w)。将干燥后的物料置于气流粉碎机粉碎，之后使用120目筛过筛制得孢子粉。

孢子粉主要性能指标：

实施例四

液相发酵制备接种液：

以180目大米粉与去离子水混合配制成50g/L大米浆，在米浆中加入1.5％的磷酸二氢钾(分子式：KH2PO4)、0.3％的氯化钙(分子式：CaCl₂)、0.2％的硫酸锰(分子式：MnSO4)。在灭菌后的液体培养基中接入5％的初始接种液，设定摇床温度30℃、转速200rpm下培养3天。过滤菌丝与培养基并调整浓度至10⁷孢子/ml，制得发酵接种液。

固相发酵制备孢子粉：

取500g大米加入等量去离子水浸泡10小时后沥干水分灭菌。配制浓度为 0.1％维生素B2溶液和1％精氨酸溶液并灭菌，在灭菌后的大米培养基中分别加入 8质量份维生素B₂溶液和5质量份精氨酸溶液，混合均匀后平铺于灭菌后的托盘中。使用灭菌后的喷雾器将发酵接种液均匀喷洒在制备好的培养基上，用保鲜膜覆盖托盘，放置于25℃培养箱培养8天。产孢后将培养基托盘揭去保鲜膜，置于低温气流干燥箱中干燥，干燥条件为15℃，直至物料水分含量≤5％(w/w)。将干燥后的物料置于气流粉碎机粉碎，之后使用120目筛过筛制得孢子粉。

孢子粉主要性能指标：

实施例五

液相发酵制备接种液：

以200目大米粉与去离子水混合配制成50g/L大米浆，在米浆中加入1.2％的磷酸二氢钾(分子式：KH2PO4)、0.2％的氯化钙(分子式：CaCl₂)、0.1％的硫酸锰(分子式：MnSO4)。在灭菌后的液体培养基中接入5％的初始接种液，设定摇床温度30℃、转速200rpm下培养3天。过滤菌丝与培养基并调整浓度至10⁷孢子/ml，制得发酵接种液。

固相发酵制备孢子粉：

取500g大米加入等量去离子水浸泡10小时后沥干水分灭菌。配制浓度为 0.1％维生素B₂溶液和1％精氨酸溶液并灭菌，在灭菌后的大米培养基中分别加入 5质量份维生素B₂溶液和5质量份精氨酸溶液，混合均匀后平铺于灭菌后的托盘中。使用灭菌后的喷雾器将发酵接种液均匀喷洒在制备好的培养基上，用保鲜膜覆盖托盘，放置于25℃培养箱培养7天。产孢后将培养基托盘揭去保鲜膜，置于低温气流干燥箱中干燥，干燥条件为5℃，直至物料水分含量≤5％(w/w)。将干燥后的物料置于气流粉碎机粉碎，之后使用120目筛过筛制得孢子粉。

孢子粉主要性能指标：

本发明工艺成本低且产孢量大，所生产的玫烟色棒束孢气生孢子具有存活率高、耐贮存和耐热性高等特点，其所生产的孢子粉是以气生孢子为主并混有少量菌丝的孢子菌丝合物。该工艺具有产孢量大且所产孢子具有一定的耐逆性等特点，可作为防治温室刺吸式口器害虫(如烟粉虱、蚜虫、螨类等)真菌杀虫剂的活性物。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (3)

1.一种玫烟色棒束孢(Isaria fumosorosea)发酵与孢子粉制备工艺，其特征在于：

(1)包含液体发酵过程、固体发酵过程和干燥粉碎过程三个阶段，其中液体发酵为生产接种液阶段，固体发酵为发酵产孢阶段，干燥粉碎为制备孢子粉阶段；

(2)液体发酵过程包括以下几个步骤：

1)初始接种液：

菌种活化后接种于PDA培养基中培养7-10天产孢后用0.1％吐温80无菌水刮洗孢子并过滤制成孢子，以血球计数板调整孢子浓度至10⁷个孢子/ml，形成初始接种液；

2)液体培养基制备：

取普通大米以粉碎机粉碎，过120-200目筛制成大米粉；取一定量过筛后的大米粉与去离子水混合，配制浓度为30-50g/L大米浆；同时在米浆中加入1％-1.5％的磷酸二氢钾、0.1％-0.3％的氯化钙、0.1％-0.3％的硫酸锰；

3)液体发酵：

在灭菌后的液体培养基中接入5％的初始接种液，在温度为25℃-30℃下、转速为150rpm-200rpm下培养3天；

4)制备接种液：

以多层灭菌纱布过滤产孢后的发酵液，滤除菌丝与培养基杂质，以无菌水稀释至浓度为10⁷孢子/ml，形成接种液；

(3)固体发酵阶段包括以下几个步骤：

1)固体培养基制备：

取500g大米加入等量去离子水浸泡10-12小时，之后沥干水分灭菌备用，灭菌条件为121℃、30min；

配制浓度为0.1％维生素B₂溶液和1％精氨酸溶液并灭菌，在灭菌后的大米培养基中分别加入5-10重量份维生素B2溶液和5重量份精氨酸溶液，混合均匀后平铺于灭菌后的托盘中；

2)接菌与发酵产孢：

使用灭菌后的喷雾器将接种液均匀喷洒在制备好的培养基上，用保鲜膜覆盖托盘，放置于25℃培养箱培养7-10天；

(4)干燥与粉碎阶段包括以下几个步骤：

产孢完成后，将培养基托盘揭去保鲜膜，置于低温气流干燥箱中干燥，干燥条件为5-15℃，直至物料水分含量≤5％；

将干燥后的物料置于气流粉碎机粉碎，之后使用120目筛过筛制得孢子粉，以铝箔纸袋包装并真空密封。

2.根据权利要求1所述的玫烟色棒束孢发酵与孢子粉制备工艺，其特征在于：所述液体培养基制备步骤中普通大米以粉碎机粉碎，过200目筛；大米粉与去离子水混合，配制浓度为50g/L大米浆；米浆中加入1.2％的磷酸二氢钾；0.2％的氯化钙、0.1％的硫酸锰。

3.根据权利要求1所述的玫烟色棒束孢发酵与孢子粉制备工艺，其特征在于：所述液体发酵步骤中温度为30℃、转速为180rpm。

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